介导cbl降解P-TFEB并激动TFEB的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用

介导cbl降解p-tfeb并激动tfeb的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及介导cbl降解p-tfeb并激动 tfeb的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.肺癌是目前癌症死亡的主要原因，占所有癌症死亡的近20％。肺癌的治疗主要有术疗、放疗、化疗、靶向及免疫治疗。术疗和放疗有一定的局限性，且不宜单独使用。化疗、靶向及免疫治疗最突出问题为耐药及爆发性进展，临床长期疗效仍不理想。如近期临床研究表明，10％接收免疫治疗的患者出现肿瘤爆发性进展。到目前为止，肺癌病人的平均五年生存期仍未有显著性突破。因此，开发新的治疗非小细胞肺癌的策略仍是社会迫切所需。天然化合物抗肿瘤机制研究犹如一把钥匙能开启新的抗肿瘤靶途径，为药物开发提供新思路。
3.tfeb为转录因子，是溶酶体激活及自噬的关键上游调控因子。正常情况下，磷酸化的tfeb(即p-tfeb)与14-3-3蛋白结合，保留在细胞质内。当药物干预或应激时，tfeb去磷酸化，与14-3-3蛋白解离进入细胞核，激动其活性。药物诱导tfeb激动有很多种方式，但是通过cbl降解磷酸化tfeb，增加tfeb/tfeb二聚体，从而激动tfeb的方式尚未有报道。且通过此途径诱导肺癌细胞铁死亡的亦未有报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供介导cbl降解p-tfeb并激动tfeb的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，这是一种药物激动tfeb 的新途径，且通过此途径诱导铁死亡产生抗肿瘤。
5.具体技术方案如下：
6.本发明一方面提供了介导cbl降解p-tfeb并激动tfeb的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.作为优选，所述化合物通过诱导cbl降解p-tfeb，进而减少 p-tfeb/tfeb异二聚体，增加tfeb/tfeb二聚体，实现tfeb核转移，从而激活tfeb，诱导非小细胞癌细胞铁死亡。
8.作为优选，所述肿瘤为肺癌。更为优选，所述肺癌细胞为a549非小细胞肺癌细胞。
9.作为优选，所述p-tfeb中磷酸化位点为s122。
10.作为优选，介导cbl降解p-tfeb并激动tfeb的化合物为银杏双黄酮；银杏双黄酮与tfeb蛋白有结合作用；银杏双黄酮促进cbl与p-tfeb结合，并降低p-tfeb含量，同时促进tfeb/tfeb同源二聚体的形成，进而促进 tfeb入核，并激动其下游溶酶体活性及自噬标记物的增加，且其效应可以被tfeb沉默所逆转。
11.本发明另一方面提供了一种抗肿瘤药物，其特征在于包括介导cbl降解p-tfeb并激动tfeb的化合物。
12.作为优选，所述药物的剂型为医学上认可的任何一种剂型。
13.本发明又一方面提供了一种药物组合物，包括介导cbl降解p-tfeb 并激动tfeb的化合物，以及药学上可接受的载体。
14.本发明提出tfeb可以被药物通过非经典的新途径而激活。实验结果显示：cbl与p-tfeb在肿瘤细胞内未有结合，而在介导cbl降解p-tfeb 并激动tfeb的化合物(例如银杏双黄酮)能与tfeb结合作用下，能产生结合。cbl是e3泛素连接酶，能调节泛素化促进降解。cbl与p-tfeb 的结合促进了p-tfeb的降解。tfeb在形成同源二聚体后才能在核内激动，作用于下游基因的启动区，促进下游基因的转录。介导cbl降解p-tfeb并激动tfeb的化合物(例如银杏双黄酮)诱导的cbl与p-tfeb结合及 p-tfeb降低，促进了tfeb/tfeb同源二聚体的形成。