TCF7L1在用于预防或治疗腹主动脉瘤中的医药用途的制作方法

tcf7l1在用于预防或治疗腹主动脉瘤中的医药用途
技术领域
1.本发明属于医药生物技术领域，涉及tcf7l1（transcription factor 7-like 1）的医药用途，具体涉及干预tcf7l1基因表达或抑制其活性片段用于制备预防和治疗腹主动脉瘤的药物的用途。


背景技术：

2.腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm，aaa）是一种永久性局灶性主动脉扩张，由腹主动脉壁的进行性减弱引起，是老年人常见且可能危及生命的疾病。开放性手术干预和血管内修复是aaa公认的治疗方法。然而，这两种方法仅适用于动脉瘤破裂或直径超过5.5cm的aaa。随着检查手段的进步，虽然可以早期发现aaa，但目前临床上没有有效的治疗药物可以改变aaa进展的自然进程。
3.血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，vsmc）是主动脉壁的主要固有细胞。越来越多的证据表明，vsmc表型转换在aaa的发生发展中起重要作用。随着vsmc收缩表型标志物表达如α-sma的逐渐减少，vsmc向合成表型的转化是aaa的早期生物学改变。合成表型的vsmc通过促进炎症因子和弹性蛋白降解基质金属蛋白酶（mmps）的产生而促进动脉瘤的发展。在aaa发病过程中，靶向改善vsmc功能障碍，包括抑制vsmc表型转换和凋亡，可能成为限制aaa生长的潜在策略。
4.转录因子7-样1（transcription factor 7-like 1，tcf7l1），也称为高迁移率族盒转录因子（tcf3），是淋巴增强子因子/t细胞因子（lef/tcf）家族转录因子的一员，与β连环蛋白（β-catenin）相互作用，充当dna结合蛋白。tcf7l1通过直接结合多个基因并与蛋白质相互作用来调节wnt-β-catenin和c-myc信号，从而在肿瘤细胞分化、增殖和恶性肿瘤发生中发挥作用。高度保守的wnt信号通路调节胚胎发育过程中的关键过程，包括细胞命运，并与许多病理学有关。wnt信号被认为可以调节vsmc的分化。但是，tcf7l1在aaa中的作用及机制还不清楚。因此，本发明旨在提供干预tcf7l1表达或抑制其活性片段用于预防或治疗aaa的医药用途。
5.本领域迫切需要寻求腹主动脉瘤诊断标志物，以及将标志物抑制剂应用到腹主动脉瘤医药中，这是亟需要解决的技术问题。


技术实现要素：

6.为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供tcf7l1在aaa中的诊断作用，及干预tcf7l1在预防或治疗aaa中的医药用途。
7.本发明的目的之一在于提供与腹主动脉瘤发生发展相关的生物标志物。
8.本发明的目的之二在于提供一种利用生物标志物的表达水平诊断腹主动脉瘤的手段和产品。
9.本发明的目的之三在于提供一种利用生物标志物的抑制剂治疗腹主动脉瘤的手段和药物。
10.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案。
11.本发明提供了tcf7l1抑制剂在制备用于诊断腹主动脉瘤产品中的应用。
12.进一步的，所述的用于诊断腹主动脉瘤产品中以tcf7l1作为标志物，其中标志物包括tcf7l1基因或tcf7l1蛋白。
13.进一步的，所述的标志物tcf7l1在腹主动脉瘤中表达上调。
14.进一步的，所述tcf7l1抑制剂在制备用于诊断腹主动脉瘤产品为芯片、制剂或试剂盒。
15.本发明还提供了tcf7l1抑制剂在制备用于治疗腹主动脉瘤药物中的应用。
16.进一步的，tcf7l1抑制剂在制备用于治疗腹主动脉瘤药物中的应用，tcf7l1抑制剂促进血管平滑肌细胞分化。
17.进一步的，tcf7l1抑制剂在制备用于治疗腹主动脉瘤药物中的应用，tcf7l1抑制剂在制备治疗腹主动脉瘤药物中作为血管平滑肌细胞分化促进剂和/或血管平滑肌细胞的迁移抑制剂的应用。
18.进一步的，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的剂型或剂量。
19.本发明还提供了所述tcf7l1抑制剂靶序列为seq id no.1所示。
