拉莫三嗪治疗孤独症触觉异常的应用

1.本发明属于孤独症的药物治疗领域，涉及hcn通道激动剂拉莫三嗪治疗孤独症触觉异常的应用。


背景技术：

2.孤独症谱系障碍，又称孤独症或自闭症，是一种严重的儿童发育障碍性疾病，发病率在全世界范围内持续攀升。孤独症是由包括遗传和环境病因导致的疾病，核心症状为社交异常和刻板行为。患者幼儿时期发病，伴随终身，对社会和家庭造成严重的经济和心理负担。
3.感觉障碍是孤独症患者除了社交行为障碍和刻板行为以外最主要的伴发症状之一。临床研究发现95％的孤独症患者会存在感觉异常症状(包括感觉过敏或低反应性)。60％的患者表现为触觉感受异常(即触觉异常)。临床研究报道孤独症患者会出现对触摸表现出夸张的反应、讨厌拥抱等表现(感觉过敏导致)；存在由于触觉异常诱发患者进行撞头、自咬等刻板样自残行为。同时有报道表明触觉异常反应程度与孤独症严重程度高度相关，患者婴幼儿期出现的触觉异常在一定程度上决定了患者未来社交行为障碍、刻板行为等缺陷的严重程度。因此治疗孤独症触觉异常对于孤独症患者的预后、生活质量的改善具有重要的意义。
4.孤独症患者所表现出的触觉异常与触觉丘脑-皮层活动的稳定密切相关，而超极化激活环核苷酸门控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels,hcn通道)对于丘脑神经元兴奋性、丘脑-皮层环路活动具有明确的调控作用，在维持丘脑-皮层环路正常电活动中发挥重要的作用。
5.拉莫三嗪(lamotrigine,ltg)是一种临床经典的抗癫痫药，在中枢神经系统中可以有效的激动hcn通道(贺嘉,朱雨岚,孙威,郑姣琳,勾海燕,陈岩.拉莫三嗪对ghb致失神发作大鼠脑内hcn1、hcn2表达的影响.现代生物医学进展,2016,16(03):423-426+418.doi:10.13241/j.cnki.pmb.2016.03.005.)。同时近年来也发现其可以在双相障碍急性期及维持期作为心境稳定剂来应用。
6.目前未见拉莫三嗪通过影响孤独症丘脑-皮层环路神经活动改善触觉异常的报道。另外，尽管有研究显示孤独症在热性惊厥相关性癫痫中伴随发生，例如存在伴孤独症的dravet综合症(ds)患者，但在临床上除治疗癫痫以外，对孤独症仅是给予心理干预措施(黎冰梅.热性惊厥相关性癫痫中的孤独症及其与精神运动发育迟滞和scn1a突变的相关性研究.广州医学院,2011.)。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供拉莫三嗪治疗孤独症触觉异常的应用。
8.为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
9.拉莫三嗪对小鼠丘脑神经元无毒性作用，能够增强孤独症小鼠模型丘脑神经元
hcn通道介导的ih电流；并且调控孤独症小鼠模型丘脑神经元膜电位、膜阻抗、树突整合功能异常；通过腹腔注射20mg/kg拉莫三嗪，能够在体降低孤独症小鼠模型丘脑神经元放电频率、簇样放电频率，并明显对孤独症小鼠模型胡须触觉过敏行为有改善作用，能够应用于治疗孤独症触觉异常。
10.本发明的有益效果体现在：
11.本发明依据实验中发现的拉莫三嗪缓解触觉过敏行为的作用，揭示了拉莫三嗪能够通过激活hcn通道治疗孤独症触觉异常，从而在治疗孤独症药物的制备中应用。
附图说明
12.图1为拉莫三嗪体外灌流前后孤独症小鼠模型vpm区丘脑-皮层投射神经元hcn通道功能对比；其中：a.膜片钳记录(slice recordings)hcn介导的ih电流；b.最大ih电流密度统计分析(***p《0.001)。
13.图2为拉莫三嗪体外灌流前后孤独症小鼠模型vpm区丘脑-皮层投射神经元的膜特性对比；其中：a.对膜片钳记录的神经元静息膜电位的统计(**p《0.01)；b.对膜片钳记录的神经元膜阻抗的统计(****p《0.0001)。
14.图3为拉莫三嗪体外灌流前后孤独症小鼠模型vpm区丘脑-皮层投射神经元树突整合能力对比；其中：a.光遗传学刺激下膜片钳记录的epsp；b.epsp整合统计分析。
15.图4为拉莫三嗪对孤独症小鼠模型vpm区丘脑-皮层投射神经元异常兴奋性增高的干预及结果；其中：a.拉莫三嗪腹腔注射及电生理记录流程；b.注射拉莫三嗪前(pre-injection)与注射拉莫三嗪后(ltg-injection)放电频率对比；c.注射拉莫三嗪及注射对照溶剂后放电频率降低水平统计分析(****p《0.0001)；d.注射拉莫三嗪及注射对照溶剂后簇样放电频率降低水平统计分析(****p《0.0001)。