此过程促进了tfeb 入核，并激活了下游效应溶酶体活性及自噬标志物的增加。介导cbl降解 p-tfeb并激动tfeb的化合物(例如银杏双黄酮)与tfeb结合，且通过 cbl降解p-tfeb而激活tfeb的途径为本发明首次报道。同时，tfeb激动后能直接诱导铁死亡，且为铁死亡的关键调控点。本发明首次提出化合物通过与tfeb蛋白结合激动tfeb诱导铁死亡作为肿瘤(例如非小细胞肺癌)的途径。本发明报道的抗非小细胞肺癌的作用新途径能为防治肿瘤 (例如非小细胞肺癌)以及针对此靶途径的药物开发提供理论及实践基础。
附图说明
15.图1为实施例1不同浓度银杏双黄酮与tfeb蛋白有结合作用的结果示意图；其中a为银杏双黄酮与tfeb蛋白结合的biacore传感图，b为银杏双黄酮与tfeb蛋白结合的亲和力曲线图；
16.图2为实施例2的银杏双黄酮诱导p-tfeb与cbl结合，cbl与银杏双黄酮诱导的p-tfeb降解呈正相关的结果示意图；其中a为p-tfeb与cbl 结合的免疫沉淀图，b为银杏双黄酮作用于mef细胞及cbl敲除mef细胞后p-tfeb的变化；
17.图3为实施例3的银杏双黄酮促进tfeb磷酸化，与结合蛋白14-3-3 分离，并促进tfeb/tfeb二聚体形成的结果示意图；其中a为银杏双黄酮作用于非小细胞肺癌细胞3、6、12、24h后tfeb及p-tfeb的变化，b 为银杏双黄酮作用于非小细胞肺癌3、6、12、24h后tfeb与14-3-3结合的免疫沉淀图，c为银杏双黄酮作用于非小细胞肺癌后，p-tfeb/tfeb以及tfeb/tfeb二聚体形成的免疫沉淀图；
18.图4为实施例4的银杏双黄酮促进tfeb核转移及自噬标记物增加的结果示意图；
19.图5为实施例5的tfeb是银杏双黄酮诱导溶酶体激活及自噬的关键调控点的结果示意图；其中a为tfeb沉默后对银杏双黄酮诱导的非小细胞肺癌溶酶体激活的影响，b为tfeb沉默后对银杏双黄酮诱导的自噬标记物lc3增加的影响；
20.图6为实施例6的银杏双黄酮对肺癌细胞的抑制作用能被tfeb敲降而逆转的结果示意图；
21.图7为实施例7的银杏双黄酮诱导肺癌细胞铁死亡，且能被tfeb敲降而逆转的结果示意图；其中a为非小细胞肺癌tfeb沉默后，银杏双黄酮对铁死亡相关蛋白的影响，b为非小细胞肺癌tfeb沉默后，银杏双黄酮对脂质过氧化物的影响；c为非小细胞肺癌tfeb沉默后，银杏双黄酮对不稳定铁池的影响。
22.图1-图7中，gk为银杏双黄酮。
具体实施方式
23.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
24.实施例1：银杏双黄酮与tfeb蛋白有结合作用
25.tfeb蛋白及其截短体通过胺基共价固定在cm5芯片上，固定化水平为 6500ru。不同浓度的银杏双黄酮溶液(100μm，33.3μm，11.1μm，3.7μm， 1.2μm，0.41μm，0.14μm)流过芯片表面，实时采集互作信号。整个系统在10mm hepes，ph 7.4，150mm nacl，0.05％p2o，2％dmso缓冲溶液中进行。采用ge life sciences biacore s200系统进行检测及数据分析。结果显示，银杏双黄酮与tfeb蛋白有结合作用(图1)。
26.实施例2：银杏双黄酮诱导p-tfeb与cbl结合，cbl与银杏双黄酮诱导的p-tfeb降解呈正相关
27.a549细胞在1640培养基中培养，该1640培养基含10％胎牛血清、青酶素100u/ml、庆大酶素100ug/ml，培养箱温度为37℃,含5％co2。采用分子克隆技术，将tfeb磷酸化位点s122进行突变，构建磷酸化位点突变质粒pcdna3.1-tfeb
s122d
，模拟tfeb持续磷酸化。
28.将pcdna3.1，pcdna3.1-tfeb与pcdna3.1-tfeb
s122d
