蝰蛇蛇毒血凝酶在制备用于逆转凝血因子Xa抑制剂的抗凝作用的药物中的应用的制作方法

蝰蛇蛇毒血凝酶在制备用于逆转凝血因子xa抑制剂的抗凝作用的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于药物领域，特别涉及蝰蛇蛇毒血凝酶在制备用于逆转凝血因子xa抑制剂的抗凝作用的药物中的应用。


背景技术：

2.凝血因子xa(factor xa，fxa)是抗凝级联反应中的关键调节子，可促进血栓形成。近年来fxa抑制剂已经成为抗凝药物研发的热点，用于防治各种急、慢性血栓栓塞性疾病。沙班类药物是直接、高度选择性和竞争性的xa因子抑制剂、可抑制有利和纤维蛋白结合的xa因子活性以及凝血酶原活性，从而在内、外源性凝血途径的交汇点干扰凝血级联反应，包括利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班。肝素在体内和体外均具有较好的抗凝血作用，可抑制凝血因子xⅱa，xⅰa，ⅰxa，xa和ⅱa的活性。低分子肝素比如依诺肝素，由于分子量小，与抗血凝酶ⅲ(atⅲ)形成复合物后，与xa结合选择性高，因而选择性抑制xa活性，而对ⅱa及其他凝血因子作用较弱。直接口服抗凝剂(doac)(包括阿哌沙班、利伐沙班、艾多沙班、贝曲沙班和达比加群)具有半衰期短、与其他药物相互作用少、与食物无相互作用、无需进行常规检测等优点，虽然总体的出血风险较低，但发生颅内出血后的危害极大。对于该类药物目前尚无特异性拮抗剂，一旦服用此类药物过多或在正常服用过程中发生出血件。如何逆转其抗凝作用，一直是关注的焦点。
3.2018年4月，fda批准了idarucizumab(人源性抗体片段)用于逆转达比加群在严重出血或需进行紧急手术的患者中的抗凝作用。andexanet alfa是一种重组修饰的人因子xa诱饵蛋白，可结合并隔离利伐沙班和阿哌沙班，也能结合并抑制组织因子途径的抑制物，临床试验显示，andexanet alfa可以使服用阿哌沙班和利伐沙班患者的抗xa因子活性分别下降94％和92％。在2-5min内，100％的患者凝血酶活性生成，andexanet alfa已被批准用于因危及生命或无法控制的出血而需要进行逆转抗凝作用的阿哌沙班或利伐沙班服用者。当andexanet alfa无法获得时，《2020acc专家共识：口服抗凝药患者出血管理的决策路径》建议给予凝血酶原复合物或活化的凝血酶原复合物进行逆转。不建议进行andexanet alfa的标签外应用，以逆转艾多沙班和贝曲沙班的抗凝作用。但是andexanet alfa价格昂贵，且国内尚未上市。因此寻求新型逆转剂就比较急需。
4.蛇毒血凝酶中含有活性成分为血凝酶-一类凝血酶(巴曲酶)和磷脂依赖性凝血因子x激活剂(fxa)，具有止血作用，常用于制备止血药。然而，有研究表明，白眉蛇毒血凝酶对凝血因子xa抑制剂利伐沙班所致的出血时间、出血量和血浆pt的增加无明显影响(孙双勇等，利伐沙班及其拮抗剂对大鼠出血模型的影响，现代药物与临床，2014)。因此不适用于利伐沙班临床上导致的出血症状。该文献的研究结果表明白眉蛇毒凝血酶仍为无法实现凝血因子xa抑制剂抗凝作用逆转。