16.图5为拉莫三嗪对孤独症小鼠模型触觉过敏行为的干预结果(**p《0.01)。
具体实施方式
17.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
18.(一)孤独症模型
19.shank3基因敲除小鼠(shank3 ko mice)为一种经典的孤独症小鼠模型，存在典型的社交行为障碍、刻板行为两种核心症状，同时伴发有胡须触觉过敏行为(即伴发触觉异常)。丘脑腹后内侧核vpm兴奋性异常增高是导致触觉丘脑-皮层环路异常的主要病理基础，也是致使孤独症小鼠模型出现胡须触觉过敏行为的关键改变。且shank3基因敲除小鼠hcn通道功能显著受损。下述实验以孤独症小鼠模型脑内hcn通道作为干预靶点，观察hcn通道激动剂拉莫三嗪对shank3基因敲除小鼠丘脑hcn通道功能、丘脑兴奋性及小鼠触觉过敏行为的影响，旨在揭示拉莫三嗪在孤独症触觉异常中的治疗作用和机理。
20.(二)拉莫三嗪对孤独症小鼠模型vpm区丘脑-皮层投射神经元hcn通道功能的作用
21.8-12周龄的同窝shank3基因敲除小鼠(简称ko；购自jackson lab，#017688)，用5％异氟烷迅速麻醉，剪开小鼠胸腔，而后将冰冷的切片液从心脏进行快速灌流冲血。断头取脑，迅速剥开颅骨，将鼠脑轻柔取出，在切片液中从背侧开始冠状振动切取脑片，保留含
有vpm区的脑片，脑片厚度300μm。将脑片转移至人工脑脊液(acsf)中孵育1.5小时后，准备开始膜片钳记录。在acsf灌流环境中，利用红外相差微分干涉显微镜低倍镜观察脑片，找到目的脑区的位置。利用膜片钳技术，记录小鼠vpm区神经元，在形成全细胞记录后，在电压钳下将细胞钳制在-60mv至-130mv超极化水平，每10mv为一梯度，持续3s的钳制以激活hcn通道介导的ih电流。电流大小为稳定状态的电流值(如图1a中ko+acsf所示)与超极化初始段电流值的差值，最大ih电流密度(maximal ih current density)为在-130mv记录到的最大电流幅度除以神经元电容值。在完成上述指标记录之后(约记录10分钟)，将终浓度100μm拉莫三嗪(ltg)加入acsf中，5分钟后重复记录(如图1a中+ltg所示)，观察比较拉莫三嗪灌注后对于最大ih电流密度的影响。
22.如图1a所示，浓度为100μm拉莫三嗪灌流5分钟后，相比于灌流前，vpm区丘脑-皮层投射神经元hcn通道介导的ih电流幅度明显增加。计算hcn通道介导的ih电流密度，如图1b所示，浓度为100μm拉莫三嗪灌流5分钟后，电流密度明显增加。以上对体外脑片灌流拉莫三嗪的实验结果说明，拉莫三嗪能够显著的增大孤独症小鼠模型hcn通道介导的ih电流，增强孤独症小鼠模型的hcn通道功能。
23.(三)拉莫三嗪对孤独症小鼠模型vpm区丘脑-皮层投射神经元的膜特性的影响
24.膜片钳记录方法同(二)，记录孤独症小鼠模型vpm区丘脑-皮层投射神经元的被动膜特性。在形成全细胞记录后，切换到电流钳模式，在无任何钳制的情况下，记录神经元的静息膜电位。另外在电流钳模式下，给予梯度电流注射，计算神经元膜阻抗。
25.如图2a所示，浓度为100μm拉莫三嗪灌流5分钟后，相比于灌流前，vpm区丘脑-皮层投射神经元的静息膜电位(rmp)向去极化方向变化，并存在统计学差异。如图2b所示，浓度为100μm拉莫三嗪灌流5分钟后，相比于灌流前，vpm区丘脑-皮层投射神经元的膜阻抗(rm)显著降低。以上对体外脑片灌流拉莫三嗪的实验结果说明，拉莫三嗪能够显著挽救孤独症小鼠模型神经元膜特性的异常，包括静息膜电位及膜阻抗的改变。
26.(四)拉莫三嗪对孤独症小鼠模型vpm区丘脑-皮层投射神经元树突整合能力的影响
27.光遗传学结合膜片钳记录：8-12周龄的同窝shank3基因敲除小鼠，先采用3％异氟烷进行气体麻醉，1.5％维持麻醉。将小鼠固定在立体定位仪上，按照图谱计算s1感觉皮层的坐标为(ap＝-1.55mm，ml＝2.50mm，dv＝1.2mm)。利用颅钻打孔，而后用尖端粘有玻璃电极的1μl微量注射器向s1感觉皮层内定位注射250nl的aav-hsyn-chr2-eyfp病毒(购自和元生物技术(上海)股份有限公司)，术后间隔3周开始进行电生理记录。膜片钳记录方法同(二)，利用微操将光纤下入水中，光纤尖端正对vpm区域，稍稍高于脑片高度。而后将记录电极靠近脑片，在光纤尖端正对位置进行寻找细胞记录。
