1.本发明涉及一种促进损伤海绵体快速血管化的修复方法。
背景技术：
2.临床工作中遇到一些器官或组织损伤缺口大的病人，经常需要用到生物补片、支架、人工器官等生物材料进行辅助治疗，如疝囊修补片、心脏支架、骨固定钢板等已经得到了成功应用，但依然会面临一些组织器官供体不足、价格昂贵、排异反应大、愈合延迟及二次手术等问题。
3.目前，对于一些泌尿生殖道畸形、创伤、阴茎恶性肿瘤的病人，药物治疗效果都很有限，主要还是采用手术假体植入的方法，包括皮瓣或软骨结合人工假体重建阴茎等，但由于缺乏正常的海绵体组织，大部分患者阴茎术后的外形及勃起功能的恢复依然很不乐观。因此改善阴茎重建手术的关键在于研发出能够替代天然海绵体的人工合成材料，对材料的结构特点、促血管生成作用、力学性质均有特定的要求，既要满足海绵体的网状组织结构及特殊的舒张作用力，也要有丰富的血管窦生成，才能真正意义上实现阴茎勃起功能的恢复。
4.近年来，3d打印材料的快速发展为组织损伤的修复提供了新的治疗策略，个体化设计、可塑性强及稳定的持续降解等优点使其在临床工作中拥有着巨大的应用前景。水凝胶作为其中的代表，因独特的组织相似性、良好的生物相容性及优质的力学性质，被广泛应用于组织工程材料的研究，但面对血供丰富且结构功能特殊的阴茎海绵体损伤，依然缺乏合适的修复材料。
5.3d打印技术的快速发展，为阴茎海绵体打造合适的修复材料提供了更好的解决方案，基于此，本技术提出一种促进损伤海绵体快速血管化的修复方法。
技术实现要素：
6.本发明提供了一种促进损伤海绵体快速血管化的修复方法，以解决现有技术的不足。
7.为了实现上述目的，本发明提供了一种促进损伤海绵体快速血管化的修复方法，其包括以下步骤：
8.步骤1、建立海绵体损伤模型；
9.步骤2、根据所建立的海绵体损伤模型，采用3d打印制备多孔水凝胶支架；
10.采用明胶、透明质酸钠、光引发剂和超纯水配置作为3d打印的墨水，其中，明胶浓度占比10％-15％、透明质酸钠浓度占比1.5％-2.5％、光引发剂浓度占比0.1％-0.5％，其余为超纯水；
11.步骤3、在多孔水凝胶支架的表面修饰抗菌层和促血管生产层；
12.步骤4、选用肌源性干细胞(mdscs)作为靶细胞，通过慢病毒载体转染的方法得到携带突变型低氧诱导因子(mhif-1α)基因的mdscs细胞；
13.步骤5、将步骤3中所得到的多孔水凝胶支架与步骤4中所得到的突变型mdscs细胞
共培养，使突变型mdscs接种到多孔水凝胶支架，获得mdscs/多孔水凝胶支架协同修复材料；
14.步骤6、通过手术方式将mdscs/多孔水凝胶支架协同修复材料移植到损伤海绵体中，促进损伤海绵体的血管生成。
15.作为本发明的另一种具体实施方式，步骤2中的墨水配置为：明胶浓度占比10％、透明质酸钠浓度占比2％、光引发剂浓度占比0.5％，其余为超纯水。
16.作为本发明的另一种具体实施方式，光引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
17.作为本发明的另一种具体实施方式，步骤3中在多孔水凝胶支架的表面修饰抗菌层和促血管生产层的过程是：将多孔水凝胶支架先后浸泡于ε-多聚赖氨酸溶液和肝素钠溶液中，并重复多次，利用离子电荷作用结合实现层层自组装，得到具备多层聚赖氨酸和肝素表面修饰结构的水凝胶多孔支架材料。
18.作为本发明的另一种具体实施方式，ε-多聚赖氨酸溶液的浓度为1mg/ml，肝素钠溶液的浓度为10mg/ml。
19.作为本发明的另一种具体实施方式，多孔水凝胶支架在ε-多聚赖氨酸溶液中的浸泡时长为25min-35min，多孔水凝胶支架在肝素钠溶液溶液中的浸泡时长为25min-35min。
20.作为本发明的另一种具体实施方式，步骤4中慢病毒载体转染的过程是：
21.使用基础培养基增殖培养mdscs，细胞在6cm培养皿中增殖至30％～50％的密度；
