鹿血肽水凝胶及其在制备糖尿病皮肤损伤药物中的应用

1.本发明属于医药领域，涉及鹿血肽水凝胶的制备方法及其新的医疗用途。


背景技术：

2.鹿茸血(vb)是采割马鹿或梅花鹿茸时得来的血液，药用历史悠久，在《神农本草经》、《名医别录》、《本草纲目》和《神农本草经百种录》等诸多本草中均有记载，具有补肾壮阳，强健筋骨，生精益髓的功效，被誉为“人间仙品”。vb中含有大量的蛋白质、多肽和氨基酸类成分，中医认为其与鹿茸的药理活性相似，可以抗疲劳、抗氧化、提高免疫力、抗衰老、降血压、抗肿瘤和缓解骨质疏松。目前，包括鹿茸肽在内的多肽成份在抗氧化、抗炎方面表现出优异的活性，然而鹿血肽(vbps)在以上领域报道较少。
3.皮肤是人体最大、最暴露、最敏感且最易受伤的组织，在防脱水、抵御有害物质和病原体、启动维生素d合成、排泄和体温调节等不同过程中均发挥着至关重要的作用。由于病因多样，皮肤创伤已经成为一个亟需解决的重要医疗问题。在现代皮肤敷料中，水凝胶因其良好的亲水性、类似细胞外基质(ecm)的结构、良好的生物降解性、生物相容性、粘附性和透气性等特点，成为伤口敷料的理想候选产品。研究发现，在水凝胶中添加生物活性肽可以从抗炎、抑菌、促进细胞增殖和诱导血管生成等多个方面提高水凝胶的皮肤修复能力。
4.当前，糖尿病创面愈合和血管生成仍然是临床医学的一大挑战，若护理不当极易引发坏疽、截肢甚至患者死亡。传统的敷料，如纱布，可能会附着在新生的肉芽组织上，当被移除时会引发疼痛和影响组织完整性，而且不具备抑菌、抗氧化或其他活性功能。在包括薄膜、纳米纤维、水凝胶和海绵等形式的现代伤口敷料中，水凝胶因其具有三维网络结构、良好的生物降解性、生物相容性、粘附性和透气性，并可保持细胞迁移所需的湿润环境，现已成为伤口敷料的理想候选产品。本发明的目的公开cavbph对糖尿病相关的慢性皮肤伤口及皮肤菌群的调控作用。
5.