5.因此，仍亟需开发一种逆转凝血因子xa抑制剂的抗凝作用的药物。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种蝰蛇蛇毒血凝酶在制备用于逆转凝血因子xa抑制剂的抗凝作用的药物中的应用，通过研究速乐涓(商品名，一种蝰蛇蛇毒血凝酶)作为止血旁路剂逆转fxa抑制剂抗凝作用的能力，确证速乐涓逆转目前临床上使用的凝血因子xa抑制剂抗凝作用的治疗潜力，为fxa抑制剂引起的出血提供一种新的治疗手段。本发明人通过体外血栓弹性描记法(teg)的研究却发现，速乐涓能够剂量依赖性地逆转fxa抑制剂的抗凝作用，并完全恢复人血中的血栓形成。因此速乐涓是对凝血因子xa抑制剂所致出血副作用的一种新的治疗手段，相比白眉蛇毒血凝酶产生了意想不到的效果。本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题。
7.本发明提供了一种蝰蛇蛇毒血凝酶在制备用于逆转凝血因子xa抑制剂的抗凝作用的药物中的应用。
8.优选的，所述蝰蛇蛇毒血凝酶为从蝰蛇蛇毒中提取，包括磷脂依赖性凝血因子x激活剂和巴曲酶。
9.优选的，所述蝰蛇蛇毒血凝酶为速乐涓。
10.优选的，所述凝血因子xa抑制剂为利伐沙班。
11.优选的，所述药物包括治疗有效量的蝰蛇蛇毒血凝酶。
12.与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：
13.速乐涓是一种从蝰蛇蛇毒中提取的组合物，含有的活性成分为血凝酶—一类凝血酶(巴曲酶)和磷脂依赖性凝血因子x激活剂(fxa)具有促凝血与止血功能的蛇毒血凝酶制剂，通过体外血栓弹性描记法(teg)的研究发现，能够剂量依赖性地逆转fxa抑制剂的抗凝作用，并完全恢复人血中的血栓形成。相比于白眉蛇毒血凝酶，速乐涓可有效逆转凝血因子xa的拮抗作用，推测速乐涓可在临床用于凝血因子xa拮抗剂引起的出血反应。
14.速乐涓体外结果显示，不但对沙班类(利伐沙班，阿哌沙班)具有逆转作用，对伊诺肝素引起的出血同样具有逆转作用。
附图说明
15.图1为teg上健康献血者血液的代表性追踪；
16.图2为利伐沙班滴定在teg上的代表性迹线及r-time和ma的代表性柱状图；
17.图3为代表性的teg轨迹图和条形图，显示3个剂量速乐涓对利伐沙班完全抑制剂量的影响；
18.图4为teg上阿哌沙班滴定的代表性痕迹以及r-time和ma的代表性条形图；
19.图5为代表性的teg示踪图和条形图显示了3个剂量的速乐涓对完全抑制剂量的阿哌沙班的影响；
20.图6为依诺肝素滴定在teg上的代表型痕迹图及r-time和ma的代表柱状图；
21.图7为代表性的teg轨迹图和条形图，显示了3个剂量速乐涓对完全抑制剂量依诺肝素的影响。
具体实施方式
22.蝰蛇蛇毒血凝酶在制备用于逆转凝血因子xa抑制剂的抗凝作用的药物中的应用。
23.蛇毒血凝酶中含有活性成分为血凝酶-一类凝血酶(巴曲酶)和磷脂依赖性凝血因子x激活剂(fxa)。类凝血酶能使纤维蛋白原上的arg16-gly17处降解成纤维蛋白1单体(fim)，进而交联聚合成蛋白ⅰ多聚体(fip),后者能促进出血部位血小板聚集，加速出血部位血栓形成和初期止血效应，还可间接地促进出血部位凝血酶的形成，再出血部位的血小板黏附、聚集和释放，暴露血小板磷脂反应表面的条件下，fxa能将浓集于磷脂反应表面的凝血因子x激活成xa，后者与钙离子、凝血因子
ⅴ