22.用0.05％胰酶消化后，细胞计数，按照感染复数(moi)＝20配制4ml含病毒载体的培养基，并且加入浓度为5ug/ml的聚凝胺(polybrene)提高转染效率；
23.置于co2恒温培养箱中培养6～8小时后，使用pbs缓冲液轻轻冲洗，再更换为常规mdscs培养基继续培养。
24.作为本发明的另一种具体实施方式，所采用的基础培养基成分为：78.5％dmem/f12、10％胎牛血清、10％马血清、0.5％鸡胚提取物、1％双抗(青霉素-链霉素混合液)。
25.作为本发明的另一种具体实施方式，步骤5中所获得的mdscs/多孔水凝胶支架协同修复材料的过程为：
26.多孔水凝胶支架用完全培养基浸泡24h后置于24孔板中；
27.再将消化好的200ulmdscs细胞悬液按照1照悬液4/ml的密度均匀铺种在多孔水凝胶支架表面；
28.两小时后，再添加800ul的mdscs培养基；
29.隔天换液，连续培养7天，得到mdscs/多孔水凝胶支架协同修复材料。
30.作为本发明的另一种具体实施方式，步骤2中制备的多孔水凝胶支架的内部为仿生蜂窝状，孔隙大小为300um～500um。
31.本发明具备以下有益效果：
32.通过本发明方法所得到的mdscs/多孔水凝胶支架协同修复材料具有抗菌作用强、生物相容性良好、快速促血管生成的优点，对损伤的阴茎海绵体有强大的再生修复能力，促血管生成作用强，并且能够促进阴茎勃起功能的明显恢复，实现修复后可完成正常的生殖活动。
具体实施方式
33.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
34.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不限于下面公开的具体实施例的限制。
35.实施例1
36.本实施例提供了一种促进损伤海绵体快速血管化的修复方法，包括以下步骤：
37.步骤1、建立海绵体损伤模型；
38.步骤2、根据所建立的海绵体损伤模型，采用3d打印制备多孔水凝胶支架；
39.2.1)甲基丙烯酰化明胶(gelma)的制备:
40.将10g明胶溶解在100ml、50℃的dpbs溶液(平衡盐溶液)中，再将3ml甲基丙烯酸酐缓慢滴加至混合溶液中，50℃下继续剧烈搅拌反应2h，然后加入200ml、40℃的dpbs终止反应，将粗产物置于40℃的纯水、12～14kda的透析袋中透析一周，最后将透析完的溶液冷冻干燥，得到白色多孔海绵状固体即为gelma；
41.2.2)甲基丙烯酰化透明质酸(hama)的制备:
42.将4g透明质酸钠溶于300ml去离子水中，室温下搅拌直至充分溶解，再将10ml的甲基丙烯酸酐逐滴加入，用5mol/l的氢氧化钠溶液调节溶液ph至8-9之间，室温过夜后，先用冷乙醇结晶沉淀，再重新溶于少量纯水中，12～14kda的透析袋透析一周，最后将透析完的溶液冷冻干燥，得到海绵絮状的白色固体即为hama。
43.3.3)3d打印墨水的配置：
44.将合成的gelma、hama和光引发剂i2959分别按照10％、2％和0.5％的质量浓度(w/v)溶于超纯水中，混匀后除去气泡，即得到可直接作为3d打印的墨水。
45.3.4)hagelma多孔水凝胶支架的3d打印过程：
46.根据所建立的海绵体损伤模型，首先将通过电脑cad软件和3d max软件根据损伤部位需要设计打印支架的形状和内部孔洞结构，将图形导入3d-bioplottertm软件对图形进行分层。
47.打开打印机的控制氮气，将配制好的打印墨水装入打印料筒中，调控料筒温度为28打，打印平台温度为4打，选用22g、400mm粗细的打印针头，利用打印机低温挤出平台将打印出的hagelma水凝胶支架通过氢键作用初步固化维持形状，随后用紫外光交联3min进行二次固化成形，最终构建出连通多孔结构的hagelma多孔水凝胶支架。
48.步骤3、hagelma支架的层层自组装(lbl)：