20.进一步的，所述tcf7l1抑制剂包括上述靶序列的sirna和/或shrna。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
22.本发明通过大量动物实验发现，采用ang ii埋泵的方法建立aaa模型，发现aaa发生过程中tcf7l1表达明显上调。采用尾静脉注射aav病毒的方法构建tcf7l1小鼠体内过表达或低表达模型，发现小鼠体内过表达tcf7l1加重aaa的形成；低表达tcf7l1延缓aaa的形成。tcf7l1在小鼠vsmc去分化过程中表达明显上调。对tcf7l1进行敲减后可以促进小鼠vsmc分化增强；反之，过表达tcf7l1抑制小鼠vsmc分化。以上结果表明，tcf7l1在aaa发生过程中起重要调控作用，对tcf7l1进行提前干预可能是aaa预防或治疗的靶点。
23.1、本发明提供了一种诊断腹主动脉瘤基因标志物，通过检测标志物tcf7l1的表达水平即可对腹主动脉瘤情况进行判断，提供了一种特异性高敏感性好的腹主动脉瘤检测判定的分子标志物。
24.2、本发明研究发现，通过所述的抑制剂敲低该新型tcf7l1的表达，可促进血管平滑肌细胞分化，同时可以抑制腹主动脉瘤细胞迁移，可以用于腹主动脉瘤的治疗。
25.3、本发明提供的tcf7l1表达抑制剂sirna和/或shrna，在用于tcf7l1的表达抑制时，干扰效果好，具有临床应用潜力。
26.4、本发明提供了一种通过新型tcf7l1的抑制表达情况来筛选腹主动脉瘤药物的全新思路和方法，tcf7l1可作为指导腹主动脉瘤治疗的新生物靶点。
附图说明
27.图1是在ang ii埋泵方法建立的aaa模型中，tcf7l1的表达上调。
28.图1a、1b是aaa成瘤率的统计；图1c、1d是超声测量的最大腹主动脉瘤直径；图1e、1f是he染色及弹力蛋白染色；图1g、1h是血管的免疫组化染色；图i、j是western blot结果及其统计图；图1k是real-time pcr检测结果（n=3，***p《0.001vs.saline组）。
29.图2为小鼠体内过表达tcf7l1加重aaa的发生。
canada）检测腹主动脉瘤的发生率及最大腹主动脉瘤直径，以主动脉局部扩张超过其相邻完整主动脉部分的50%定义为成瘤。
48.结果显示：angii组小鼠最大腹主动脉瘤直径明显高于生理盐水组（图1c、1d）。
49.4. he染色检测小鼠主动脉成瘤情况。
50.使用ang ii埋泵的方法建立小鼠腹主动脉瘤模型。分别收取生理盐水组及angii组埋泵28天小鼠的主动脉，进行he染色，具体步骤如下。
51.1)石蜡切片的制备。
52.a. 取材：将小鼠主动脉放置4%多聚甲醛溶液中过夜。
53.b. 脱水：按不同酒精浓度进行脱水分别为70%酒精2 h，80%酒精2 h，90%酒精2 h，95%酒精i 4 h，95%酒精ii中过夜，100%酒精i 1.5 h，100%酒精ii中1.5 h。
54.c. 透明：将组织块放入二甲苯i液中浸泡1 h，取出后放入二甲苯ii液中浸泡1 h。
55.d. 浸蜡：石蜡i中过夜，石蜡ii中放置1 h，石蜡iii放置1 h。
56.e. 包埋：使用石蜡对组织块进行包埋，室温放置。
57.f. 切片：用石蜡切片机对组织块进行切片，厚度为3 μm，并将切片贴于载玻片上。
58.g. 烘片及烤片：将载玻片在60℃烘片机上放置1 h后，再将载玻片放于65℃烤箱中，放置48 h。
59.2)切片脱蜡：按步骤分别将切片放置在下列试剂中，二甲苯i中20 min，二甲苯ii中20 min，95%酒精i中15 min，95%酒精ii中15 min，90%酒精10 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，最后置于蒸馏水中30 min。
60.3)细胞核染色：a.将切片浸入苏木素溶液20min。
61.b.将石蜡切片在1%盐酸中放置30 s，进行分化，流水冲洗。
62.c.将石蜡切片在氨水中放置30 s，进行细胞核返蓝，流水冲洗。
63.4)细胞质染色：将石蜡切片在水溶性伊红溶液中放置5 min，染色，流水冲洗。
64.5)透明：将石蜡切片按步骤放于下列试剂中，80%酒精5 min，90%酒精5 min，100%酒精i中5 min，100%酒精ii中5 min，二甲苯i中5 min，二甲苯ii中5 min。
