一种胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂的制备方法与流程

一种胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌
γ
蛋白组合制剂的制备方法
技术领域
1.本技术涉及生物医药技术领域，更具体地说，它涉及一种胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂的制备方法。


背景技术：

2.皮肤微生物群在人出生后不久就开始形成，种类繁多、数量巨大，与皮肤健康密切相关。痤疮是一种微生物感染相关的常见皮肤病，其是以毛囊皮脂腺为单位的一种慢性炎症性皮肤病，俗称青春痘，主要好发于青少年，多发于头面部，颈部等皮脂腺丰富的部位，可能导致形成痘斑、痘坑、痘疤痕等，对青少年的心理和社交影响很大。痤疮的发病机制主要为雄激素分泌异常、痤疮内细菌的大量繁殖、炎症损害和免疫失常及毛囊皮脂腺导管角化异常等。引起痤疮的主要致病因素之一是痤疮丙酸杆菌，目前口服或外用抗菌药物治疗痤疮有效，但随着抗菌药物的广泛使用，痤疮丙酸杆菌（propionibacterium acnes，p.acnes）的耐药性也随之产生，治疗效果明显降低，因此迫切需要研制新型抗痤疮丙酸杆菌的药物。
3.痤疮丙酸杆菌在痤疮的发生中起重要作用，除引起痤疮外，其还在多个致病因素中起重要作用，例如，可引起感染性心内膜炎、血栓性静脉炎、骨炎、关节炎、急性化脓性心包炎及其他手术后感染。因此，选择性杀灭痤疮丙酸杆菌将极大的有利于痤疮及其他疾病的治疗，缓解因痤疮丙酸杆菌引起的炎症反应，降低耐药性细菌的产生。
4.鸡卵黄抗体（immunoglobulin yolk，igy），又名γ蛋白，具有安全方便、简单易得、产率高、成本低、特异性强、不与 igg 发生交叉血清学反应 ；且性能稳定，活性保持良好等优点，正成为医药领域的新热点，具有广阔的应用前景。γ蛋白能够结合和凝集致病菌，抑制致病菌生长，使致病菌不能繁殖而死亡。因此，抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白制剂的研制对痤疮的防治具有重要意义。


技术实现要素：

5.为了解决相关技术中痤疮丙酸杆菌的耐药性增强，口服或外用抗菌药物治疗痤疮效果明显降低的问题，本技术提供了一种胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂的制备方法。
6.本技术提供了一种胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂的制备方法，采用如下的技术方案：一种胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂的制备方法，具体包括以制备下步骤：s1：制备抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白；s2：按重量百分比计，称取组合制剂制备用原料：包括抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白0.1-2%、重组三型胶原蛋白0.01-2%、防腐剂0.1-2%、甘油1-10%、中和剂0.1-3%、保湿剂0.01-2%、卡波姆0.1-2%、余量为水；s3：制备组合制剂：
s3.1：取1/2-3/4体积的水，加入抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白和重组三型胶原蛋白，第一次搅拌混合后，加入甘油和中和剂继续第二次搅拌混合，得均一溶液经真空脱泡后保温备用；s3.2：将卡波姆加剩余水充分分散后，加入防腐剂、保湿剂，第一次搅拌混合均匀后，加入步骤s3.1中的均一溶液，第二次搅拌混合，即得所需的胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂。
7.通过采用上述技术方案，先制备抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白，然后将其与重组三型胶原蛋白复配，在中和剂的作用下，获得均一溶液；将剩余原料混合均匀后，对均一溶液进行混合包覆，制得所需的组合制剂；本技术制得的组合制剂能够有效治疗痤疮，其疗效显著，治疗周期短，且不会产生耐药性，通过将抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白与重组三型胶原蛋白复配，在有效抑制痤疮丙酸杆菌的同时，实现促进细胞生长、粘附，与新生细胞和组织协同修复创伤的功效，在中和剂的存在下，抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白的生物活性和重组三型胶原蛋白的修复特性，均获得了大大提高，从而有效增强对痤疮丙酸杆菌的抑制作用和对损害皮肤的修复作用。
8.优选的，所述步骤s1中制备抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白，具体包括以下操作：准备抗原、佐剂配伍形成免疫疫苗、鸡接种疫苗、蛋黄分割和抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白分离。
9.优选的，所述准备抗原，具体操作如下：首先将配制好的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基加羊毛脂加热搅拌均匀后，调节ph值至7-7.4，经高压蒸汽灭菌冷却，用接种棒将痤疮丙酸杆菌接种至培养基中，隔绝氧气迅速用橡胶塞塞紧瓶口，最后置于37℃的恒温箱中培养8-16h；配制质量分数为0.4%的甲醛溶液，于37℃的温度下灭活痤疮丙酸杆菌，制备获得痤疮丙酸杆菌抗原。
