一种棘胸蛙皮制品的制备方法及应用与流程

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种棘胸蛙皮制品的制备方法及应用。


背景技术：

2.棘胸蛙，隶属蛙科、棘蛙属，俗称石蛙、石鸡等，因其肉质细腻且富含丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸，以及钙、磷、铁和多种维生素，被美食家称为“百蛙之王”，具有滋补强身、清心润肺、健肝胃、补虚损，以及解热毒、治疳疾等功效。目前棘胸蛙多以散装形式出售，且以生鲜为主，加工程度低，棘胸蛙功能活性评价以及高附加值的功能性食品研发滞后。


技术实现要素：

3.为解决上述问题，本发明的实施例提出了一种棘胸蛙皮制品的制备方法，其包括以下步骤：
4.将棘胸蛙皮洗净，去除血管、筋膜，烘干，剪成碎片；
5.向棘胸蛙皮碎片加水，超声破碎处理，得到棘胸蛙皮浑浊液；
6.将棘胸蛙皮浑浊液调ph和温度，加入木瓜蛋白酶酶解4h，灭酶，离心取上清，冷冻干燥，得到棘胸蛙皮制品。
7.根据本发明实施例的一种棘胸蛙皮制品的制备方法，该方法将棘胸蛙皮用木瓜蛋白酶酶解处理，可获得具有抗氧化能力的棘胸蛙皮制品。
8.可选地，还包括：将所述棘胸蛙皮制品经体外模拟胃肠液消化处理。由此，可提高棘胸蛙皮制品的抗氧化能力。
9.可选地，棘胸蛙皮碎片与石油醚的料液比为1:4。
10.可选地，超声破碎处理时，超声破碎30s，停5s，共破碎处理15min。
11.可选地，木瓜蛋白酶的加入量为1％。
12.可选地，包括：将模拟胃液，于37℃预热15min后，加入棘胸蛙皮制品，混匀，37℃振荡反应2h，加入200mm酸钠溶液终止反应，得到模拟胃液消化后的反应液；向模拟胃液消化后的反应液加入模拟肠液，37℃振荡反应6h，30％的醋酸溶液终止反应。
13.根据本发明的实施例，本发明还提出上述的制备方法制得的棘胸蛙皮制品。该棘胸蛙皮制品具有较好的抗氧化能力，可实现棘胸蛙高附加值的综合利用。
14.根据本发明的实施例，本发明还提出上述的棘胸蛙皮制品在制备抗氧化剂中的应用，以实现棘胸蛙高附加值的综合利用。
15.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
16.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或
多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
17.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
18.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
19.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
20.实施例1
21.预处理:将棘胸蛙皮经超纯水清洗，去除血管、筋膜等，37℃烘干，剪成小碎片。
22.超声破碎：将预处理后的棘胸蛙皮按照1:40的料液比加水，超声破碎30s，停5s，共破碎处理15min。
23.酶解处理：将破碎好的棘胸蛙皮浑浊液，将ph调至7.5及温度调为55℃后，加入1％的木瓜蛋白酶，酶解4h后，沸水浴灭酶，离心(4℃、10000r/min、10min)取上清，冷冻干燥(-80℃、72h)，得到棘胸蛙皮酶解产物。
24.实施例2
25.模拟胃液消化
26.模拟胃液的配置主要参照美国药典方法，取2.0g氯化钠和3.2g胃蛋白酶(其活力为3000u/mg)，加7.0ml盐酸和水使溶解至1000ml，即得。该溶液ph值应为1.2。取2ml配置的模拟胃液于玻璃试管中，37℃预热15min，将10mg样品(实施例1的棘胸蛙皮酶解产物)加入试管中混匀，胃蛋白酶与样品的比例为1:50(w/w)，37℃振荡反应2h，取100μl反应液至1.5ml离心管中，加入30μl 200mm酸钠溶液终止反应，于-20℃冰箱中冻存。
27.模拟肠液消化
28.模拟肠液的配置主要参照美国药典方法，取磷酸二氢钾6.8g，加水250ml使溶解，加0.2mol/l氢氧化钠溶液77ml和500ml水，再加胰蛋白酶10g使溶解后，用0.2mol/l氢氧化钠溶液或0.2mol/l盐酸溶液调节ph值至6.8，再加水稀释至1000ml，即得。取经过模拟胃液消化2h后的反应液，按照胰蛋白酶与样品的比例为1:50(w/w)加入模拟肠液，37℃振荡反应6h，加入五分之一反应液体积的醋酸溶液(30％)终止反应，于-20℃冰箱中冻存。
29.试验例
30.棘胸蛙皮酶解物提取率：提取率的计算公式如下：
[0031][0032]