65.6)封片：将石蜡切片放在通风橱里晾干，使用中性树脂对切片进行封片。
66.7)在显微镜下观察he染色结果并拍照留取图片。
67.结果显示：埋泵后28天后，angii组小鼠最大腹主动脉瘤直径较生理盐水组明显增大（图1e）。
68.5.弹力蛋白染色。
69.1)切片脱蜡：同he染色（步骤1、2）。
70.2)按照试剂盒verhoef van gibson elastic (h sigma, t25a)步骤进行血管弹力蛋白染色。
71.结果显示：埋泵后28天后，与生理盐水组相比，angii组小鼠血管有明显的弹性纤维的断裂（图1e、1f）。
72.6.免疫组织化学染色。
73.收取实验组和对照组小鼠的主动脉，进行tcf7l1免疫组织化学染色，具体操作步骤如下。
74.1)切片脱蜡：同he染色（步骤1、2）。
75.2)免疫组织化学染色。
76.a.抗原修复：切片浸泡入的抗原修复液中100度煮40min后降至室温。
77.b.将切片放在湿盒中，有组织一面的朝上，每张切片加入一滴或50μl过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10min后，pbs洗三次，每次10min。
78.c.去除pbs，每张切片加一滴或或50μl山羊血清，室温孵育0.5h。
79.d.除去血清，每张切片加50μl tcf7l1一抗（1:100 pbs稀释）4℃过夜。
80.e.常温下复温30min，pbs清洗三次，每次10min。
81.f.育10min后，pbs洗三次，每次10min。
82.g.去除pbs,每张切片加50μldab显色液。dab显色液20倍稀释。
83.h.苏木素溶液复染细胞核。
84.i. 将石蜡切片在1%盐酸中放置30 s，进行分化，流水冲洗。
85.j. 将石蜡切片在氨水中放置30 s，进行细胞核返蓝，流水冲洗。
86.k.脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
87.l. 在正置显微镜下观察染色结果并拍照保存图片。
88.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠vsmc分化指标α-sma和sm22α表达明显降低，tcf7l1表达明显上调（图1g、h）。
89.7. western blot方法检测腹主动脉瘤模型中tcf7l1表达情况。
90.为了明确tcf7l1在腹主动脉瘤中的作用，采用angii埋泵的方法建立小鼠腹主动脉瘤模型，利用western blot方法检测血管中tcf7l1的表达情况。分别收取实验组与对照组的血管，加入适量的蛋白裂解液，于冰上裂解30 min，每隔5 min颠倒混匀一次。4℃，12000 g，离心20 min，收集上清为细胞总蛋白。采用bca比色法试剂盒测定裂解液中的蛋白质浓度。使用蛋白裂解液，按终浓度为3 mg/ml进行稀释。再按比例加入5
×
上样缓冲液，充分混匀后，在100℃水浴条件下，煮沸5min，室温下12000 g，离心30s。在每个样品孔中加入蛋白样品20 μg，接通电源，开始电泳。按照如下电压和时间进行操作：100 v电压，30 min，120 v电压，60 min，待溴酚蓝电泳至玻璃板底部后关闭电源。以90v的电压将样品转印到pvdf膜上，时间为2 h。将pvdf膜放入5%牛奶封闭液1 h后加入一抗4℃孵育过夜。分别以1:1,000抗tcf7l1 (美国abcam公司)抗体、1：1000抗β-actin（美国cellsignalling公司）抗体作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠（或抗兔）抗体（美国cellsignalling公司）作为二抗，行western blot检测，用ecl试剂盒(美国amersham公司)发光显影。用tcf7l1抗体和β-actin抗体可分别检测到大小约为78kd和45kd的蛋白表达条带。采用imagej 1.51软件进行条带的灰度值测量并进行统计学分析。
91.结果显示：与生理盐水组相比，在angii组小鼠血管中，tcf7l1蛋白表达增加（图1i、1j）。
92.8.荧光实时定量pcr（real-time pcr）方法检测ang ii建立的小鼠腹主动脉瘤模型中tcf7l1表达情况。