10.优选的，所述佐剂配伍形成免疫疫苗具体指：按质量比1:1，将痤疮丙酸杆菌抗原与佐剂充分乳化制得免疫疫苗；所述佐剂由质量比1.2-1.7:4.5-6.5:0.3-0.8:1.5-3的羟基磷灰石、0.8-1.5mol/l磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯混合复配而得。
11.优选的，所述佐剂由以下方法制得：将羟基磷灰石、磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯按上述比重混合研磨均匀即得。
12.通过采用上述技术方案，将培养的痤疮丙酸杆菌经甲醛灭活获得痤疮丙酸杆菌抗原，将抗原与佐剂复配制得所需的免疫疫苗，将上述免疫疫苗用于产蛋母鸡注射，即可获得免疫鸡蛋。
13.本技术采用自制佐剂，通过控制佐剂的原料选用和配比，将羟基磷灰石、磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯混合复配制得抗原用佐剂，所述佐剂与抗原混合后，能够有效吸附抗原，保持抗原的生物活性，延长抗原在鸡体内的贮存时间，同时能够达到缓慢释放抗原，延长抗原的作用时间，增强免疫效果。
14.优选的，所述鸡接种疫苗的接种方案如下：共免疫3次，每次间隔3-4周，初次免疫和第二次免疫的免疫剂量为0.025mg/只；第二次免疫后1周，采集鸡蛋，并做好标记，实验室检测；第三次免疫的免疫剂量为0.25mg/只，第三次免疫后1周，采集鸡蛋，并做好标记，实验室检测。
15.通过采用上述技术方案，本技术的鸡接种疫苗方案中，免疫3次即可获得所需的高效价免疫鸡蛋，疫苗用量少，免疫周期短，免疫效果显著。
16.优选的，所述抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白分离具体指：将经蛋黄分割获得的卵黄加7-10倍的去离子水，于32-45℃的温度下，边搅拌边调节ph值至5.7-6.5，搅拌均匀后静置收集上清液，将上清液经超滤膜过滤提纯，即得所需的抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白。
17.通过采用上述技术方案，本技术采用的抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白分离方法简单，操作条件温和，操作成本低，分离提纯效果好。
18.优选的，所述步骤s2中重组三型胶原蛋白为重组人源三型胶原蛋白；防腐剂包括质量比1:4-7的三氯叔丁醇和绿原酸；中和剂包括质量3-8:1:1-3的大豆卵磷脂、黄芪多糖和海藻酸钠；保湿剂为三甲基甘氨酸或乳酸钠。
19.通过采用上述技术方案，重组人源三型胶原蛋白能够促进细胞生长、粘附，与新生细胞和组织协同修复创伤，其与人胶原蛋白序列100%相同，生物相容性好，易吸收，无排异及过敏反应，活性强，将其与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白复配使用，在快速填补受损的角质屏障、防止水分营养的流失和保证皮肤新陈代谢正常的同时，能够提高抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白的吸收利用率，增强其对痤疮丙酸杆菌抑制效果。
20.三氯叔丁醇和绿原酸复配能够有效延长组合制剂的保存期限，且不会对抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白的生物活性造成影响，本技术中的防腐剂掺量用量少，成分安全，抑菌抗菌效果显著。
21.大豆卵磷脂、黄芪多糖和海藻酸钠复配用作中和剂，通过控制三者的配比，所得中和剂对抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白具有良好的保护、促进作用，其能够显著提高抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白的生物活性，增强对痤疮丙酸杆菌的抑制作用，增强重组三型胶原蛋白对损害皮肤的修复作用，提高组合制剂的吸收利用率。
22.保湿剂的添加能够给皮肤补充水分，促进皮肤的修复过程。
23.优选的，所述步骤s2中按重量百分比计，原料包括：抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白1%、重组三型胶原蛋白1%、防腐剂0.8%、甘油7%、中和剂2%、保湿剂1.2%、卡波姆1%、余量为水。
24.通过采用上述技术方案，优选后的组合制剂配方吸收利用率最高，痤疮丙酸杆菌抑制效果最好。
25.优选的，所述步骤s3.1中搅拌混合温度均为20-40℃，搅拌混合转速均为100-300r/min，第一次搅拌混合时间为30-50min，第二次搅拌混合时间为1-2h。
26.优选的，所述步骤s3.2中搅拌混合温度均为20-40℃，第一次搅拌混合转速为100-300r/min，第一次搅拌混合时间为20-40min，第二次搅拌混合转速为10-50r/min，第二次搅拌混合时间为1-2h。
27.通过采用上述技术方案，通过控制组合制剂过程中的混合工艺参数，能够在保证组合制剂生物活性的同时，控制抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白的包覆效果，缩短制备周期，降低制备成本。
28.综上所述，本技术具有以下有益效果：1、本技术提出了一种胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂的制备方法，该方法制得的组合制剂能够有效治疗痤疮，其疗效显著，治疗周期短，且不会产生耐药性，在有效抑制痤疮丙酸杆菌的同时，实现促进细胞生长、粘附，与新生细胞和组织协同修复创伤的功效，从而有效增强对痤疮丙酸杆菌的抑制作用和对损害皮肤的修复作用。
29.2、本技术提出的制备方法操作简单，制备条件温和，通过选用原料的控制，原料配比的控制，以及制备过程中，原料混合顺序的控制等，能够有效实现对抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白包裹，提高抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白的生物活性，同时提高组合制剂的吸收利用率，增强其对痤疮丙酸杆菌的缓慢有效抑制效果。