28.如图3a所示，连续给予5次蓝光刺激(40hz)后，能够观察到连续五个叠加的epsp，浓度为100μm拉莫三嗪灌流5分钟后，相比于灌流前，叠加epsp峰值明显降低。通过测量epsp的峰值，并将第五个epsp的峰值除以第一个epsp的峰值进行计算整合比率(summation ratio)，发现浓度为100μm拉莫三嗪灌流5分钟后，相比于灌流前，整合比率明显降低(图3b)。以上对体外脑片灌流拉莫三嗪的实验结果说明，拉莫三嗪能够明显改善(抑制或降低)孤独症小鼠模型丘脑树突整合功能异常增高。
29.(五)拉莫三嗪腹腔注射对孤独症小鼠模型vpm区丘脑-皮层投射神经元兴奋性的
影响
30.将shank3基因敲除小鼠用3％异氟烷诱导进入麻醉状态，而后降低异氟烷浓度(1.5％)，使小鼠达到稳定的麻醉状态。将小鼠固定在立体定位仪上，而后暴露颅骨表面，在vpm区上方磨出颅窗后将电极埋植其中。动物手术后恢复1-2周，记录前3天开始将动物头部电极接口连接记录系统前端放大器，而后放在笼中适应20-30min。
31.如图4a所示，实验时动物连接前端放大器，设置放大器带宽为0.5-8000hz，放大为
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20000，数据采集频率为40khz。将原始信号进行滤波去除场电位的波段，滤波频率为250-8000hz。在记录时先将小鼠放入笼中适应两小时(2hr habatuation)，而后腹腔注射(i.p.injection)20mg/kg的拉莫三嗪或对照溶剂(1％二甲基亚砜生理盐水溶液)，半小时后进行在体(in vivo)记录vpm区神经元活动。
32.如图4b和图4c所示，注射20mg/kg拉莫三嗪相较于注射对照溶剂，神经元放电频率(firing rate,fr)明显降低，且如图4d所示，高频率的簇样放电(br)数目也明显减少。以上结果提示拉莫三嗪能够抑制孤独症小鼠模型vpm区丘脑-皮层投射神经元异常增高的放电频率，降低异常兴奋性增高。
33.(六)拉莫三嗪腹腔注射对孤独症小鼠模型触觉过敏行为的影响
34.对shank3基因敲除小鼠及野生型小鼠(无过敏行为的正常小鼠)进行胡须探索实验(whisker-guided exploration,wge)，实验装置由八边形实验容器(80cm
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60cm
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60cm，容器包含两种不同摩擦系数的墙壁)、摄像系统和smart 3.0软件分析系统三部分组成。实验开始前1天，将实验动物转移至行为实验室中适应2h，而后将实验动物放入该实验装置中自由探索5min，使其适应新环境；测试当天，在几乎黑暗的灯光下(1lux)将实验动物注射拉莫三嗪或对照溶剂，间隔半小时后放入该实验装置中自由探索10min，并录像分析，通过分析实验动物在不同摩擦系数墙壁区域停留的时间占比(触觉分辨指数，discrimination score)，来检测实验动物的触觉敏感性。
35.如图5所示，注射对照溶剂组的shank3基因敲除小鼠(ko+veh)与野生型小鼠(wt+veh)相比，对于不同摩擦系数环境的触觉分辨指数明显增高，提示孤独症小鼠模型存在着触觉过敏的行为异常。注射20mg/kg拉莫三嗪组的shank3基因敲除小鼠(ko+ltg)相较于注射对照溶剂组的shank3基因敲除小鼠，触觉分辨指数明显降低，且与上述野生型小鼠无明显差异。以上统计结果说明拉莫三嗪能够有效的改善孤独症小鼠模型的胡须触觉过敏行为。
36.总之，本发明通过实验发现了拉莫三嗪能够明显纠正负责shank3基因敲除小鼠胡须触觉信息传递的丘脑腹后内侧核神经元hcn通道的异常，进而影响神经元静息膜电位、膜阻抗、树突整合能力。本发明通过实验进一步发现了拉莫三嗪通过抑制丘脑-皮层环路异常兴奋发挥缓解shank3基因敲除小鼠触觉过敏行为的作用。这些实验结果揭示了hcn通道激动剂拉莫三嗪可应用于治疗孤独症(例如治疗孤独症触觉异常)的药物的制备。