葫芦素B在抗结膜黑色素瘤中的应用

葫芦素b在抗结膜黑色素瘤中的应用
技术领域
1.本发明属于生命科学和医药领域，具体地涉及葫芦素b在抗结膜黑色素瘤中的作用机制及应用。


背景技术：

2.结膜黑色素瘤是一种罕见但严重危害人类健康且可能致命的眼部肿瘤，占所有眼部恶性肿瘤的2％，其在西方国家的年发病率为0.2-0.5/百万，亚洲人发病率为0.15/百万。结膜黑色素瘤多继发于结膜色素痣及结膜原发性获得性黑变病的恶变，可发生于眼部结膜的任何部位，并迅速向眼部其它结构转移，还可转移浸润至耳、鼻、颈、肺、肝、皮肤甚至大脑。结膜黑色素瘤在临床经局部手术治疗后常辅以冷冻治疗、放射治疗及丝裂霉素c和重组人干扰素α-2b的化学治疗，但眼部这一特殊病灶组织具有严重的递药困境，导致药物治疗预后较差，且5年复发率高达26％-61％。
3.结膜黑色素瘤患病人群极少、发病机制极其复杂、潜伏周期较长，导致临床诊断和治疗困难。遗憾的是，尽管其与皮肤、粘膜的黑色素瘤存在一定相似性，目前还没有用于预测或诊断结膜黑色素瘤的生物标志物，也尚无有效的临床治疗药物或达成共识的治疗方案。
4.因此，开展结膜黑色素瘤的新药研发有助于填补相应药物研发领域的空白，具有显著的治疗价值和社会意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种抑制结膜黑色素瘤的化合物或含有所述化合物的制剂及其作用机制。
6.具体地，本发明提供了通式(i)所示的葫芦素b(cub)、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其前药在抗结膜黑色素瘤方面的作用机制和应用。即葫芦素b通过直接靶向grp78/bip蛋白，从而抑制foxm1-plk1-kif20a信号通路，并下调该信号通路下游的cdk1-cyclinb1周期蛋白的表达，诱导肿瘤细胞周期g2/m期阻滞，进而抑制结膜黑色素瘤的生长，为结膜黑色素瘤的治疗提供崭新的机制和方法。
7.在本发明的第一方面，提供了一种如式(i)所示的葫芦素b、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物或前药的用途；
[0008][0009]
其特征在于，用于制备药物组合物，且所述的药物组合物用于选自下组的用途：治
疗和/或缓解结膜黑色素瘤，或抑制结膜黑色素瘤细胞增殖。
[0010]
在另一优选例中，所述的药物组合物还用于调节foxm1-plk1-kif20a信号通路。
[0011]
在另一优选例中，所述的药物组合物还用于下调foxm1的活性或表达量。
[0012]
在另一优选例中，所述的药物组合物还用于下调plk1的活性或表达量。
[0013]
在另一优选例中，所述的药物组合物还用于下调kif20a的活性或表达量。
[0014]
在另一优选例中，所述的药物组合物还用于调节周期相关蛋白cdk1-cyclinb1。
[0015]
在另一优选例中，所述的药物组合物还用于下调该信号通路下游的cdk1-cyclinb1周期蛋白的表达。
[0016]
在另一优选例中，所述的药物组合物还用于诱导肿瘤细胞周期g2/m期阻滞。
[0017]
本发明的第二方面，提供了一种式(i)所示的葫芦素b、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物或前药的用途；
[0018][0019]
其特征在于，用于制备药物组合物，且所述的药物组合物用于下调grp78蛋白的活性或表达量。
[0020]
在另一优选例中，所述的药物组合物还用于调节foxm1-plk1-kif20a信号通路。
[0021]
本发明的第三方面，提供了一种治疗和/或缓解结膜黑色素瘤的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的式(i)所示的葫芦素b、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其前药：
[0022][0023]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0024]
图1是葫芦素b的结构式。
[0025]
图2是使用流式细胞仪分析葫芦素b(cub)和mek162对crmm2细胞周期和凋亡的影响，显示葫芦素b能够有效引起细胞的g2/m期阻滞，并引起细胞的凋亡。
[0026]
图3是不同浓度葫芦素b(cub)对结膜黑色素瘤细胞cm-as16、crmm1、crmm2、cm2005.1和正常细胞hl7702的foxm1-plk1-kif20a信号通路及周期相关蛋白的抑制作用图
像。
[0027]
图4a是grp78蛋白与不同浓度的葫芦素b的结合曲线。
[0028]
图4b是测试grp78 atpase活性的吸光值图，表明葫芦素b(cub)能够抑制grp78 atpase的活力。
[0029]
