人参皂苷Rc在制备治疗酒精性脂肪肝的药物中的应用

人参皂苷rc在制备治疗酒精性脂肪肝的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及人参皂苷rc在制备治疗酒精性脂肪肝的药物中的应用。


背景技术：

2.随着当今社会的发展，饮酒成为人际应酬中十分常见的行为，然而长期大量饮酒可能会导致肝脏细胞中线粒体的功能发生异常，使得活性氧过度累积，引发氧化应激反应，还可能会导致体内生物酶的活性发生改变，造成肝脏损伤的同时使肝细胞脂肪发生变性等，若不及时进行干预治疗，有可能发展成为酒精性脂肪肝(afld)，临床症状为非特异性，可无症状，或有右上腹胀痛、食欲不振、乏力、体重减轻等。
3.目前临床上对酒精性脂肪肝的治疗通常以解酒、合理饮食为主，辅以他汀类药物，以及还原型谷胱甘肽、维生素e等抗氧化药物，然而，现代医学在酒精性脂肪肝发病机制方面的研究尚未取得突破性进展，该西药治疗方案也尚不能很好地达到缓解酒精导致的肝脏损伤及快速代谢掉体内酒精的作用，还常伴有皮疹等过敏症状，以及食欲不振、恶心等消化道症状。基于中医药具有资源丰富、毒副作用小、无耐药性、不易残留等优势，研究者们逐渐将对afld治疗的相关研究转移到中医药上，以求寻找到与其发病机制相吻合、疗效确切、作用机制清楚的中药单方，为中医药防治afld提供新的理论基础和临床指导。
4.人参皂苷rc作为人参的主要活性成分，在抗炎、抗氧化等方面疗效显著，还有现有技术公开了人参皂苷rc在治疗肝纤维化相关疾病中的应用，然而，肝纤维化是由各种致病因子所致的肝内结缔组织异常增生，酒精性脂肪肝是长期大量饮酒导致的肝脏脂肪浸润，可见，两者发病机理存在本质的不同，能用于治疗肝纤维化相关疾病的药物并不一定能治疗酒精性脂肪肝。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足，旨在提供人参皂苷rc在制备治疗酒精性脂肪肝的药物中的应用，为治疗酒精性脂肪肝的药物提供了一种新的材料来源。
6.本发明的另一目的是提供一种治疗酒精性脂肪肝的药物。
7.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
8.本发明研究表明人参皂苷rc具有以下功能：(1)通过抑制ast和/或alt含量的升高以保护肝脏功能，还能抑制肝细胞凋亡、恢复肝脏形态，从而抑制肝脏的损伤；(2)通过抑制过氧化物的累积以抑制氧化应激反应；(3)通过抑制炎症因子tnf-α、il-6、nfκb-p65的表达以抑制炎症反应；(4)抑制脂质累积。以上均表明人参皂苷rc可有效治疗酒精性脂肪肝，为治疗酒精性脂肪肝的药物提供了一种新的材料来源。因此，人参皂苷rc在制备治疗酒精性脂肪肝的药物中的应用应在本发明的保护范围内。
9.优选地，所述治疗酒精性脂肪肝包括抑制肝脏损伤、抑制脂质累积、抑制氧化应激反应、抑制炎症反应中的一种或几种。
10.长期大量饮酒产生的乙醇及其代谢产物乙醇对肝组织有强烈的毒性损害，会影响脂肪酸的正常氧化，其炎症反应还会导致外周血中脂肪酸升高，进一步导致了肝脏细胞中脂质的累积，因此，人参皂苷rc通过抑制脂质累积，可有效治疗酒精性脂肪肝。
11.进一步优选地，所述抑制肝脏损伤包括保护肝脏功能、抑制肝细胞凋亡、恢复肝脏形态中的一种或几种。
12.更优选地，所述保护肝脏功能包括抑制谷草转氨酶(ast)和/或谷丙转氨酶(alt)含量的升高。在大量饮酒后，肝脏组织中ast和alt含量的升高会影响肝脏的正常功能。
13.优选地，所述抑制氧化应激反应包括抑制过氧化物的累积。
14.优选地，所述抑制炎症反应包括抑制炎症因子的表达。
15.进一步优选地，所述炎症因子包括tnf-α、il-6、nfκb-p65中的一种或几种。
16.优选地，所述酒精性脂肪肝包括急性酒精性脂肪肝和/或慢性酒精性脂肪肝。