a及血小板磷脂形成复合物——凝血酶原激活物，促进血管破损处的凝血酶形成，从而促进了类凝血酶止血效应，二者共同参与止血过程。类凝血酶(巴曲酶)属丝氨酸蛋白酶类单链糖蛋白，是以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶，能高选择性的作用于血纤蛋白原，但对血纤蛋白原的作用比凝血酶更为专一。蛇毒类巴曲酶与凝血酶相似的一些药理作用，即它们具有精氨酸酯酶活性直接水解纤维蛋白原α链或β链，释放血纤肽a(fpa)或血纤肽b(fpb)。然而不同于凝血酶，其凝血活性不受肝素干扰并且它们使得纤维蛋白单体首尾聚合而不发生侧链交联，因而由此形成的血凝块对纤溶酶十分敏感而易被网状内皮系统或正常的纤溶系统所清除或降解，从而表现出止血或降纤、抗凝两种作用。凝脂依赖性凝血因子x激活剂，即x因子激活剂，简称fxa。它是一种金属蛋白酶，包括一个含有活性中心的重链和两个与c型凝集素有着同源性的轻链，并且认为它对钙依赖性凝血因子x激活物的活性起着调控作用。本发明中，所述蝰蛇蛇毒血凝酶为从蝰蛇蛇毒中提取的蝰蛇蛇毒血凝酶，包括磷脂依赖性凝血因子x激活剂和巴曲酶。在本发明的一个具体实施方式中，所述蝰蛇蛇毒血凝酶选自速乐涓(蛇毒血凝酶注射液)，其主要活性成分由磷脂依赖性凝血因子x激活剂和一类凝血酶(巴曲酶)组成。
24.凝血因子xa直接抑制剂是最具有前景药物之一，与其他药物相互作用少、与食物无相互作用、无需进行常规检测等优点，虽然总体的出血风险较低，但发生颅内出血后的危害极大，如何逆转其抗凝作用，一直是关注的焦点。本发明为fxa抑制剂引起的出血提供一种新的治疗手段，目前fxa抑制剂种类繁多，本发明对具体fxa抑制剂种类不做限定，其中，在本发明的具体实施方式中，fxa抑制剂选自利伐沙班、阿哌沙班或依诺肝素。
25.本发明逆转凝血因子xa抑制剂的抗凝作用的药物中含有治疗有效量的蝰蛇蛇毒血凝酶，其给药剂量依照所要治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，可以有大范围的变化。本发明蝰蛇蛇毒血凝酶药物选自速乐涓，使用血栓弹性成像技术(teg)，在使用凝血因子xa抑制剂治疗的人血液中，通过速乐涓逆转凝血和恢复血栓形成，其中速乐涓的作用浓度优选为0.014-0.077u/ml。
26.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
27.实施例1速乐涓对fxa抑制剂抗凝作用的逆转作用
28.一、试验材料
29.药物：
30.速乐涓(slounase)：蛇毒血凝酶注射液(cde已经确名)，1u/ml*10瓶，2021年6月10日由香港李氏大药厂提供。
31.利伐沙班：20毫克，片剂，来自密歇根州医学b2药房，由杨森制药有限公司生产，批号，20mg441。
32.阿哌沙班：5mg片剂从密歇根州医学b2药房获得，由百时美施贵宝公司/辉瑞公司生产，批号：abu1445s。
33.依诺肝素：30毫克注射器，从密歇根州医学b2药房获得，由amphastar pharmaceuticals，inc.生产，批号：e0066lo。
34.试剂制备：
35.利伐沙班(rivaroxaban)：溶于1:1dmso：h2o中，在血液中稀释至100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml和7ug/ml的最终浓度。根据患者的血液浓度和高剂量选择剂量，以通过血栓弹性成像完全抑制血栓形成。
36.阿哌沙班(apixaban)：溶于1:1dmso:h2o中，并稀释至血液中的最终浓度为250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml和7ug/ml。根据患者的血液浓度和高剂量选择剂量，以通过血栓弹性成像完全抑制血栓形成。