93.1)血管组织rna的提取。
94.a.小鼠血管组织放入无 rnase的ep管中，加入1mltrizol，放入三个无 rnase的研磨珠，在组织研磨匀浆器中进行研磨180s,50hz。
95.b.放置于室温5min，加入1/5的三氯甲烷，之后将其上下颠倒混匀，静置15min。
96.c.12000rpm，4℃,离心15min。
97.d.吸取其上清，加入等体积的异丙醇后将其倒置混匀，室温下静置10 min。
98.e.12000rpm，4℃,离心15min，弃掉上清。
99.f.加1ml 75%乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀。
100.g.12000rpm，4℃,离心15min，弃掉上清。
101.h.室温晾干，透明即可。
102.i.加入25μl无酶水溶解rna。
103.2)rna逆转录为cdna使用takara逆转录试剂盒，将步骤1中提取的rna反转录合成cdna，具体如下：a.去除基因组dnab.逆转录反应 。
104.反应条件：37℃，15min ；85℃，5s；4℃保存。
105.3)引物序列。
106.。
107.4)荧光定量pcr。
108.。
109.按照上表的体积，配制 20μl qpcr反应体系，每组样本分别设置3个复孔。反应条件：95 ℃5 min，（95 ℃5 s，60 ℃ 30s，72 ℃30 s）
×
40个循环，72 ℃5 s，95 ℃15 s。采用2
－
△△
ct
法，分析每组样本的表达。
110.结果显示：与生理盐水组相比，在angii组小鼠血管中，tcf7l1转录水平增加（图1k）。
111.以上结果均显示，tcf7l1在腹主动脉瘤中表达上调，提示tcf7l1可能参与小鼠腹主动脉瘤发生发展的过程。
112.实施例2: 小鼠体内过表达tcf7l1加重aaa的发生。
113.1. apoe-/-小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司，饲养条件均同实施例1。
114.2.小鼠尾静脉注射腺相关病毒。
115.为了验证tcf7l1在体内对小鼠腹主动脉瘤形成的作用，aav-cmv-tcf7l1, 及其阴性对照aav-cmv-gfp均构建于上海和元生物技术有限公司。通过小鼠尾静脉注射3周的方法在体内过表达tcf7l1。
116.3.小鼠腹主动脉瘤模型的建立。
117.将尾静脉注射aav-cmv-tcf7l1,及其阴性对照的4组小鼠分别用angii埋泵的方法构建腹主动脉瘤模型，同实施例1。
118.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠成瘤率明显升高。4组小鼠的成瘤率见
图2a和2b。
119.4.超声成像测量最大腹主动脉直径，同实施例1。
120.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠最大腹主动脉瘤直径明显增加；与aav-cmv-gfp+angii组比aav-cmv-tcf7l1+angii组小鼠最大腹主动脉瘤直径增加的更加明显。4组小鼠的超声图像及最大腹主动脉瘤直径见图2c和2d。
121.5. he染色检测主动脉成瘤情况。
122.分别收取aav-cmv-gfp+saline、aav-cmv-gfp+angii、aav-cmv-tcf7l1+saline、和aav-cmv-tcf7l1+angii组小鼠埋泵28天后的主动脉，进行he染色。
123.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠血管明显增宽；与aav-cmv-gfp+angii组比，aav-cmv-tcf7l1+angii组小鼠增宽得更加明显（图2e、2f）。
124.6.弹力蛋白染色。
125.分别收取aav-cmv-gfp+saline、aav-cmv-gfp+angii、aav-cmv-tcf7l1+saline、和aav-cmv-tcf7l1+angii组小鼠埋泵28天后的主动脉组织，进行弹力蛋白染色。
126.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠血管的弹力纤维有明显断裂；与aav-cmv-gfp+angii组比，aav-cmv-tcf7l1+angii组小鼠断裂得更加明显（图2e、2f）。