17.本发明研究表明人参皂苷rc具有以下功能：(1)通过抑制ast和/或alt含量的升高以保护肝脏功能，还能抑制肝细胞凋亡、恢复肝脏形态，从而抑制肝脏的损伤；(2)通过抑制过氧化物的累积以抑制氧化应激反应；(3)通过抑制炎症因子tnf-α、il-6、nfκb-p65的表达以抑制炎症反应；(4)抑制脂质累积。以上均表明人参皂苷rc可有效治疗酒精性脂肪肝，为治疗酒精性脂肪肝的药物提供了一种新的材料来源，因此，本发明还提供了一种治疗酒精性脂肪肝的药物，所述药物以人参皂苷rc为活性成分，还可包括药学上可接受的载体或赋形剂，制成不同的剂型，如注射剂、口服液、粉针剂、水针剂、汤剂或缓控释制剂等。
18.本发明具有以下有益效果：
19.本发明研究表明人参皂苷rc可有效抑制肝脏损伤、抑制脂质累积、抑制氧化应激反应、抑制炎症反应，进而有效治疗急性/慢性酒精性脂肪肝，为治疗酒精性脂肪肝的药物提供了一种新的材料来源。
附图说明
20.图1a为实施例1肝脏细胞的od450值统计图；图1b为实施例1肝脏细胞中ast的含量统计图；图1c为实施例1肝脏细胞中alt的含量统计图；图1d为实施例1肝脏细胞中过氧化物的累积情况；图1e为实施例1肝脏细胞中nfκb-p65的表达情况；图1f为实施例1肝脏细胞中脂质的累积情况。
21.图2a为实施例2血清中ast的含量统计图；图2b为实施例2血清中alt的含量统计图。
22.图3a为实施例3血清中ast的含量统计图；图3b为实施例3血清中alt的含量统计图；图3c为实施例3切片he染色结果；图3d为实施例3肝脏组织中tnf-α的表达量统计图；图3e为实施例3肝脏组织中il-6的表达量统计图；图3f为实施例3肝脏中过氧化物的累积情况；图3g为实施例3肝脏的油红染色结果。
具体实施方式
23.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
24.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
25.1640完全培养基：500mlrpmi-1640基础培养基混合50ml的10％胎牛血清和5ml双抗。
26.c57bl/6j小鼠：6～8周雄性c57bl/6j小鼠，来源于广州中医药大学实验动物中心。
27.人参皂苷rc：纯度≥98％，购自上海源叶生物科技有限公司。
28.实施例1人参皂苷rc对酒精性脂肪肝的作用
29.一、人参皂苷rc可有效抑制酒精性脂肪肝中肝脏细胞的凋亡
30.(1)实验方法
31.从c57bl/6j小鼠中分离出原代肝脏细胞，分成六组：空白组(pbs+dmso组)在含有100mmpbs的1640完全培养基中加入1μl/ml dmso进行造模；对照组(etoh+dmso组)在含有100mm酒精的1640完全培养基中加入1μl/ml dmso进行造模；实验a组(etoh+rc(12.5μm)组)在含有100mm酒精的1640完全培养基中加入1μl/ml 12.5mm人参皂苷rc进行造模；实验b组(etoh+rc(25μm)组)在含有100mm酒精的1640完全培养基中加入1μl/ml25mm人参皂苷rc进行造模；实验c组(etoh+rc(50μm)组)在含有100mm酒精的1640完全培养基中加入1μl/ml 50mm人参皂苷rc进行造模；实验d组(etoh+rc(100μm)组)在含有100mm酒精的1640完全培养基中加入1μl/ml100mm人参皂苷rc进行造模。六组均连续造模24小时后收集细胞进行实验。
32.(2)实验结果
33.造模结束后，用cck-8试剂盒分别测定六组实验肝脏细胞的od450值，结果如图1a所示，可见，对照组肝脏细胞的od450值显著低于空白组，实验a～d组肝脏细胞的od450值显著高于对照组，且实验c组差别最显著，说明人参皂苷rc很好地缓解了酒精对肝脏细胞的毒性作用，可有效抑制酒精培养导致的细胞凋亡，进而有效抑制肝脏的损伤。
34.二、人参皂苷rc可有效治疗酒精性脂肪肝
35.(1)实验方法
36.从c57bl/6j小鼠中分离出原代肝脏细胞，分成六组：空白组(pbs+dmso组)在含有100mmpbs的1640完全培养基中加入1μl/ml dmso进行造模；对照a组(pbs+rc(h)组)在含有100mmpbs的1640完全培养基中加入1μl/ml50mm人参皂苷rc进行造模；对照b组(etoh+dmso组)在含有100mm酒精的1640完全培养基中加入1μl/ml dmso进行造模；实验a组(etoh+rc(l)组)在含有100mm酒精的1640完全培养基中加入1μl/ml 12.5mm人参皂苷rc进行造模；实验b组(etoh+rc(m)组)在含有100mm酒精的1640完全培养基中加入1μl/ml 25mm人参皂苷rc进行造模；实验c组(etoh+rc(h)组)在含有100mm酒精的1640完全培养基中加入1μl/ml 50mm人参皂苷rc进行造模。六组均连续造模24小时后收集细胞进行实验。