具体实施方式
30.以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。
31.制备例1-3提供了佐剂的制备方法。
32.制备例1按质量比1.2:4.5:0.3:1.5，将羟基磷灰石、0.8mol/l磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯混合研磨均匀即得所需佐剂。
33.制备例2按质量比3:11:1:5，将羟基磷灰石、1.2mol/l磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯混合研磨均匀即得所需佐剂。
34.制备例3按质量比1.7:6.5:0.8:3，将羟基磷灰石、1.5mol/l磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯混合研磨均匀即得所需佐剂。
35.制备例4-6提供了抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白的制备方法，以下以制备例4为例进行说明。
36.制备例4制备抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白，具体包括以下操作：准备抗原、佐剂配伍形成免疫疫苗、鸡接种疫苗、蛋黄分割和抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白分离；首先将配制好的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基加羊毛脂加热搅拌均匀后，调节ph值至7，经高压蒸汽灭菌冷却，用接种棒将痤疮丙酸杆菌接种至培养基中，隔绝氧气迅速用橡胶塞塞紧瓶口，最后置于37℃的恒温箱中培养8h；配制质量分数为0.4%的甲醛溶液，于37℃的温度下灭活痤疮丙酸杆菌，制备获得痤疮丙酸杆菌抗原；按质量比1:1，将痤疮丙酸杆菌抗原与制备例1制备的佐剂充分乳化制得免疫疫苗，将上述免疫疫苗用于产蛋母鸡注射，鸡接种疫苗的接种方案如下，共免疫3次，每次间隔3周，初次免疫和第二次免疫的免疫剂量为0.025mg/只；第二次免疫后1周，采集鸡蛋，并做好标记，实验室检测；第三次免疫的免疫剂量为0.25mg/只，第三次免疫后1周，采集鸡蛋，并做好标记，实验室检测，即可获得免疫鸡蛋；将免疫鸡蛋进行蛋黄分割，将经蛋黄分割获得的卵黄加7倍的去离子水，于32℃的温度下，边搅拌边调节ph值至5.7，搅拌均匀后静置收集上清液，将上清液经超滤膜过滤提纯，即得所需的抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白。
37.制备例 5-6，同制备例4，不同之处仅在于：制备过程中的工艺参数不同，具体见表1。
38.表1：工艺参数制备例4制备例5制备例6培养基ph值77.27.4
病菌培养时间8h12h16h佐剂制备例1制备例2制备例3免疫周期334去离子水倍数7810搅拌温度32℃38℃45℃ph值5.76.16.5实施例1-5提供了一种胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂的制备方法，以下以实施例1为例进行说明。
39.实施例1本技术提供了一种胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂的制备方法，采用如下的技术方案：一种胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂的制备方法，具体包括以下步骤：s1：按上述制备例4制备抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白；s2：按重量百分比计，称取组合制剂制备用原料：包括抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白0.1%、重组三型胶原蛋白0.01%、防腐剂0.1%、甘油1%、中和剂0.1%、保湿剂0.01%、卡波姆0.1%、余量为水；s3：制备组合制剂：s3.1：取1/2体积的水升温至20℃，加入抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白和重组三型胶原蛋白，以300r/min的搅拌转速，第一次搅拌混合后30min，加入甘油和中和剂继续第二次搅拌混合1h，得均一溶液经真空脱泡后保温备用；s3.2：将卡波姆加剩余水充分分散后，加入防腐剂、保湿剂，控制搅拌温度为20℃，以300r/min的搅拌转速，第一次搅拌混合20min至搅拌均匀后，加入步骤s3.1中的均一溶液，以10r/min的搅拌转速，第二次搅拌混合2h，即得所需的胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂。
40.实施例2-5，同实施例1，不同之处仅在于：制备原料选用及选用百分比不同，制备工艺参数不同，具体见表2。
41.表2：
原料选用实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白制备例4制备例5制备例6制备例4制备例5重组三型胶原蛋白重组人源三型胶原蛋白重组人源三型胶原蛋白重组人源三型胶原蛋白重组人源三型胶原蛋白重组人源三型胶原蛋白防腐剂1:4的三氯叔丁醇和绿原酸1:5的三氯叔丁醇和绿原酸1:5.5的三氯叔丁醇和绿原酸1:6的三氯叔丁醇和绿原酸1:6.5的三氯叔丁醇和绿原酸中和剂3:1:1的大豆卵磷脂、黄芪多糖和海藻酸钠3:1:3的大豆卵磷脂、黄芪多糖和海藻酸钠5:1:2的大豆卵磷脂、黄芪多糖和海藻酸钠8:1:1的大豆卵磷脂、黄芪多糖和海藻酸钠8:1:3的大豆卵磷脂、黄芪多糖和海藻酸钠保湿剂三甲基甘氨酸乳酸钠三甲基甘氨酸乳酸钠三甲基甘氨酸原料用量实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白0.1%0.5%1%1.5%2%重组三型胶原蛋白0.01%0.6%1%1.5%2%防腐剂0.1%0.5%0.8%1.6%2%甘油1%5%7%8%10%中和剂0.1%1%2%2.6%3%保湿剂0.01%0.6%1.2%1.4%2%卡波姆0.1%0.4%1%1.2%2%水补至100%补至100%补至100%补至100%补至100%
