热灭活酪酸梭菌在作为和/或制备用于防治哮喘的产品中的应用

1.本发明涉及热灭活酪酸梭菌在作为和/或制备用于防治哮喘的产品中的应用，属于医药技术领域。


背景技术：

[0002][0003]
当前通过吸入性糖皮质激素、β肾上腺素受体激动剂、白三烯受体拮抗剂和茶碱等药物治疗可控制哮喘的症状，但并不能根治哮喘，且这些药物治疗时间长，具有一定的副作用，很大一部分患者均未能耐受，依从性差。即使按照《全球哮喘防治创议》方案规范化治疗，仍有约10%的哮喘患者不能有效控制。寻找有效的防治方案具有重要意义。
[0004]
大量流行病学研究显示，接触有益的微生物可减少哮喘的发生发展，可用于哮喘的防治。这些有益的微生物活菌或死菌主要通过呼吸道和消化道调节人体免疫功能，抑制哮喘的发生发发展。益生菌是一类摄入适当的量对宿主健康带来益处的微生物。大量研究发现：益生菌具有免疫调节和抗感染活性，可用于哮喘的防治。
[0005]
酪酸梭菌（拉丁学名：clostridium butyricum），又称：酪酸梭状芽孢杆菌，酪酸杆菌，酪酸菌，丁酸梭状芽孢杆菌，丁酸梭菌，丁酸杆菌，丁酸菌，是临床常用的益生菌，已有研究报道，酪酸梭菌具有抗哮喘功效，可用于哮喘的预防或治疗。酪酸梭菌和热灭活的酪酸梭菌均具有免疫调节功能，但热灭活的酪酸梭菌是否有抗哮喘功效尚不清楚，目前尚未见有关于热灭活酪酸梭菌在防治哮喘方面的相关研究报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供热灭活酪酸梭菌在作为和/或制备用于防治哮喘的产品中的应用，为哮喘的预防或治疗提供新的方案。
[0007]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明公开了热灭活酪酸梭菌在作为和/或制备用于防治哮喘的产品中的应用，所述的产品包括但不限于药物、保健品、肠内营养制剂、膳食补充剂。
[0008]
进一步的，本发明公开了热灭活酪酸梭菌在作为和/或制备用于防治哮喘的药物中的应用。在实际应用中，所述的热灭活酪酸梭菌可以作为单独制剂，也可以和其它药物配伍，加入适量药剂学上可接受的辅料，采用现有技术制成可药用的剂型。
[0009]
所述药物的剂型包括气雾剂、吸入剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。
[0010]
上述的热灭活酪酸梭菌在作为和/或制备用于防治哮喘的药物中的应用，在实际应用中，所述药物可制成微囊、微球、纳米粒、脂质体。
[0011]
本发明热灭活酪酸梭菌在作为和/或制备用于防治哮喘的药物中的应用，在实际应用中，给药方式包括呼吸道给药和消化道给药。
[0012]
本发明通过研究实验表明：1.雾化吸入热灭活酪酸梭菌、口服热灭活酪酸梭菌和口服酪酸梭菌活菌均可显著减少哮喘小鼠的肺部炎症，其中雾化吸入热灭活酪酸梭菌的效果最好。
[0013]
2. 雾化吸入热灭活酪酸梭菌、口服热灭活酪酸梭菌和口服酪酸梭菌活菌均可显著减少哮喘小鼠的气道黏液分泌，其中雾化吸入热灭活酪酸梭菌的效果最好。
[0014]
3.雾化吸入热灭活酪酸梭菌显著减少哮喘小鼠肺泡灌洗液（balf）中il-4的含量，增加ifn-γ的含量。
[0015]
4. 雾化吸入热灭活酪酸梭菌显著增加哮喘小鼠脾treg细胞的比例，减少th17细胞的比例和th17/treg细胞的比值。
[0016]