37.(2)实验结果
38.①
ast、alt含量
39.造模结束后，用天门冬氨酸氨基转移酶测试盒和丙氨酸氨基转移测试盒(微板法)分别测定六组肝脏细胞中ast、alt的含量，结果如图1b、1c所示，其中，图1b为六组肝脏细胞中ast的含量统计图，图1c为六组肝脏细胞中alt的含量统计图。可见，对照b组肝脏细胞中ast、alt的含量显著高于空白组，实验a～c组肝脏细胞中ast、alt的含量显著低于对照b组，且实验c组差别最显著，说明人参皂苷rc很好地抑制了ast和alt含量的升高，对肝脏功能起到了有效的保护作用，可有效抑制肝脏的损伤。
40.②
过氧化物的累积
41.造模结束后，用ros探针分别检测六组肝脏细胞中过氧化物的累积情况，结果如图1d所示。可见，对照b组肝脏细胞中过氧化物的含量显著高于空白组，实验a～c组肝脏细胞中过氧化物的含量显著低于对照b组，且实验c组差别最显著，说明人参皂苷rc很好地抑制了过氧化物的累积，可有效抑制氧化应激反应。
42.③
nfκb-p65的表达
43.造模结束后，采用免疫荧光法分别检测空白组(pbs+dmso组)、对照b组(etoh+dmso组)、实验c组(etoh+rc(h)组)肝脏细胞中炎症因子nfκb-p65的表达量，结果如图1e所示。可见，对照b组肝脏细胞中nfκb-p65的表达量显著高于空白组，实验c组肝脏细胞中nfκb-p65的表达量显著低于对照b组，说明人参皂苷rc很好地抑制了炎症因子nfκb-p65的表达，可有效抑制炎症反应。
44.④
脂质累积
45.造模结束后，运用脂质探针技术分别检测空白组(pbs+dmso组)、对照b组(etoh+dmso组)、实验c组(etoh+rc(h)组)肝脏细胞中中性脂质微滴的累积量，结果如图1f所示。可见，对照b组肝脏细胞中的脂质累积量显著高于空白组，实验c组肝脏细胞中的脂质累积量显著低于对照b组，说明人参皂苷rc很好地抑制了肝脏细胞中脂质的累积，可有效治疗酒精性脂肪肝。
46.实施例2人参皂苷rc对急性酒精性脂肪肝的作用
47.一、实验方法
48.将42只c57bl/6j小鼠分成六组：空白组(ctr+saline组)每只小鼠腹腔注射体重十倍体积的生理盐水；对照a组(ctr+rc(h)组)每只小鼠以体重十倍的体积腹腔注射2mg/ml人参皂苷rc；对照b组(etoh+saline组)每只小鼠腹腔注射体重十倍体积的生理盐水；实验a组(etoh+rc(l)组)每只小鼠以体重十倍的体积腹腔注射0.5mg/ml人参皂苷rc；实验b组(etoh+rc(m)组)每只小鼠以体重十倍的体积腹腔注射1mg/ml人参皂苷rc；实验c组(etoh+rc(h)组)每只小鼠以体重十倍的体积腹腔注射2mg/ml人参皂苷rc。
49.连续注射7天，每天1次，最后一次注射结束再使小鼠连续饥饿9小时后，空白组、对照a组分别以体重4.45倍的体积灌胃45％wt/vol麦芽糊精，对照b组、实验a～c组分别灌胃混有以体重的5.55倍体积灌胃31.5％vol/vol酒精，以确保六组小鼠获得相同的热量。六组灌胃6小时后，小鼠麻醉处死取血清。(其中，对照b组、实验a～c组为急性酒精性脂肪肝的疾病模型。)
50.二、实验结果
51.用天门冬氨酸氨基转移酶测试盒和丙氨酸氨基转移测试盒(微板法)测定六组血清中ast、alt的含量，结果如图2a、2b所示，其中，图2a为六组血清中ast的含量统计图，图2b为六组血清中alt的含量统计图。可见，对照b组血清中ast、alt的含量显著高于空白组，实验a～c组血清中ast、alt的含量显著低于对照b组，且实验c组差别最显著，说明人参皂苷rc很好地抑制了ast和alt含量的升高，对肝脏功能起到了有效的保护作用，可有效抑制肝脏的损伤，从而有效治疗急性酒精性脂肪肝。