图5目是目标蛋白foxm1、plk1、kif20a、cyclinb1及cdk1表达情况的检测图像，表明grp78敲减减少了foxm1、plk1、kif20a、cyclinb1及cdk1蛋白的表达。
[0030]
图6a是mek162(灌胃)给药与葫芦素b(cub)注射给药后，小鼠肿瘤体积随时间变化的趋势图，显示出葫芦素b给药显著减小了ncg小鼠体内结膜黑色素瘤的体积。
[0031]
图6b是mek162(灌胃)给药与葫芦素(cub)注射给药后，小鼠体重随时间变化的趋势图，显示出葫芦素b对小鼠体重没有明显影响。
具体实施方式
[0032]
本发明人经过广泛而深入的研究，尝试了一千四百余种已知抗肿瘤药物，首次意外发现了一类可有效抑制抗结膜黑色素瘤的活性成分，即式(i)所示的葫芦素b、或其药学上可接受的盐、或其溶剂化物、或其前药。实验表明，葫芦素b通过直接靶向grp78/bip蛋白，从而抑制foxm1-plk1-kif20a信号通路，并下调该信号通路下游的cdk1-cyclinb1周期蛋白的表达，诱导肿瘤细胞周期g2/m期阻滞，进而抑制结膜黑色素瘤的生长。在此基础上完成了本发明。
[0033]
治疗结膜黑色素瘤的活性成分
[0034]
在本发明中，提供了一种可以抑制结膜黑色素瘤的活性成分。该活性成分为葫芦素b，如式(i)所示。
[0035][0036]
实验表明，本发明的活性成分葫芦素b通过直接靶向grp78/bip蛋白，从而抑制foxm1-plk1-kif20a信号通路，并下调该信号通路下游的cdk1-cyclinb1周期蛋白的表达，诱导肿瘤细胞周期g2/m期阻滞，进而抑制小鼠皮下移植瘤的生长。
[0037]
如本文所用，“活性成分”、“本发明的活性化合物”、“本发明的活性成分”可互换使用，均指的葫芦素b及其结构类似物。
[0038]
葫芦素b，分子式是c
32h46
o8，是天然存在的四环三萜类化合物。萜类化合物(terpenoid)是一种以异戊二烯为基础结构单元，以侧链重复的方式递增，从而形成的化合物及其衍生物的总称，是植物次生代谢环节中的一个非常重要的家族。三萜类化合物(triterpenoid)是萜类化合物中的一类重要的成员，在自然界中广泛分布，主要存在于藤类、菌类、单子叶和双子叶植物中。三萜类化合物作为植物的次生代谢产物，大多数都具有防止病虫或者真菌对植物产生危害的作用。葫芦素b(cucurbitacin b)主要存在于葫芦科植物中，是葫芦素家族里的重要成员，具有广泛的药理活性。
[0039]
应理解，本发明的活性成分包括式(i)所示的四环三萜类化合物、或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体或外消旋体、或其前药。应理解，本发明的活性成分还包括式(i)化合物的晶型、无定形化合物、以及氘代化合物等形式。
[0040]
所述“药学上可接受的盐”为式(i)化合物与无机酸或有机酸反应形成常规的无毒盐。例如，常规的无毒盐可通过式(i)化合物与无机酸或有机酸反应制得，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、胺基磺酸和磷酸等，所述有机酸包括柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、乙磺酸、萘二磺酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、硬酯酸、扑酸、羟基马来酸、苯乙酸、苯甲酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、对胺基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸和羟乙磺酸等；或者式(i)化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸或谷氨酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或者式(i)化合物与有机碱形成的甲胺盐、乙胺盐或乙醇胺盐；或者式(i)化合物与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸或磷酸形成的对应的无机酸盐或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸或乙磺酸形成的对应的有机酸盐。
[0041]
药物组合物和应用
[0042]
本发明还提供了以式(i)所示的四环三萜类化合物、或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体或外消旋体及前药中的一种或多种的混合物为有效成分在制备治疗和/或预防、缓解结膜黑色素瘤等相关疾病的药物中的用途。
[0043]
本发明所提供的药物组合物优选含有重量比为0.001-99wt％的活性成份，优选的比例是式(i)化合物作为活性成分占总重量的0.1wt％～90wt％，其余部分为药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液。