棘胸蛙皮酶解物蛋白检测：采用凯氏定氮法(gb 5009.5-2016)；
[0033]
式中：m1—棘胸蛙蛙皮酶解冻干粉的质量(mg)、m2—棘胸蛙蛙皮鲜重的质量(mg)。
[0034]
结果如表1所示，利用木瓜蛋白酶对棘胸蛙皮在适宜的温度及ph值下进行酶解，提
取率为92％。
[0035]
表1棘胸蛙皮酶解产物提取率及其蛋白含量
[0036] 棘胸蛙皮酶解产物提取率92％蛋白含量(g/100g)16.7％
[0037]
dpph自由基清除率
[0038]
将棘胸蛙皮酶解产物(实施例1)与棘胸蛙皮酶解产物体外消化后的产物(实施例2)分别配置成浓度为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、10mg/ml的溶液；阳性对照(vc)配置成浓度为0.001mg/ml、0.005mg/ml、0.025mg/ml、0.125mg/ml、0.625mg/ml的溶液。准确称取4mg dpph溶解在95％乙醇溶液中，配置成0.1mmol/l的dpph工作液。将不同浓度的样液取100μl分别加入100μl的dpph工作液中，震荡混匀后避光反应30min，以vc作为阳性对照，在517nm处测定吸光值(a1)；样品空白对照以超纯水代替样品，测定吸光值(a0)；样品对照以95％乙醇代替dpph溶液，测定吸光值(a2)。
[0039][0040]
结果如表2和表3所示，实验结果表明，棘胸蛙皮酶解产物的dpph自由基ic
50
为4.23mg/ml。棘胸蛙皮酶解产物经胃液消化2h，dpph自由基ic
50
为3.08mg/ml，经肠液消化6h，dpph自由基ic
50
为2.88mg/ml，经体外模拟胃肠液消化后的酶解产物的抗氧化活性提高，且最高提高了4.91％。
[0041]
表2.棘胸蛙皮酶解产物dpph自由基清除率ic
50
(mg/ml)
[0042][0043]
表3.棘胸蛙皮酶解产物及模拟胃肠液消化后产物dpph自由基清除率
[0044][0045]
还原力测定
[0046]
将棘胸蛙皮酶解产物(实施例1)与棘胸蛙皮酶解产物体外消化后的产物(实施例2)分别配置成浓度为10mg/ml的溶液。取100μl的样液与250μl的0.2m磷酸盐缓冲溶液(ph 6.6)和250μl的1％铁氰化钾溶液混合，震荡摇匀，置于50℃的恒温水浴锅中水浴30min。水浴结束后，加入250μl的10％(w/v)三氯乙酸，将混合物离心(3000rpm/min、10min)，取250μl上清液与250μl的蒸馏水、50μl 0.1％(w/v)三氯化铁混合，避光反应10min，在700nm处测定溶液的吸光值，以vc(1mg/ml)作为阳性对照。计算公式如下：
[0047]a总还原力
＝a
样品-a
空白
[0048]
结果如表4所示，棘胸蛙粉经胃肠液消化后，其体外消化后产物的还原力相较酶解产物的还原力高。
[0049]
表4棘胸蛙皮酶解产物及模拟胃肠液消化后产物还原力
[0050][0051]
超氧阴离子自由基清除实验
[0052]
将棘胸蛙皮酶解产物(实施例1)与棘胸蛙皮酶解产物体外消化后的产物(实施例2)分别配置成浓度为5mg/ml的溶液；阳性对照(vc)配置成浓度为0.025mg/ml的溶液。取2.50ml、50mmol
·
l-1
的磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph＝8.34)，加入2ml样品溶液，再加入0.25ml的邻苯三酚(10mmol
·
l-1
)，在25℃下保温4min，加入10mo
·
l-1
hcl 1滴，终止反应；用相同的样品液为参比，在波长325nm处测其吸光度值，得到样品的吸光度值(a1)。用蒸馏水代替样品溶液，加入与测试样品相同的其它试剂，以ph＝8.34的pbs溶液做参比，在波长325nm处测其吸光度值，得到空白吸光度值(a0)。计算超氧阴离子的消除率的公式如下：
[0053]
超氧阴离子清除率(％)＝(a0-a1)/a0
×
100％
[0054]
结果如表5所示，棘胸蛙粉经胃肠液消化后，其体外消化后产物对超氧阴离子自由
基的清除率高于棘胸蛙皮酶解产物。
[0055]
表5棘胸蛙皮酶解产物及模拟胃肠液消化后产物超氧阴离子自由基清除率
[0056][0057][0058]
综上，根据本发明的实施例，棘胸蛙皮的木瓜蛋白酶酶解产物具有抗氧化能力，且经体外模拟胃肠液消化后的酶解产物的抗氧化活性逐渐提高，可实现棘胸蛙粉高附加值的综合利用。
[0059]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
[0060]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。