TRPS1的增强剂或者抑制剂在制备治疗色素性皮肤病药物中的应用

trps1的增强剂或者抑制剂在制备治疗色素性皮肤病药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及trps1的增强剂或者抑制剂在制备治疗色素性皮肤病药物中的应用。


背景技术：

2.黑素作为一种天然色素，在保护人体皮肤免受紫外线照射造成的危害方面发挥着重要的作用，但黑素的异常表达也会导致色素性皮肤病的发生，如黑素过度沉积会导致黄褐斑、雀斑等色素增加性皮肤病；黑素脱失会导致白癜风等色素减少性皮肤病。这类色素性疾病通常影响患者皮肤美观，给患者的身体及心理带来严重影响。目前研究已从dna损伤修复、氧化应激、神经内分泌等角度探寻了色素性皮肤病的发病机制，但其具体机制仍未阐明，色素性皮肤病疗效差、复发率高的现状也仍未改善。因此有必要探索调控黑素合成的新机制，为预防和治疗色素性皮肤病提供新的治疗靶点和思路，进而开发新型治疗药物。
3.黑素由位于皮肤基底层的黑素细胞产生，而黑素小体是真核生物黑素细胞中用于合成和沉积黑素的唯一细胞器。黑素合成是一个多步骤的酶促生化反应，其中酪氨酸酶(tyr)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrp1)、酪氨酸酶相关蛋白2(tyrp2)是黑素合成的关键酶，其表达量或活性可反映细胞内黑素合成水平；小眼畸形相关转录因子(mitf)是黑素合成的关键调控分子。因此mitf、tyr、tyrp1、tyrp2常被用做黑素合成的分子标记物。
4.trps1是一种新发现的非典型的gata转录因子家族成员，可结合下游基因启动子区中的gata结合元件，发挥促转录或抑制转录作用。目前研究发现trps1参与肿瘤、血液系统疾病、心血管疾病等的发生发展。但trps1在皮肤色素沉着中的作用及机制尚不清楚。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的是探究trps1在黑素合成中的调控作用，提供一种新的治疗色素性皮肤病药物。
6.本发明的技术方案是：
7.trps1的增强剂或抑制剂在治疗色素性皮肤病药物中的应用。
8.优选方案，所述色素性皮肤病包括色素减少性皮肤病以及色素增加性皮肤病。
9.优选方案，所述色素减少性皮肤病包括白癜风、炎症后色素减退等。
10.优选方案，所述色素增加性皮肤病包括黄褐斑、雀斑、咖啡斑、炎症后色素沉着等。
11.优选的，所述trps1的抑制剂为shrna，所述trps1的增强剂为过表达质粒。
12.进一步优选的，shrna、过表达质粒可以为多种，其合成方法为现有技术，根据目标物和现有方法可以合成多条不同的序列，只要对trps1起到抑制作用的即可实现本发明，本发明实施例验证的一条shrna(sh_trps1)具体序列如sed id no1所示，本发明实施例验证的一条过表达质粒(oe_trps1)阳性克隆测序结果如sed id no2所示。
13.本发明的实验结果发现在黑素细胞中过表达或抑制trps1表达后黑素含量明显增
多或减少，黑素合成关键基因mitf、tyr、tyrp1、tyrp2表达水平也明显增加或降低。trps1蛋白在黑素含量高的色素痣中高表达。本研究结果提示trps1是调控黑素合成的潜在治疗靶点，调控trps1表达水平的增强剂或抑制剂是治疗色素性皮肤病的潜在新方法。
14.以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细结构作进一步描述。
附图说明
15.图1：沉默trps1可抑制黑素合成。使用trps1 shrna质粒(sh_trps1)，转染黑素细胞后：(a)rt-pcr检测trps1的表达；(b)氨银染色法检测黑素细胞黑素含量；(c)免疫荧光法检测黑素小体标志物pmel表达情况；(d)rt-pcr检测mitf、tyr、tyrp1、dct的表达水平。
16.图2：过表达trps1可促进黑素合成。使用trps1过表达质粒(oe_trps1)，转染黑素细胞后：(a)rt-pcr检测trps1的表达；(b)氨银染色法检测黑素细胞黑素含量；(c)免疫荧光法检测黑素小体标志物pmel表达情况；(d)wb检测mitf、tyr、tyrp1、dct蛋白的表达水平。
17.图3：trps1蛋白在黑素含量高的色素痣中高表达。使用氨银染色法和免疫组化法分别检测不同颜色色素痣中黑素含量和trps1蛋白表达水平。
具体实施方式
18.实验方法：
19.1、细胞培养
20.黑素合成研究工具细胞mnt1在含有10％胎牛血清(fbs，gibco，australia)和1％青霉素-链霉素抗生素(biosharp，china)的dmem培养基(gibco，usa)中培养。细胞培养于37℃且含5％co2的培养箱中。