49.分别配置浓度为10mg/ml的肝素钠溶液和1mg/ml的ε-多聚赖氨酸(ε-pll)溶液，然后将打印好的hagelma支架先浸泡于ε-pll溶液中30min，取出，超纯水清洗2遍，再浸泡在肝素钠溶液中30min，取出，超纯水清洗2遍，重复三遍前面两个步骤，在多孔水凝胶支架的表面修饰抗菌层和促血管生产层，得到具备多层聚赖氨酸和肝素表面修饰结构的多孔水凝胶支架材料(hagelma-hnp)。
50.步骤4、突变型低氧诱导因子(mhif-1α)病毒载体的构建：
51.选用肌源性干细胞(mdscs)作为靶细胞，通过慢病毒载体转染的方法得到携带突变型低氧诱导因子(mhif-1α)基因的mdscs细胞；
52.hif-1普遍存在于人和哺乳动物细胞内的转录激活因子，由hif-1α和hif-1β两种亚基组成，缺氧条件下hif-1α能够稳定表达，但常氧下合成的蛋白很快即被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解。本研究中的慢病毒载体中包装了mhif-1α基因，hif-1α基因的突变位点在第1204位碱基c
→
g(pro564区域)和第1690位碱基c
→
g(pro402区域)，突变后的hif-1α在低氧和常氧条件下均能稳定表达，并且能够持续促进其下游一系列靶基因(如vegf、vegfr1和r2、bfgf、pdgfb等)的转录，促进机体新生血管生成。
53.其中慢病毒转染mdscs细胞过程为：
54.选用mdscs作为靶细胞，使用培养基(78.5％dmem/f12+10％胎牛血清+10％马血清+0.5％鸡胚提取物+1％双抗)增殖培养mdscs，细胞在6cm培养皿中增殖至30％～50％的密度，用0.05％胰酶消化后，细胞计数，按照感染复数(moi)＝20配制4ml含病毒载体的培养基，并且加入浓度为5ug/ml的聚凝胺(polybrene)提高转染效率，置于co2恒温培养箱中培养6～8h后，pbs缓冲液轻轻冲洗2遍，再更换为常规mdscs培养基继续培养。
55.步骤5、肌源性干细胞(mdscs)与hagelma-hnp的共培养：
56.hagelma-hnp多孔水凝胶支架用完全培养基浸泡24h后置于24孔板中，再将消化好的200ulmdscs细胞悬液按照1照悬液4/ml的密度均匀铺种在水凝胶表面，2h后，再添加800ul的mdscs培养基，隔天换液，培养7天左右，荧光显微镜下可见mdscs在hagelma-hnp表面充分粘附和增殖，获得获得mdscs/多孔水凝胶支架协同修复材料；
57.步骤6、通过手术方式将mdscs/多孔水凝胶支架协同修复材料移植到损伤海绵体中，促进损伤海绵体的血管生成。
58.本实施例中采用大白兔进行试验和验证，具体过程如下：
59.选用温顺的新西兰大白兔，按照1ml/kg的剂量用3％的戊巴比妥钠麻醉兔子，常规备皮、消毒、铺巾后，用橡皮圈缠住兔子海绵体根部，再用动脉夹夹住皮圈，在右侧阴茎海绵体做一个5mm的纵切口，切开白膜后暴露海绵体，去除部分海绵体组织，迅速将mdscs/多孔水凝胶支架协同修复材料移植至阴茎海绵体缺损处并缝合。
60.建立同样的海绵体损伤模型，不放置修补材料，直接缝合白膜、筋膜及皮肤，作为对照组。
61.术后1个月，海绵体修复后的公兔与正常母兔同笼，记录同笼及新生小兔子日期；术后2个月及4个月用mri及icp等检测兔子阴茎海绵体的血管修复作用及勃起功能的恢复。
62.结果：实验组公兔与正常母兔同笼2个月后，即有新生小兔子出生，而对照组公兔与正常母兔同笼3个月后，依然未见小兔子出生，说明mdscs/水凝胶支架协同修复材料对促进海绵体修复的作用明显，并且损伤的海绵体能够恢复兔子的正常生理功能实现正常交配繁殖。
63.虽然本发明以较佳实施例揭露如上，但并非用以限定本发明实施的范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的发明范围内，当可作些许的改进，即凡是依照本发明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。