[0044]
需要的时候，在本发明药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
[0045]
本发明所提供的化合物和药物组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。
[0046]
本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。其制剂配方的单位计量中通常包含0.05-400mg式(i)化合物，优选地，制剂配方的单位计量中包含1mg-500mg式(i)化合物。
[0047]
本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最优选日剂量为0.01-400mg/kg体重，一次性服用，或0.01-200mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
[0048]
本发明的药物或抑制剂可通过各种不同方式施用，例如可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹导入机体。
[0049]
本发明优点包括：
[0050]
(1)本发明的化合物葫芦素b能够在极低的浓度下有效抑制多种结膜黑色素瘤细胞的增殖，其抑制结膜黑色素瘤细胞cm-as16、crmm1、crmm2和cm2005.1的ic
50
值分别为0.08μm,0.24μm，0.15μm和0.38μm。
[0051]
(2)本发明实验表明葫芦素b通过直接靶向grp78/bip蛋白，从而抑制foxm1-plk1-kif20a信号通路，并下调该信号通路下游的cdk1-cyclinb1周期蛋白的表达，诱导肿瘤细胞周期g2/m期阻滞，进而抑制小鼠皮下移植瘤的生长。
[0052]
(3)本发明化合物的毒副作用低，成药性好。
[0053]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0054]
实施例1：葫芦素b对结膜黑色素瘤细胞cm-as16、crmm1、crmm2和cm2005.1的增殖抑制作用
[0055]
实验所用汉人结膜黑色素瘤cm-as16细胞来自上海交通大学第九人民医院，结膜黑色素瘤细胞系crmm1、crmm2和cm2005.1来自荷兰莱顿大学医学中心，正常细胞hl7702购自中科院细胞库。葫芦素b来源于实验室老药库，mek162购自mce公司，cck-8购自美国targetmol公司。收集对数期生长的细胞以1
×
104个/孔的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后加药。药物加入96孔板的终浓度分别为10μm，5μm，2.5μm，1.25μm，0.625μm，0.312μm，0.156μm，0.078μm和0.039μm。设置阳性对照药物mek162组和空白对照组。培养72h后，吸除含药物的培养基，并加入含10％cck-8溶液，避光孵育1-4h，使用酶标仪在450nm下检测吸光度，计算出不同浓度的生长抑制率，生长抑制率(％)＝(control组的平均值-给药组的平均值)/control组平均值*100％。细胞生长抑制率为50％的化合物浓度即为ic
50
值。实验数据用平均值
±
sd值表示，并使用graphpad 7.0进行数据分析。
[0056]
结果如下表所示，葫芦素b对各株结膜黑色素瘤细胞增殖均有抑制作用，ic
50
值分别为0.15μm,0.08μm,0.24μm和0.38μm，对正常细胞hl7702无毒性。
[0057][0058]
对比例1：常规抗肿瘤药物对结膜黑色素瘤细胞cm-as16、crmm2的增殖抑制作用
[0059]
实验所用汉人结膜黑色素瘤cm-as16细胞来自上海交通大学第九人民医院，结膜黑色素瘤细胞系crmm2来自荷兰莱顿大学医学中心。常规抗肿瘤药物顺铂、达卡巴嗪、沙利度胺来源于实验室老药库。收集对数期生长的细胞以1
×
104个/孔的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后加药。药物加入96孔板的终浓度分别为100μm，50μm，25μm，12.5μm，6.25μm，3.12μm，1.56μm，0.78μm和0.39μm。设置阳性对照药物mek162组和空白对照组。培养72h后，吸除含药物的培养基，并加入含10％的cck溶液，避光孵育1-4h，使用酶标仪在450nm下检测吸光度，计算出不同浓度的生长抑制率，生长抑制率(％)＝(control组的平均值-给药组的
平均值)/control组平均值*100％。细胞生长抑制率为50％的化合物浓度即为ic50值。实验数据用平均值
±
sd值表示，并使用graphpad 7.0进行数据分析。
[0060]
结果如下表所示，常规的抗肿瘤药物如顺铂、达卡巴嗪、沙利度胺对结膜黑色素瘤细胞增殖的抑制作用较差(其ic