52.实施例3人参皂苷rc对慢性酒精性脂肪肝的作用
53.一、实验方法
54.将42只c57bl/6j小鼠分成六组：空白组(ctr+saline组)、对照a组(ctr+rc(h)组)、对照b组(etoh+saline组)、实验a组(etoh+rc(l)组)、实验b组(etoh+rc(m)组)、实验c组(etoh+rc(h)组)。
55.为构建慢性酒精性脂肪肝的疾病模型，首先六组小鼠适应性自由喂养对照流质饲料1天；第2～5天对照b组、实验a～c组小鼠喂养含有1％～5％(vol/vol)乙醇的流质饲料，空白组和对照a组继续喂养对照流质饲料；第6～9天，对照b组、实验a～c组的小鼠喂养含5％(vol/vol)乙醇的流质饲料，空白组和对照a组继续喂养对照流质饲料；第10～16天，对照a组、实验a～c组小鼠分别腹腔注射10ul/g人参皂甙rc(2mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml)，空白组和对照b组小鼠分别腹腔注射体重十倍体积的生理盐水，每天一次；第17天，对照b组、实验a～c组小鼠分别以体重5.55倍体积灌胃31.5％vol/vol酒精，对照组以体重4.45倍体积灌胃等热量糊精麦芽糖(45％，wt/vol)。6小时后，小鼠麻醉处死取血清和肝脏组织。(其中，对照b组、实验a～c组为慢性酒精性脂肪肝的疾病模型。)
56.二、实验结果
57.①
ast、alt含量
58.用天门冬氨酸氨基转移酶测试盒和丙氨酸氨基转移测试盒(微板法)测定六组血清中ast、alt的含量，结果如图3a、3b所示，其中，图3a为六组血清中ast的含量统计图，图3b为六组血清中alt的含量统计图。可见，对照b组血清中ast、alt的含量显著高于空白组；虽然实验a组血清中ast的含量高于对照组b，但并无统计学差异；实验b、c组血清中ast、alt的含量显著低于对照b组，且实验c组差别最显著，说明人参皂苷rc很好地抑制了ast和alt含量的升高，对肝脏功能起到了有效的保护作用，可有效抑制肝脏的损伤，从而有效治疗慢性酒精性脂肪肝。
59.②
肝脏形态
60.将六组肝脏组织分别制作成切片，并进行he染色，染色结果如图3c所示，可见，对照b组肝脏组织的形态明显被破坏，而实验a～c组肝脏组织的形态明显恢复。说明人参皂苷rc可通过恢复肝脏形态以抑制肝脏的损伤，从而有效治疗慢性酒精性脂肪肝。
61.③
tnf-α、il-6的表达
62.采用免疫荧光法检测空白组、对照b组、实验c组肝脏组织中炎症因子tnf-α、il-6的表达量，结果如图3d、3e所示，其中，图3d为肝脏组织中tnf-α的表达量统计图，图3e为肝脏组织中il-6的表达量统计图。可见，对照b组肝脏组织中tnf-α、il-6的表达量显著高于空白组，实验c组肝脏组织中tnf-α、il-6的表达量显著低于对照b组，说明人参皂苷rc很好地抑制了炎症因子tnf-α、il-6的表达，可有效抑制炎症反应，进而有效治疗慢性酒精性脂肪肝。
63.④
过氧化物的累积
64.将ros探针分别通过尾静脉注射到空白组、对照b组、实验c组小鼠中，40分钟后，麻醉并处死小鼠，取肝脏，并于动物成像仪下观测肝脏中ros水平，结果如图3f所示。可见，对照b组肝脏中过氧化物含量显著高于空白组，实验c组肝脏中过氧化物含量显著低于对照b组，说明人参皂苷rc很好地抑制了过氧化物的累积，有效抑制了氧化应激反应，进而可有效治疗慢性酒精性脂肪肝。
65.⑤
脂质累积
66.对六组肝脏进行油红染色以检测组织中所有脂类的累计情况，结果如图3g所示。可见，对照b组肝脏中的脂质累积量显著高于空白组，实验a～c组肝脏中的脂质累积量显著低于对照b组，且实验c组差别最显著，说明人参皂苷rc可有效抑制肝脏细胞中脂质的累积，进而有效治疗慢性酒精性脂肪肝。
67.综上所述，本发明研究表明人参皂苷rc可有效抑制肝脏损伤、抑制脂质累积、抑制氧化应激反应、抑制炎症反应，进而有效治疗急性/慢性酒精性脂肪肝，为治疗酒精性脂肪肝的药物提供了一种新的材料来源。
68.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。