放射性核素标记的A7R多肽和DA7R多肽及其应用的制作方法

本发明属于生物医学，具体涉及靶向血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和神经纤毛蛋白-1(nrp-1)的a7r多肽和da7r多肽，经放射性核素标记后得到的核医学分子探针或治疗药物，在肿瘤诊断和治疗中的应用。

背景技术：

1、核医学技术利用放射性核素标记化学物质作为显像剂或放射性治疗药物引入生物体内，显示体内生理、生化过程或治疗疾病，以灵敏度高、无创、全面、疗效好等特点，成为当前应用于恶性肿瘤等重大疑难疾病诊断、分期、疗效、预后评估和治疗的最先进手段。核医学技术主要分为pet显像、spect显像和核素治疗，所用的放射性核素主要包括pet显像的18f、64cu和68ga，spect显像的99mtc和111in，以及核素治疗的131i、188re、90y和177lu等。

2、肿瘤新生血管在肿瘤的发生、发展和迁移中发挥极其重要的作用。血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和神经纤毛蛋白1(nrp-1)是促进肿瘤细胞增殖和迁移的两个重要分子，在多种肿瘤中有高表达，成为肿瘤诊断和治疗的重要靶点。目前已有多种核医学分子探针或放射性治疗药物，以肿瘤新生血管为靶点，用于肿瘤的显像和治疗。

3、a7r多肽(atwlppr)是经噬菌体展示技术筛选出能够特异性结合vegfr2和nrp-1的小分子多肽。目前已有多种a7r多肽的修饰物，如荧光素、药物或应用高分子载体材料构建的递药系统等，已被用于vegfr2和nrp-1高表达肿瘤的显像和治疗研究。尽管a7r多肽在靶向vegfr2和nrp-1方面显示出重要潜力，但现有的以a7r为靶向多肽构建的肿瘤显像和治疗体系中，在核医学方面的研发还没有得到足够重视，未有相关核医学显像剂或放射性治疗药物的报道。针对上述存在的问题，本发明提供放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽及其在肿瘤显像和治疗中的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：提供放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽。

2、本发明的再一目的在于：提供所述放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽在肿瘤显像和治疗中的应用。

3、具体涉及为a7r多肽和da7r多肽构建的核医学分子探针或治疗药物，所述核医学分子探针或治疗药物由a7r多肽或da7r多肽与双功能螯合剂和放射性核素得到，或由放射性核素直接标记a7r多肽或da7r多肽得到；所述a7r多肽氨基酸序列为atwlppr，da7r多肽为a7r多肽的d构型多肽，其氨基酸序列dadtdwdldpdpdr。本发明可用于血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和或神经纤毛蛋白-1(nrp-1)高表达肿瘤的诊断和治疗。

4、本发明的目的之一是提供放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽，是以放射性核素标记a7r多肽或da7r多肽得到，或先将a7r多肽或da7r多肽与双功能螯合剂偶联，再标记放射性核素得到。

5、进一步的是，所述双功能螯合剂选自hynic、dota或nota。

6、进一步的是，所述放射性核素选自131i、125i、111in、90y、177lu、188re、18f[alf]、68ga、64cu或99mtc。其中，111in和99mtc可用于核医学spect显像，肿瘤诊断；18f[alf]、68ga和64cu可用于核医学pet显像，肿瘤诊断；131i、125i、90y、177lu和188re可用于核医学核素治疗，肿瘤治疗。

7、本发明的目的之二是提供放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽的应用，所述应用包括在制备诊断血管内皮生长因子受体2(vegfr-2)和或神经纤毛蛋白1(nrp-1)高表达肿瘤显像剂中的应用；或在制备生物靶向治疗血管内皮生长因子受体2(vegfr-2)和或神经纤毛蛋白1(nrp-1)高表达肿瘤放射性药物中的应用。

8、本发明还包括所述放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽构建核医学分子探针或治疗药物在制备肿瘤显像或者治疗中的应用，即将所述放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽构建核医学分子探针或治疗药物应用于肿瘤显像或者治疗的药物中。

9、本发明的目的之三是提供一种用于诊断血管内皮生长因子受体2(vegfr-2)和或神经纤毛蛋白1(nrp-1)高表达肿瘤的显像剂，其含有本发明的上述放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽。

10、本发明的目的之四是一种用于生物靶向血管内皮生长因子受体2(vegfr-2)和或神经纤毛蛋白1(nrp-1)高表达肿瘤的放射性核素治疗药物，其含有本发明的上述放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽。

11、本发明还提供了上述放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽的制备方法，包括以下步骤：

12、(1) 配制a7r多肽或da7r多肽水溶液1 mg/ml，iodogen溶液1 mg/ml，放射性核素10-200 mci/ml；

13、(2) 20-100 μl a7r多肽或da7r多肽水溶液加入到含有iodogen涂层的离心管中，随后加入20-100 μl放射性核素，反应总体积控制200 μl以内，震荡反应30分钟；通过radio-hplc纯化，纯化后放射性化学纯度大于95％，即得；