本发明的有益效果为：1、本发明通过试验证明：雾化吸入热灭活酪酸梭菌、口服热灭活酪酸梭菌和口服酪酸梭菌活菌均可显著减少哮喘小鼠的气道炎症和气道黏液分泌，其中雾化吸入热灭活酪酸梭菌的效果最好；雾化吸入热灭活酪酸梭菌可通过调节免疫细胞和细胞因子发挥抗哮喘作用；雾化吸入和口服热灭活酪酸梭菌均可应用于哮喘的预防或治疗。
[0017]
2、呼吸道免疫具有所需剂量少，免疫调节强，安全性高和耐受性好等优点，而消化道给药则具有简便、安全、经济等优点。本发明人研究发现：雾化吸入和口服热灭活酪酸梭菌均有抗哮喘作用，可应用于哮喘的预防或治疗，有利于对哮喘进行防控，值得进一步临床推广应用，具有较好的市场前景。
[0018]
3、本发明公开了热灭活酪酸梭菌在作为和/或制备用于防治哮喘的药物、保健品等产品中的应用，为安全有效的临床防治哮喘提供了新的途径和方案。而且相比于酪酸梭菌活菌，热灭活酪酸梭菌治疗哮喘的效果更加突出，具有显著性进步。此外，相比于酪酸梭菌活菌，热灭活的酪酸梭菌还具有安全可靠，无感染风险；稳定性佳，可标准化生产，存储方便，使用便捷，生物效价高等优点。
附图说明
[0019]
图1：肺泡灌洗液炎症细胞总数和嗜酸性粒细胞比例；图2：肺组织he染色；图3：肺组织pas染色；图4：肺泡灌洗液ifn-γ和il-4的浓度水平。
具体实施方式
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1. 材料与方法1.1材料：酪酸梭菌cgmcc no：0313-1由山东科兴生物制药股份有限公司提供；1.2实验方法1.2.1热灭活酪酸梭菌：先测定酪酸梭菌菌粉的含菌量，再称取一定重量的酪酸梭菌菌粉置于110kpa和121℃高温高压热灭活20分钟获得热灭活酪酸梭菌。自然冷却至室温后保存于-20℃。
[0021]
1.2.2热灭活酪酸梭菌菌液的准备：使用前，热灭活的酪酸梭菌加入磷酸盐缓冲液（pbs），将其配制成含菌量（未灭活前的含菌量）为5x108cfu/ml的混悬液。超声细胞破碎仪
40%的功率破碎4次促进溶解，每次超声持续时间15s，间隔20s。然后再加入pbs将其配成使用所需浓度。
[0022]
1.2.3实验动物分组：64只balb/c雄性小鼠随机分为8组，每组8只，分别为正常对照组（a组）、哮喘对照组（b组）、雾化吸入低剂量热灭活酪酸梭菌干预组（c组）、雾化吸入高剂量热灭活酪酸梭菌干预组（d组）、口服低剂量热灭活酪酸梭菌干预组（e组）、口服高剂量热灭活酪酸梭菌干预组（f组）、口服低剂量酪酸梭菌活菌干预组（g）和口服高剂量酪酸梭菌活菌干预组（h组）。
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1.2.4哮喘模型的建立：采用卵清蛋白（ova）致敏法，于实验第0、7、14天小鼠腹腔注射致敏液0.2ml(25μg ova +1mg氢氧化铝+200μl pbs液)。第21天起，将小鼠置于30cm x 20cm x 30cm雾化箱内，雾化吸入2% ova激发，每次30min，每天1次，连续7天，建立哮喘模型。
[0024]
1.2.5各组小鼠的干预：b、c、d、e、f、g和h组按上述方法建立哮喘模型。a组以pbs替代ova腹腔注射和雾化。c、d、e、f、g和h组在实验第0-13天进行药物干预，每天1次，连续14天。
[0025]
药物干预处理如下：c组予含1x107cfu的热灭活酪酸梭菌液20ml雾化吸入, 每次雾化30分钟；d组予含1x108cfu的热灭活酪酸梭菌液20ml雾化吸入, 每次雾化30分钟；e组每只小鼠每天予含1x107cfu的热灭活酪酸梭菌液0.2ml灌胃；f组每只小鼠每天予含1x108cfu的热灭活酪酸梭菌液0.2ml灌胃；g组每只小鼠每天予含1x107cfu的酪酸梭菌活菌液0.2ml灌胃；h组每只小鼠每天予含1x108cfu的酪酸梭菌活菌液0.2ml灌胃。