50
值均大于20μm)。这可能与结膜黑色素瘤这一瘤种的特殊性相关，该瘤种的病兆部位、基因特点均不同于普通的肿瘤。
[0061][0062]
实施例2：葫芦素b对细胞周期和凋亡的影响
[0063]
实验所用细胞周期与凋亡检测试剂盒、细胞凋亡试剂盒购自碧云天生物科技公司。收集对数期生长的crmm2细胞以1
×
105个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后加药。药物加入6孔板的终浓度分别为0.1μm，0.2μm。设置阳性对照药物mek162组和空白对照组。培养24h后，按照试剂盒说明书收集细胞并避光孵育染色后，使用流式细胞仪进行检测周期及凋亡变化。
[0064]
结果如图2所示，葫芦素b能够有效引起细胞的g2/m期阻滞，并引起细胞的凋亡。
[0065]
实施例3：葫芦素b对foxm1-plk1-kif20a信号通路的抑制作用实验所用一抗包括foxm1抗体、plk1抗体、kif20a抗体、cdk1抗体、cyclinb1及gapdh抗体购自于abcam公司。二抗包含兔抗和鼠抗，购自翌圣生物科技有限公司。bca试剂盒、ripa裂解液、ecl显影液购自翌圣生物科技有限公司。收集对数期生长的细胞(crmm2、cm-as16、crmm1、cm2005.1、hl7702)以1
×
105个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后加药。药物加入6孔板的终浓度分别为0，0.1μm，0.2μm。培养24h后，收集细胞，并用ripa裂解液充分裂解细胞后离心取上清。bca试剂盒定量全蛋白浓度。蛋白分离采用sds-page电泳，然后转至pvdf膜、bsa封闭、加入特异性抗体(一抗)进行免疫反应，4℃孵育过夜。用hrp标记的二抗室温孵育1h，最后用ecl化学发光检测，tanon-4600sf仪器进行扫摸。
[0066]
结果如图3所示，葫芦素b能够抑制结膜黑色素瘤细胞的foxm1-plk1-kif20a信号通路及周期相关蛋白cdk1-cyclinb1。
[0067]
实施例4：葫芦素b与grp78蛋白结合并抑制其功能
[0068]
实验所用grp78蛋白购自abcam，red-tris-nta蛋白标记试剂盒购自nanotemper，孔雀绿磷酸检测试剂盒购自cayman。将grp78蛋白溶于1
×
pbst，加入red-tris-nta使蛋白标记，蛋白浓度为100nm。将标记好的grp78蛋白与不同浓度的葫芦素b按照体积比1:1孵育，药物浓度最高为100μm，2倍梯度进行倍比稀释，共12个梯度。使用毛细管吸取蛋白-药物溶液，放入monolith nt进行检测，其结合曲线见图4a。对于grp78 atpase活性测试，使用含20mm tris(ph 7.5)，50mm kcl，以及1.5mm mgcl2的缓冲液将葫芦素b配制成0-100μm的不同浓度备用，向药液中加入0.25μm的grp78蛋白37℃孵育3h。根据孔雀绿磷酸检测试剂盒说明书向其中加入工作试剂盒检测试剂，620nm波长下检测吸光值。
[0069]
结果如图4a所示，葫芦素b能够结合到grp78蛋白，kd值为0.11μm；如图4b所示，葫
芦素b能进一步抑制该蛋白的atpase活力。
[0070]
实施例5：利用基因敲减对靶蛋白的生物学功能的影响
[0071]
取对数期生长的细胞(crmm2、cm-as16、crmm1、cm2005.1)接种至六孔板中，密度为1.0
×
105个细胞/孔，培养24h之后进行shgrp78腺病毒转染(使用委托cro公司构建，并经过实验确认grp78敲减的腺病毒包装的基因进行)。细胞感染24h后移除腺病毒继续培养24h后提取细胞中的蛋白进行后续的western blot实验，检测目标蛋白foxm1、plk1、kif20a、cyclinb1及cdk1的表达情况。
[0072]
结果如图5所示，grp78敲减减少了foxm1、plk1、kif20a、cyclinb1及cdk1蛋白的表达。
[0073]
实施例6：小鼠荷瘤实验
[0074]
取对数生长的cmmc2细胞制备成浓度为1
×
107个/ml的细胞悬液，在6-7周龄ncg雄性小鼠前肢腋皮下接种，将接种后的小鼠随机分成治疗组和对照组(每组7只小鼠)。待瘤块大小长到约50mm3时，开始给药，给药时设置不同给药方式，以及不同剂量的对照组：
[0075]
(1)mek162(灌胃)给药：以10mg/kg/天的剂量给药；
[0076]
(2)腹腔注射cub：每天注射cub 1mg/kg.
[0077]
连续给药5周，每周2或3次观察小鼠体重及肿瘤体积变化，绘制肿瘤体积随时间变化的趋势图，及小鼠体重随时间变化的趋势图。
[0078]
结果如图6a所示，葫芦素b能够抑制小鼠移植瘤的生长，如图6b所示，葫芦素b对小鼠体重无明显影响。
[0079]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。