工艺参数实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5s3.1水用量1/23/41/23/41/2s3.1中搅拌混合温度20℃25℃30℃35℃40℃s3.1中搅拌混合转速300r/min250r/min200r/min150r/min100r/mins3.1中第一次搅拌时间30min35min40min45min50mins3.1中第一次搅拌时间1h1.2h1.5h1.8h2hs3.2中搅拌混合温度20℃25℃30℃25℃40℃s3.2中第一次搅拌转速300r/min250r/min200r/min150r/min100r/mins3.2中第一次搅拌时间20min25min30min35min40mins3.2中第二次搅拌转速10r/min20r/min30r/min40r/min50r/mins3.2中第二次搅拌时间2h1.8h1.5h1.2h1h
为了验证本技术提供的一种胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂的制备方法制得的组合制剂的性能，申请人设置了对比例1-7，其中：对比例1，同实施例3，不同之处仅在于：采用制备6的方法制备抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白时，将本技术制备例3中的佐剂替换为完全弗氏佐剂。
42.对比例2，同实施例3，不同之处仅在于：采用制备6的方法制备抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白时，将本技术制备例3中的佐剂替换为由质量比1.7:6.5:3的羟基磷灰石、磷酸溶液和甘油二酯混合研磨制得的佐剂。
43.对比例3，同实施例3，不同之处仅在于：防腐剂为三氯叔丁醇。
44.对比例4，同实施例3，不同之处仅在于：防腐剂为绿原酸。
45.对比例5，同实施例3，不同之处仅在于：中和剂包括质量5:1的大豆卵磷脂和黄芪多糖。
46.对比例6，同实施例3，不同之处仅在于：中和剂包括质量5:2的大豆卵磷脂和海藻酸钠。
47.对比例7，同实施例3，不同之处仅在于：s3.2中第二次搅拌转速为200r/min。
48.分析本技术实施例1-5和对比例1-7中制得的胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂的缓释效果和抑制病毒活性：实施例1-5和对比例1-7中制得的胶原蛋白与抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂在人工胃液中缓释测试称取上述组合制剂各10ml，分别分散于10ml人工胃液（胃蛋白酶10g/l，ph=1.2）中，转速150rpm/min，37℃，每隔30min吸取100ul，针孔过滤，测溶液中抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白含量，采用γ蛋白定量试剂盒检测该抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂在人工胃液中释放量，结果见表3。
49.表3：
由上述表3显示结果可知：本技术实施例1-5和对比例1-6中制得的组合制剂释放缓慢，且总体平稳，缓释效果好。对比例7制得的组合制剂，释放速度快，4h释放率即超过93%，缓释效果较实施例与其余对比例大大下降。
50.实施例1-5和对比例1-7中制得的抗痤疮丙酸杆菌γ蛋白组合制剂抗病毒活性测试。
51.在96孔板中每孔加入150μl vero细胞约2
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105个，其中对照组1加入50μlpbs缓冲溶液，对照组2加入25μl 痤疮丙酸杆菌菌液和25μlpbs缓冲溶液，实施例1-5和对比例1-7组分别加入25μl痤疮丙酸杆菌菌液和25μl对应的组合制剂（3g/l），在37℃，co2培养箱中培养，48h后观察结果如下：其中，对照组1为正常vero细胞，对照组2为被痤疮丙酸杆菌感染48h后的vero细胞，对照组2中约73%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；实施例1-5中细胞生长良好，均免受痤疮丙酸杆菌感染致死；对比例1中约11%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例2约8%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例3约14%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例4约15%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例5约15%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例6约13%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例7约7%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡。
52.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。