14、其中，步骤(2)中所述含有iodogen涂层的离心管制作方法为：100 μl iodogen溶液置于5 ml玻璃离心管底部，真空泵抽30分钟致离心管底部形成iodogen膜，即得。

15、具体的，所述放射性核素选自131i或125i。

16、本发明还提供了上述放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽的第二种制备方法，包括以下步骤：

17、(1) 取a7r多肽或da7r多肽20 μmol溶于100 μl n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入双功能螯合剂 25 μmol，进行多肽修饰；室温反应4小时后，使用高效液相色谱仪(hplc)离纯化，冻干，最后经高效液相色谱-质谱联用仪(hplc-ms)鉴定，并确认其化学纯度大于95％；

18、(2) 配制步骤(1)所得双功能螯合剂修饰的a7r多肽或da7r多肽水溶液1 mg/ml，乙二胺二乙酸(edda)溶液20 mg/ml（0.1 m naoh溶液），tricine溶液40 mg/ml（0.2 m pbs，ph = 6.0），sncl2溶液1 mg/ml（0.1 m hcl溶液），放射性核素10-200 mci/ml；

19、(3) 20-100 μl双功能螯合剂修饰的a7r多肽或da7r多肽水溶液，与0.5 ml edda溶液和0.5 ml tricine溶液，再加入25μl sncl2溶液和0.5-1 ml 放射性核素，100 °c反应15分钟；反应结束，radio-hplc测定放射性化学纯度大于95％，即得。

20、具体的，步骤(1)中所述双功能螯合剂为hynic，所述的双功能螯合剂修饰的a7r多肽或da7r多肽为hynic-a7r或hynic-da7r。

21、具体的，步骤(2)中所述放射性核素选自99mtc或188re。

22、本发明还提供了上述放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽的第三种制备方法，其制备方法包括以下步骤：

23、(1) 取a7r多肽或da7r多肽20 μmol溶于100 μl n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入双功能螯合剂 20 μmol和二异丙基乙胺20 μmol，进行多肽修饰；室温反应2小时后，使用高效液相色谱仪(hplc)离纯化，冻干，最后经高效液相色谱-质谱联用仪(hplc-ms)鉴定，并其确认化学纯度大于95％；

24、(2) 配制步骤(1)所得双功能螯合剂修饰的a7r多肽或da7r多肽水溶液1 mg/ml，醋酸钠缓冲液0.1 m (ph = 4.8)，放射性核素10-200 mci/ml;

25、(3) 10-20 μl双功能螯合剂修饰的a7r多肽或da7r多肽水溶液，与40-65 μl醋酸钠缓冲液混合，0.5-1 ml放射性核素，85°c反应15-60分钟；反应结束，radio-hplc进行纯化，纯化后放射性化学纯度大于95％，即得。

26、具体的，步骤(1)中所述双功能螯合剂为dota或nota，所述的双功能螯合剂修饰的a7r多肽或da7r多肽为dota-a7r、nota-a7r、dota-ad7r或nota-da7r。

27、具体的，步骤(2)中所述放射性核素选自111in、90y、177lu、18f[alf]、68ga或64cu。

28、本发明中放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽的制备方法，可以通过本领域的常规手段制备获得。例如，采用固相合成方法制备a7r多肽或da7r多肽，双功能螯合剂hynic、dota或nota均为放射性药物领域常规应用，放射性核素从专业的公司购买。

29、本发明中，a7r多肽、da7r多肽、hynic、dota和nota结构式如下：

30、a7r多肽：其氨基酸序列atwlppr

31、。

32、da7r多肽：为a7r多肽的d构型多肽，其氨基酸序列dadtdwdldpdpdr。

33、hynic: 6-肼基烟酸

34、。

35、dota: 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸

36、。

37、nota: 2,2',2''-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基)三乙酸

38、。

39、使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜对放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽进行了靶向性定性和定量研究。cck-8实验评价了未标记放射性核素的a7r多肽和da7r多肽的细胞相容性。放射性核素标记a7r多肽和da7r多肽后，得到了核医学分子探针或治疗药物。建立裸鼠皮下肿瘤模型，进行spect显像实验，评价放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽的肿瘤显像效果。结果显示：本发明的a7r多肽和da7r多肽具备较好的肿瘤细胞特异性；未标记放射性核素的a7r多肽和da7r多肽具有良好的细胞相容性；放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽在皮下肿瘤中显示出良好靶向性和核医学显像效果，并且放射性核素标记的da7r多肽体内清除更快，在核医学诊断和治疗方面具有临床潜力。

40、本发明具备以下有益效果：

41、(1) 本发明提供了放射性核素标记的具有靶向肿瘤血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和神经纤毛蛋白-1(nrp-1)的a7r多肽和da7r多肽；

42、(2) 本发明提供的放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽，可在体内结合肿瘤血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和神经纤毛蛋白-1(nrp-1)，聚集在肿瘤组织，通过核医学诊断核素，实现肿瘤核医学显像目的；

43、(3) 本发明提供的放射性核素标记的a7r多肽和da7r多肽，也可通过核医学治疗核素，实现肿瘤核医学治疗目的。