21.2、细胞转染
22.靶向trps1的shrna(gcacacagctgctacaaat，genepharma，中国上海,如sed id no1所示)用于下调trps1的表达。trps1过表达质粒(genechem，中国上海,阳性克隆测序结果如sed id no2所示)用于上调trps1的表达。使用lipofectamine 3000(invitrogen，ca，usa)转染细胞，转染48小时后行后续实验。
23.3、rt-pcr
24.通过rnafast200试剂(fastagen，中国上海)提取总rna。sybr qpcr mix(#qps-201t，toyobo)用于qrt-pcr分析。所有反应均在实时pcr仪器(德国roche lightcycler480ii)上进行。mrna表达量的计算以gapdh为内参。
25.4、western blot(wb)分析
26.使用含蛋白酶抑制剂混合物(thermo fisher)和磷酸酶抑制剂混合物(thermo fisher)的ripa裂解缓冲液提取细胞的总蛋白。10％sds-page电泳分离总蛋白，并将蛋白转移到pvdf膜上。用0.1％bsa封闭后，将膜与一抗在4℃孵育过夜，然后在室温下与二抗(1：10000，li-cor biosciences，美国)孵育1小时。通过增强的li-cor odyssey红外成像系统(li-cor biosciences，ne，美国)检测蛋白含量。gapdh为内参。
27.5、氨银染色
28.用4％中性多聚甲醛(biosharp，中国合肥)固定细胞。使用氨银溶液(sloarbio，中国北京)以染色黑色素。通过倒置显微镜(奥林巴斯x71)观察并记录黑色素。
29.6、免疫荧光
30.用4％中性多聚甲醛(biosharp，中国合肥)固定细胞。0.5％triton通透细胞，并用5％bsa封闭后，加入一抗4
°
孵育过夜，然后在室温下与荧光二抗(1：400，alexa fluor488)孵育1小时。加核染色液dapi反应5分钟后通过倒置荧光显微镜(蔡司，中国)观察荧光强度。
31.7、免疫组化
32.色素痣切片通过脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶失活、血清封闭后，与一抗(1:200)在4
°
下孵育过夜，随后与二抗、hrp各孵育20分钟，并用dab染色。通过倒置荧光显微镜(蔡司，中国)观察染色结果。免疫试剂盒购买于bioss(中国，北京)。
33.8、统计分析
34.使用graphpad prism 8.0.2软件进行统计学分析，组间比较均采用t检验。p《0.05被认为具有统计学意义，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。
35.实验结果：
36.1、沉默trps1可抑制黑素合成
37.设计一条靶向trps1的敲降质粒，采用脂质体转染法转染mnt1后rt-pcr证实trps1表达下调(图1a)。氨银染色检测黑素含量，发现黑素细胞沉默trps1表达后，黑素含量降低(图1b)；免疫荧光法检测黑素小体标志物pmel17，发现其表达降低(图1c)；同时rt-pcr检测发现mitf、tyr、tyrp1及tyrp2等黑素生成相关分子的表达也下调(图1d)。
38.2、过表达trps1可促进黑素合成
39.在mnt1中过表达trps1后rt-pcr及wb证实trps1表达上调(图2a)。氨银染色检测黑素含量，发现黑素细胞过表达trps1后，黑素含量增多(图2b)；免疫荧光法检测黑素小体标志物pmel17，发现其表达增加(图2c)；同时wb检测发现mitf、tyr、tyrp1、dct等黑素生成相关分子的蛋白表达水平也上调(图2d)。
40.3、trps1蛋白在黑素含量高的色素痣中高表达
41.通过氨银染色和免疫组化分别检测不同颜色色素痣中黑素含量和trps1的蛋白表达水平，发现与浅色素痣相比，深色素痣中黑素含量更高，且trps1的蛋白表达水平也更高(图3)。
42.实验结论：
43.1、trps1能正性调控黑素合成。
44.2、靶向trps1的增强剂或抑制剂能通过调控trps1的表达水平进而影响黑素细胞的黑素合成功能。
45.3、trps1蛋白在黑素含量高的色素痣中高表达。
46.本发明的实验结果发现在黑素细胞中过表达或抑制trps1表达后黑素含量明显增多或减少，黑素合成关键基因mitf、tyr、tyrp1、tyrp2表达水平也明显增加或降低。trps1蛋白在黑素含量高的色素痣中高表达。本研究结果提示trps1是调控黑素合成的潜在治疗靶点，调控trps1表达水平的增强剂或抑制剂是治疗色素性皮肤病的潜在新方法。