分别转染至 a549细胞，给予银杏双黄酮。而后收集细胞，裂解提取蛋白，与tfeb抗体及protein g-beads共同孵育，缓冲液洗protein g-beads 4次，用尿素溶解蛋白。而后用胰酶消化成肽段，用lc-ms/ms进行蛋白质组学分析。结果显示cbl可以选择性得与磷酸化tfeb(p-tfeb)结合。用免疫沉淀方法进行验证，结果发现，cbl与pcdna3.1-tfeb
s122d
共转染至a549，银杏双黄酮可以诱导两者的结合，且此结合在未给予银杏双黄酮的样本中未发现，说明cbl与p-tfeb(s122)的结合依赖于银杏双黄酮。此结果提示，cbl 可能参与了tfeb的去磷酸化。将银杏双黄酮给予mef细胞及cbl敲除的 mef细胞，发现cbl与tfeb s122位点的去磷酸化成正相关(图2)。
29.实施例3：银杏双黄酮促进tfeb磷酸化，与结合蛋白14-3-3分离，并促进tfeb/tfeb二聚体形成。
30.a549细胞给予银杏双黄酮后不同时间(3、6、12、24h)收集细胞，裂解细胞，提取蛋白，用westernblot检测p-tfeb的变化，结果显示，银杏双黄酮能够时间依赖性得降低p-tfeb的水平(图3a)。
31.tfeb磷酸化水平降低，会导致其与结合蛋白14-3-3的分离，游离的 tfeb、p-tfeb之间会形成三种形式的二聚体，分别为p-tfeb二聚体， tfeb二聚体，p-tfeb\tfeb异二聚体。其中，tfeb二聚体才能入核发挥转录因子功能，而p-tfeb在二聚体中的出现将影响tfeb活性的激活。采用免疫沉淀的方法观察银杏双黄酮给予a549细胞不同时间点(3、6、 12、24h)后，tfeb与14-3-3的结合。结果显示，tfeb与14-3-3的结合呈现时间依赖性的减少(图3b)。
32.为观察tfeb二聚体形成情况，采用银杏双黄酮给药后tfeb与14-3-3 分离最明显的时间点24h，进行免疫共沉淀实验。将a549肺癌细胞共转染myc-tfeb(wt)和egfp-tfeb，或磷酸化myc-tfeb(aa)和egfp-tfeb，分别给予或不给予银杏双黄酮24h。而后将细胞裂解，提取蛋白，总裂解液与标签抗体myc和protein g beads 4℃摇晃孵育过夜。免疫沉淀反应后，离心弃上清，缓冲液洗protein g-beads 4次，加入上样缓冲液变性蛋白， western检测二聚体形成情况。结果显示，银杏双黄酮作用下，形成的 tfeb/tfeb同源二聚体显著高于p-tfeb/tfeb异二聚体的量(图3c)。
33.综上所述，银杏双黄酮能促进a549肺癌细胞tfeb的去磷酸化，使得其与14-3-3分离，增加同源二聚体tfeb/tfeb的产生。
34.实施例4：银杏双黄酮促进tfeb核转移及自噬标记物增加。
35.将a549肺癌细胞接种于盖玻片上，细胞贴壁后给予银杏双黄酮24h。pbs 冲洗，甲醛固定15min后，pbs冲洗，bsa封闭1h。4℃过夜孵育tfeb和lc3 一抗，pbs冲洗后孵育荧光二抗及dapi，封片。采用激光共聚焦显微镜观察tfeb细胞核分布，及lc3的表达情况。结果显示，表示tfeb蛋白的绿色荧光以a549细胞内细胞质内分布为主，细胞核内绿色荧光较弱，且与代表细胞核的蓝色荧光重叠较少，说明tfeb大部分分布在细胞质，细胞核内分布较少。同时，代表lc3的红色荧光较弱。银杏双黄酮给药组内，绿色荧光在核内显著增强，呈现高密度状态，与蓝色荧光重叠较多，且细胞质的绿色荧光有所减弱。这说明tfeb发生了核转移，在核对的表大量显著增加。此外，自噬是tfeb调控的下游事件，自噬标记物lc3的红色荧光显著增加，说明lc3的表达量有所增加。tfeb的入核是其激动的关键步骤，上述结果说明，银杏双黄酮诱导了tfeb的入核，并可能激动了自噬等下游事件的发生(图4)。
36.实施例5：tfeb是银杏双黄酮诱导溶酶体激活及自噬的关键调控点。