127.7.免疫组织化学染色。
128.分别收取aav-cmv-gfp+saline、aav-cmv-gfp+angii、aav-cmv-tcf7l1+saline、和aav-cmv-tcf7l1+angii组小鼠埋泵28天后的主动脉组织，进行α-sma、sm22α、mmp2及tcf7l1的免疫组织化学染色。
129.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠血管中α-sma及sm22α的表达明显减少，mmp2的表达明显增加；与aav-cmv-gfp+angii组比，aav-cmv-tcf7l1+angii组小鼠α-sma及sm22α的表达减少得更加明显，mmp2的表达增加得更加明显（图2e、2f）。
130.8.western blot方法检测aav-cmv-gfp+saline、aav-cmv-gfp+angii、aav-cmv-tcf7l1+saline、和aav-cmv-tcf7l1+angii组小鼠vsmc分化指标α-sma、sm22α及金属基质蛋白酶mmp2的表达情况。
131.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠血管中α-sma及sm22α的表达明显减少，mmp2的表达明显增加；与aav-cmv-gfp+angii组比，aav-cmv-tcf7l1+angii组小鼠α-sma及sm22α的表达减少的更加明显，mmp2表达增加的更加明显（图2g、2h）。
132.实施例3：小鼠体内低表达tcf7l1延缓aaa的发生。
133.1.apoe-/-小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司。饲养条件均同实施例1。
134.2.小鼠尾静脉注射腺相关病毒。
135.通过shrna干扰技术敲低tcf7l1，shrna干扰靶序列：gagaagaacaggccaaata，shrna干扰实验中使用的shrna购自上海和元生物技术（上海）股份有限公司，具体步骤如下。
136.为了验证tcf7l1在体内对腹主动脉瘤形成的作用，aav-shtcf7l1及其阴性对照aav-sh-rna均构建于上海和元生物技术有限公司。通过小鼠尾静脉注射3周的方法在体内敲低tcf7l1。
137.3.小鼠腹主动脉瘤模型的建立。
138.将尾静脉注射aav-shtcf7l1,及其阴性对照的4组小鼠分别用angii埋泵的方法构建腹主动脉瘤模型，同实施例1。
139.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠成瘤率明显升高。4组小鼠的成瘤率如图3a、3b。
140.4.超声成像测量最大腹主动脉直径，同实施例1。
141.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠最大腹主动脉瘤直径明显增加；与aav-sh-rna+angii组比，aav-shtcf7l1+angii组小鼠最大腹主动脉瘤直径降低。4组小鼠的超声图像及最大腹主动脉瘤直径结果如图3c、3d。
142.5. he染色检测主动脉成瘤情况。
143.分别收取aav-sh-rna+saline、aav-sh-rna+angii、aav
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shtcf7l1+saline、和aav-shtcf7l1+angii组小鼠埋泵28天后的主动脉组织，进行he染色。
144.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠最大腹主动脉瘤直径明显增宽；与aav-sh-rna+angii组比，av-shtcf7l1+angii组小鼠最大腹主动脉瘤直径降低。4组小鼠的超声图像及最大腹主动脉瘤直径结果如图3c、3d。
145.6.弹力蛋白染色。
146.分别收取aav-sh-rna +saline、aav-sh-rna+angii、aav-shtcf7l1+saline、和aav-shtcf7l1+angii组小鼠埋泵28天后的主动脉组织，进行弹力蛋白染色。