37.依诺肝素(levebox)：溶解于盐水中，在血液中稀释至最终浓度，分别为1ug/ml、1.75ug/ml、2.5ug/ml和5ug/ml。根据患者的血液浓度和高剂量选择剂量，以通过血栓弹性成像完全抑制血栓形成。
38.人血：来自健康献血者的新鲜全血样本由药理学部的血小板生理学和药理学核心部采集。密歇根大学机构审查委员会批准了所有在血小板生理学和药理学核心的人类学科研究，所有受试者在这项研究之前给予知情同意。用3.2％柠檬酸钠将新鲜全血从健康献血者静脉穿刺到真空采集器管中。血液在室温下保存，并在抽取后3小时内使用以保持新鲜。将血液等分，将药物添加到等分液中，平均培养1分钟。340ul经处理的血液用于血栓弹性成像。每个试验组有5名捐赠者。
39.二、试验方法
40.本研究使用血栓弹性成像(teg)来研究fxa处理的血液形成止血凝块的能力、凝块的物理性质和凝块强度。在本研究中，teg用于确定fxa抑制剂在体外对人体血液的影响，然后添加速乐涓(slounase)重复实验，使用2个通道，同时使用单独的样本杯和样本。
41.为实验准备一个通道，在药物和血液孵育期间，用移液管将0.2m cacl2(用于使血液不钙化)和剂量的slounase移入杯中。然后用移液管将340ul处理过的血液移到杯中，开始反应。杯围绕销旋转，并记录销的移动。当血液凝结时，针开始移动，移动中的变化可以指示血栓的机械性质和血栓的纤维蛋白-血小板组成。为了测试slounase在fxa抑制的血液中恢复血栓形成的能力，对药物剂量进行滴定，以找到在60分钟内完全抑制血栓形成的高剂量。根据患者体内的浓度范围选择其他剂量。分析参数如图1所示。其中，反应时间(r时间)是以分钟为单位的第一次可测量血栓形成的时间；k时间是以分钟为单位的达到一定血块硬度的时间，α角表示血块发展的动力学，以程度来衡量；以mm为单位测量的最大振幅(ma)是最大凝块强度。
42.三、研究结果：
43.利伐沙班对血块形成的抑制作用和速乐涓对血块形成的逆转作用结果如图2、图3所示；由图2可知，xa因子抑制剂利伐沙班剂量依赖性的损害teg上的血栓形成；由图3可知，0.027u/mlslounase、0.053u/mlslounase、0.077u/mlslounase3个剂量速乐涓能显著恢复利伐沙班处理的人全血的r时间和ma值。阿哌沙班对血块形成的抑制作用和速乐涓对其的逆转作用结果如图4、图5所示；由图4可知，xa因子抑制剂阿哌沙班剂量依赖性的损害teg上
的血栓形成；由图5可知，0.027u/mlslounase、0.053u/mlslounase、0.077u/mlslounase3个剂量速乐涓能显著恢复阿哌沙班处理的人全血的r时间和ma值。lovenox(依诺肝素)对血块形成的抑制作用和速乐涓对其的逆转作用结果如图6、图7所示；由图6可知，xa因子抑制剂依诺肝素剂量依赖性的损害teg上的血栓形成；由图7可知，0.014u/mlslounase、0.027u/mlslounase、0.053u/mlslounase3个剂量速乐涓能显著恢复依诺肝素处理的人全血的r时间和ma值。
44.四、结论
45.在体外人全血用因子xa抑制剂利伐沙班、阿哌沙班和依诺肝素处理，可剂量依赖性的抑制血栓形成。通过血栓弹性成像检查，速乐涓治疗能够逆转利伐沙班、阿哌沙班和伊诺肝素在体外人体血液中的抗凝作用。我们的研究结果强烈表明，速乐涓作为一种通用的止血旁路剂，可逆转fxa抑制剂的抗凝作用。
46.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。