37.tfeb激动后能增加溶酶体活性及自噬水平。为进一步说明银杏双黄酮通过激活tfeb产生的效应，我们在肺癌细胞内过表或敲降tfeb后观察肺癌细胞给予银杏双黄酮后溶酶体活性及自噬标记物lc3的变化。a549肺癌细胞接种于盖玻片上，转染tfeb，或者sirnatfeb后给予银杏双黄酮，用溶酶体探针red dnd-99染色细胞，而后将盖玻片固定于细胞室中，用激光共聚焦观察活细胞内溶酶体活性的变化。观察lc3的变化时，则将样本固定，pbs洗后，敷育一抗及荧光二抗，并用dapi进行核染，封片后用激光共聚焦进行观察。结果显示，银杏双黄酮处理后红色荧光增强，说明溶酶体活性增加，tfeb过表后能增强此作用，而敲降后能逆转此过程(图5a)。同样地，银杏双黄酮诱导的自噬增加能被tfeb的敲降而逆转(图5b)。上述结果说明，tfeb是银杏双黄酮诱导溶酶体激活及自噬水平改变的关键调控点。
38.实施例6：银杏双黄酮对肺癌细胞的抑制作用能被tfeb敲降而逆转。
39.将a549细胞种于96孔板，每孔细胞密度约5
×
103个细胞，24h细胞贴壁后，分别转染sirna以及tfeb sirna，12h后给予不同浓度的银杏双黄酮(5，10μm)，48h后加入mtt染色，染色4h后，舍弃原有培养液，加入dmso溶解，放入酶标仪，使用570nm检测波长测定吸光度。结果显示银杏双黄酮对a549非小细胞肺癌细胞具有较强的细胞毒性作用， tfeb敲降后能逆转此作用(图6)。
40.实施例7：银杏双黄酮诱导肺癌细胞铁死亡，且能被tfeb敲降而逆转。
41.a549细胞种于10cm细胞培养皿，当密度到70％时，分别转染sirna 以及tfeb sirna，12h之后加入10μm银杏双黄酮。给药48h之后，弃培养基，收集细胞，裂解提取蛋白，用westernblot检测铁死亡相关蛋白的变化。结果显示，银杏双黄酮能显著降低铁死亡负相关蛋白gpx4、 slc40a1的表达，同时显著提高正相关蛋白transferrin的含量。上述蛋白变化均能被tfeb的敲降而逆转(图7a)。
42.铁死亡的核心时间是脂质过氧化物及不稳定铁池的增加。为进一步证明银杏双黄酮能诱导铁死亡，且tfeb在此过程中的关键作用。继而检测了脂质过氧化物和不稳定铁池的含量。
43.a549细胞种于6孔板上，每孔细胞密度约5
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104个细胞，过夜让细胞贴壁，分别转染sirna以及tfeb sirna，12h之后加入银杏双黄酮(10 μm)，加药之前更换培养液。给药24小时后，加入含有终浓度为5μm的 bodipy 589/591c11的无血清培养基与37℃荧光标记0.5小时。而后用胰酶消化后，收集细胞，pbs冲洗后重悬，流式细胞仪检测lipid ros的含量。结果显示，银杏双黄酮给予之后，lipid ros的含量显著上升，当tfeb敲降后，lipid ros的上升被逆转(图7b)。
44.a549细胞种于6孔板上，每孔细胞密度约5
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104个细胞，过夜让细胞贴壁，分别转染sirna以及tfeb sirna，12h之后加入银杏双黄酮(10 μm)，以5
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105/ml的密度加入ca-am(0.5μm)，37℃孵育15min。而后每组细胞收集分成两部分，分别给予或不给予铁螯合剂dfp(deferiprone)100 μm孵育1h，用流式细胞仪检测每组细胞给予及不给予dfp的样本的平均荧光强度，计算差值，比较此差值在每个组的区别。结果显示，银杏双黄酮能显著增加细胞内不稳定铁池的含量，且此增加能被tfeb的沉默所逆转(图7c)。
45.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
46.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。