147.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠血管的弹力纤维有明显断裂；与aav-sh-rna+angii组比，aav-shtcf7l1+angii组小鼠弹力纤维断裂有所缓解（图3e、3f）。
148.7.免疫组织化学染色。
149.分别收取aav-sh-rna +saline、aav-sh-rna +angii、aav-shtcf7l1+saline、和aav-shtcf7l1+angii组小鼠埋泵28天后的主动脉组织，进行α-sma、sm22α、mmp2及tcf7l1的免疫组织化学染色。
150.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠血管中α-sma及sm22α的表达明显减少，mmp2的表达明显增加；与aav-sh-rna+angii组比，aav-shtcf7l1+ angii组小鼠α-sma及sm22α表达增加，mmp2的表达降低（图3e、3f）。
151.8. western blot方法检测aav-sh-rna+saline、aav-sh-rna+angii、aav-shtcf7l1+saline、和aav-shtcf7l1+angii组小鼠血管平滑肌分化指标α-sma、sm22α及金属基质蛋白酶mmp2的表达情况。
152.结果显示：与生理盐水组相比，angii组小鼠血管中α-sma及sm22α的表达明显减少，mmp2的表达明显增加；与aav-sh-rna+angii组比，aav-shtcf7l1+ angii组小鼠α-sma及sm22α表达增加，mmp2的表达降低（图3g、3h）。
153.实施例4：tcf7l1在小鼠vsmc去分化过程中表达上调。
154.1.小鼠vsmc的分离与培养。
155.取5-6只8周龄的c57bl/6j雄性小鼠（购自于中国江苏集萃药康生物科技有限公司），小心剪下主动脉，保存在含有1
×
抗生素的冰的无菌pbs中，小心去除主动脉外膜。用眼科剪将中膜将组织条剪成约2mm长的小块。将主动脉中膜组织块重悬于3ml 0.15% ii型胶原酶消化液中，并将其转移到六孔板。将六孔板置于37℃，5%co2培养箱中消化2-3h后终止消化。将细胞悬液接种于1个6孔板中，每孔2 ml。在第3d时首次换液，去除未贴壁细胞或组织块。以后根据细胞生长情况每3～5 d换液1次。在100 mm培养皿中用含20%胎牛血清的dmem培养基（生长培养基）培养，待细胞生长密度达80%~90%融合时，进行细胞传代。第6-10
代细胞用于实验。
156.2.小鼠vsmc合成表型的诱导。
157.小鼠vsmc在100 mm培养皿中用含20%胎牛血清的生长培养基养，待细胞密度达到80%~90%时，加入浓度为1μm的angii 24h。
158.3. western blot方法检测小鼠vsmc去分化过程中tcf7l1表达情况。
159.提取angii组和pbs组vsmc中总蛋白，比较tcf7l1在vsmc去分化过程中的表达变化，具体方法同实施例1。
160.结果显示：angii组tcf7l1蛋白表达明显高于pbs组（图4a、4b）。
161.4.荧光实时定量pcr（real-time pcr）方法检测小鼠vsmc去分化过程中tcf7l1表达情况。
162.提取angii组和pbs组vsmc中总rna，比较tcf7l1在vsmc去分化过程中转录水平的表达变化，具体方法同实施例1。
163.结果显示：angii组tcf7l1转录水平表达明显高于pbs组（图4c）。
164.5.免疫荧光染色方法检测小鼠vsmc去分化过程中tcf7l1表达情况。
165.1)将无菌盖玻片置于24孔板中，每孔加入1 ml细胞悬液，制备细胞爬片。
166.2)待细胞密度达到80%~90%时，加入浓度为1μm的angii 24h。
167.3) 24h后pbs洗3遍，4%多聚甲醛固定10 min，pbs洗3遍。
168.4)0.1% triton x-100通透5 min，pbs洗3遍。
169.5)5%山羊血清封闭30 min。
170.6)将小鼠抗α-sma和sm22α一抗（1:100稀释）分别加到细胞爬片上，4℃孵育过夜。
171.7)pbs洗3遍，将山羊抗小鼠荧光二抗（1：100）加到细胞爬片上，室温避光孵育30 min。