[0026]
1.2.6 balf炎症细胞和分类计数：末次激发24小时内处死小鼠，balf行炎症细胞总数和分类计数。
[0027]
1.2.7 肺组织病理染色和评分：左肺组织行he染色和pas染色。根据细支气管周围炎症细胞浸润程度进行气道炎症评分：无炎症细胞浸润，0分；少量炎症细胞浸润，1分；有1层炎症细胞浸润，2分；有2-4层炎症细胞浸润，3分；超过4层炎症细胞浸润，4分；根据杯状细胞占细支气管上皮细胞的百分比进行pas评分：细支气管无杯状细胞，0分；0 《杯状细胞比例《 25%，1分；25% ≤杯状细胞比例≤ 50%，2分；50% 《杯状细胞比例≤ 75%，3分；75% 《杯状细胞比例，4分。
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1.2.8 elisa法检测balf中ifn-γ和il-4的浓度水平。
[0029]
1.2.9流式细胞术检测脾th17和treg细胞比例。
[0030]
2. 统计学方法：符合正态分布且方差齐的计量资料以表示，组内两两比较使用lsd检验；不符合正态分布的以中位数(四分位间距)表示，使用秩和检验分析。p《0.05为差异有显著性。与a组比较，*p《0.05；与b组比较，#p《0.05。
[0031]
3.结果3.1 行为症状改变：h组2只小鼠干预过程中出现腹泻，其余5组干预组小鼠未见明显不良反应；b组小鼠激发过程中出现哮喘发作样症状，6组药物干预组哮喘发作样症状均减轻。
[0032]
3.2 balf炎症细胞总数和细胞分类计数：与a组对比，b组小鼠的炎症细胞总数和嗜酸性粒细胞比例显著增加（p《0.05）；与b组对比，6组药物干预组炎症细胞总数和嗜酸性
粒细胞比例显著减少（p《0.05），其中雾化吸入高剂量热灭活酪酸梭菌干预组（d组）效果最好，见附图1。
[0033]
3.3肺组织病理观察：与a组对比，b组小鼠肺组织见气道周围大量的炎症细胞浸润和气道黏液分泌增加，气道炎症评分和pas评分显著增加（p《0.05）；与b组对比，6组药物干预组的气道炎症细胞浸润和气道黏液分泌均减少，气道炎症评分和pas评分均显著减少（p《0.05），其中雾化吸入高剂量热灭活酪酸梭菌干预组（d组）效果最好，见附图2、3和表1。
[0034] 3.4 balf中ifn-γ和il-4浓度水平：与a组对比，b组小鼠的ifn-γ浓度水平显著下降（p《0.05），il-4浓度水平显著增高（p《0.05）；与b组对比，雾化吸入高剂量热灭活酪酸梭菌干预组（d组）的ifn-γ浓度水平显著增高（p《0.05），il-4浓度水平显著下降（p《0.05），见附图4。
[0035]
3.5脾脏th17和treg细胞的比例：与a组对比，b组小鼠的th17细胞比例和th17/treg比值显著增加（p《0.05）；与b组对比，雾化吸入高剂量热灭活酪酸梭菌干预组（d组）的treg细胞显著增加（p《0.05），th17细胞比例和th17/treg比值显著减少（p《0.05），见表2。
[0036]
结论：雾化吸入热灭活酪酸梭菌、口服热灭活酪酸梭菌和口服酪酸梭菌活菌均可显著减少哮喘小鼠的气道炎症和气道黏液分泌，其中雾化吸入热灭活酪酸梭菌的效果最好；雾化吸入热灭活酪酸梭菌可通过调节免疫细胞和细胞因子发挥抗哮喘作用；雾化吸入和口服热灭活酪酸梭菌均可应用于哮喘的预防或治疗。