172.8)pbs洗3遍，用0.5
ꢀµ
g/ml dapi染核1 min。
173.9)pbs洗3遍，防淬灭荧光封片剂封片。
174.10)正置荧光显微镜（德国蔡司）下观察染色情况并拍照。
175.结果显示：angii组tcf7l1表达明显高于pbs组（图4d）。
176.实施例5：tcf7l1低表达促进vsmc分化。
177.1. tcf7l1低表达小鼠vsmc模型的建立。
178.通过sirna干扰技术敲低tcf7l1，sirna干扰靶序列：gagaagaacaggccaaata，sirna干扰实验中使用的sirna购自广州锐博技术有限公司，具体步骤如下。
179.为了制备低表达tcf7l1小鼠vsmc，将细胞铺至六孔板中，等细胞长到70%-80%时进行sirna转染。将每孔加入0.5ml opti-mem 培养基,应用lipofectamine rnaimax转染试剂将sicontrol和sitcf7l1（干扰靶序列：gagaagaacaggccaaata）转染至小鼠vsmc中。37℃、5％co2细胞培养箱中培养4-6h，然后将6孔板中换成含20%胎牛血清和1%抗生素的dmem培养基，继续培养24h可用于实验。
180.2. western blot检测tcf7l1低表达对小鼠vsmc分化标志物α-sma和sm22α及金属基质蛋白酶mmp2表达的影响，具体方法同实施例1。
181.结果显示：与sicontrol组比，sitcf7l1组α-sma和sm22α表达明显升高，mmp2明显降低（图5a、5b）。
182.3.real-time pcr检测tcf7l1低表达对小鼠vsmc分化标志物α-sma和sm22α表达的影响，具体方法同实施例1。
183.结果显示：与sicontrol组比，sitcf7l1组的α-sma和sm22α转录水平明显升高，mmp2明显降低（图5c）。
184.4. transwell方法检测低表达tcf7l1对小鼠vsmc迁移的影响。
185.1)将转染sitcf7l1和sicontrol小鼠vsmc种到transwell小室的上室（约2.5
×
104个），将上室培养基换成无血清。
186.2)下室加入500μl 10%血清的培养基。
187.3)培养24h,后将上室细胞清洗后用4%多聚甲醛固定。
188.4)将上室细胞用0.1%结晶紫溶液（索莱宝，中国北京）在室温下染色20min。
189.5)在40倍放大的显微镜拍照并计算10个随机视野中的细胞数量来量化迁移的细胞数量。
190.结果显示：与sicontrol组比，sitcf7l1可以抑制小鼠vsmc的迁移（图5d、5e）。
191.实施例6：tcf7l1过表达抑制vsmc分化。
192.1. tcf7l1过表达小鼠vsmc模型的建立。
193.为了制备过表达tcf7l1小鼠vsmc，将细胞铺至六孔板中，等细胞长到70%-80%时，将含有tcf7l1过表达载体的质粒（pcdna3.1-tcf7l1）添加到小鼠vsmc中感染，带有flag标签的质粒（pcdna3.1-flag）作为对照，用lipofectamine 2000 （invitrogen，usa）感染24h后可用于实验。质粒构建于上海和元生物公司。
194.2.western blot检测tcf7l1过表达对小鼠vsmc分化标志物α-sma和sm22α及金属基质蛋白酶mmp2表达的影响，具体方法同实施例1。
195.结果显示：与pcdna3.1-flag比，pcdna3.1-tcf7l1组α-sma和sm22α表达明显降低，mmp2明显升高（图6a、6b）。
196.3.real-time pcr检测tcf7l1过表达对小鼠vsmc分化标志物α-sma和sm22α表达的影响，具体方法同实施例1。
197.结果显示：与pcdna3.1
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flag组比，pcdna3.1-tcf7l组的α-sma和sm22α表达明显降低，mmp2明显升高（图6c）。
198.4.transwell方法检测过表达tcf7l1对小鼠vsmc迁移的影响，具体方法同实施例5。
199.结果显示：与pcdna3.1-flag组比，pcdna3.1-tcf7l1促进小鼠vsmc的迁移（图6d、6e）。