技术实现要素：
本发明将鹿血肽与水凝胶交联，获得负载鹿血肽的水凝胶；通过对鹿血肽水凝胶调控皮肤伤口菌群的研究，确定鹿血肽能够调控皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群丰富度、多样性和均匀度；因此，本发明的第一个目的在于：提供鹿血肽的新用途，具体为：鹿血肽在制备调控皮肤菌群结构的药物和/或化妆品中的应用。
6.作为本发明的优选，鹿血肽的新用途为：所述鹿血肽在制备调控受损皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群丰富度、多样性的药物和/或化妆品中的应用。
7.作为本发明的优选，鹿血肽的新用途为：所述鹿血肽在制备调控受损皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群均匀度的药物和/或化妆品中的应用。
8.作为本发明的优选，鹿血肽用于调控皮肤菌群结构时，鹿血肽是负载在水凝胶内，之后通过涂覆的方式涂在皮肤上。
9.另外，本发明对鹿血肽水凝胶通过调节sirt1/nf-κb信号通路途径促进糖尿病创伤皮肤的修复进程进行研究，确定鹿血肽水凝胶是通过激活sirt1/nf-κb信号通路而促进创伤皮肤修复；因此，本发明的第二个目的在于：提供一种sirt1/nf-κb信号通路激活剂，该
激活剂包括负载鹿血肽的水凝胶。
10.本发明通过鹿血肽水凝胶对糖尿病创面组织中vegf、hif-a、pcna、cd31、cd68的影响进行研究，确定鹿血肽可促进糖尿病受伤组织中生长因子的表达而加速创面修复；因此，本发明的第三个目的在于：提供一种促进糖尿病受伤组织中生长因子表达的药物，该药物包括负载鹿血肽的水凝胶。
11.本发明通过鹿血肽水凝胶对糖尿病小鼠皮肤创面伤口愈合的影响进行研究，确定含有鹿血肽的水凝胶样品有利于创伤修复；另外，通过对小鼠皮肤伤口愈合的组织病理学分析，发现鹿血肽水凝胶处理后，小鼠纤维细胞排列致密、规则，汗腺、毛囊等皮肤附属物正在生成且淋巴细胞可忽略不计、胶原纤维染色较深并且分布范围更广泛。进一步证实，鹿血肽水凝胶处理可加速伤口创面表皮生成，在皮肤修复过程中表现出良好的促进作用；因此，本发明的第四个目的在于：提供一种促进皮肤伤口修复的方法，该方法为：在皮肤伤口处涂敷含有鹿血肽水凝胶的药物。
12.本发明第五个目的在于：提供一种负载鹿血肽的水凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：（1）鹿血酶解：采用两步酶解法模拟鹿血粉的体外胃肠消化制备鹿血肽。配制20 mg/ml的鹿血溶液，用1-2 m hcl调节ph至1.5-2.5。37℃预热10-30min后，按酶底比1:10-50加入胃蛋白酶。溶液于恒温振荡器中以120 rpm的速度37℃消化2-4 h后，用1-2 m naoh调节ph值至7.5-8.0，加入胰酶，酶/底物=1:15-25，w/w，进一步反应 4 h，模拟肠道消化。在酶解过程中，使用1-2 m hcl或1-2 m naoh维持ph稳定。消化结束后，通过在沸水浴中加热15-30min使酶失活。反应物冷却至室温，8000 rpm离心30 min获得酶解液上清。随后上清液以双层慢速滤纸过滤2次获得鹿血肽，冷冻干燥置于-20℃保存备用；（2）分离、冻干：配置50 mg/ml的鹿血肽溶液，依次经过分子截留量为10 kda和3 kda的超滤膜进行分级处理，获得组分f1、f2和f3，并分别将3个组分通过150 da的纳滤膜进行脱盐处理，冻干后储存在-20℃备用；（3）鹿血肽水凝胶的制备：将200 mg的壳聚糖（cs）加入0.1m的10ml冰醋酸溶液中充分溶解，并在冰水浴搅拌的条件下逐滴加入2.5ml 55%(w/v)的β-gp溶液，得到cs/β-gp溶液。随后向制备的溶液中加入100 mg 海藻酸钠（sa）粉末不断搅拌使其溶解，然后滴入0.2 ml0.5% cacl2溶液(w/v)，连续搅拌，得到空白水凝胶（cah）溶胶，随后将权利要求5中步骤二得到的鹿血肽f3粉末添加到cah体系中混合均匀使其浓度为0.1%，得到鹿血肽水凝胶。
13.本发明的优点和有益效果：（1）本发明通过实验证实了鹿血肽能够调控受损皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群丰富度、多样性和均匀度，同时还能够促进有益菌的生长，该新用途的发现为慢性皮肤疾病的治疗提供了新的方法和有利依据。
14.（2）本发明提供了一种全新的sirt1/nf-κb信号通路激活剂，其为sirt1/nf-κb信号通路参与的慢性皮肤疾病的治疗提供了新的方法。
15.（4）本发明提供的鹿血肽水凝胶的制备方法操作简便、生产成本低、收率高。
附图说明
16.图1 酶解对vb体外活性的影响。其中，(a) tca-ysp；(b) sds-page分析；(c) dpph
自由基清除活性；(d) abts自由基清除能力；(e) 羟基自由基清除活性；(f) fe2+螯合活性；(g) lox抑制活性；(h) xod体外抑制活性；(i) 酪氨酸酶抑制活性。误差线上方的不同字母代表组间差异显著(p《0.05)。各样品浓度均为1 mg/ml。
17.图2 超滤组分的生物活性评价。其中，(a) dpph自由基清除活性；(b) abts自由基清除能力；(c) 羟基自由基清除活性；(d) fe2+螯合活性；(e) lox体外抑制活性；(f) xod抑制活性；(g) 酪氨酸酶抑制活性。误差线上方的不同字母代表组间差异显著(p《0.05)。各样品浓度均为1 mg/ml。
18.图3 合成肽的体外活性分析。其中，(a) 合成肽的溶血率；(b) dpph自由基清除活性；(c) abts自由基清除活性；(d) 羟基自由基的清除活性；(e) fe2+螯合活性；(f) lox抑制活性；(g) xod抑制活性；(h) 酪氨酸酶抑制活性。误差线上方的不同字母代表组间差异的显著性(p
ꢁ
《
ꢁ
0.05)。各样品的浓度均为1 mg/ml。
19.图4鹿血肽水凝胶的制备以及促进伤口修复的潜在机制。
20.图5鹿血肽水凝胶的表征。其中cah和capbph的sem (a)，ftir (b)，ph (c)，粘度(d)，保水性(e)，溶胀(f)和生物降解性分析(g)以及cavbph中vbps的累积释放(h)。比例尺=50 μm。
21.图6水凝胶样品的体外活性分析。其中，(a) dpph自由基清除活性，(b) abts自由基清除率，(c) 溶血性分析，(d-f) 水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌分析，(g) cah和cavbph的细胞活力。
22.图7 正常和糖尿病小鼠胰腺组织的 h&e 染色。比例尺=200 μm。
23.图8 不同处理组伤后0、3、9和15天的皮肤创面(a)和伤口愈合率(b)。*或**或***分别表示p《0.001， p《0.01， p《0.001。
24.图9 伤口组织的普通病理染色。其中，(a) h&e染色和masson染色，比例尺=100μm；(b) 各组胶原沉积的定量分析。*或**或***分别表示p《0.001， p《0.01， p《0.001。
25.图10 皮肤样本的ihc染色。其中，(a) cd31、pcna、α-sma和cd68的代表性图像(比例尺=200μm)。cd31(b)、pcna(c)、α-sma(d)和cd68(e)蛋白的定量表达。*或**或***分别表示p《0.001， p《0.01， p《0.001。
26.图11 不同处理对pi3k/akt/mtor/hif-1α信号通路相关蛋白的影响。其中，(a) 各蛋白条带的代表图像；(b) p-pi3k/pi3k；(c) p-akt/akt；(d) p-mtor/mtor；(e) hif-1α/β-actin；(f) vegfa/β-actin。*或**或***分别代表p《0.001， p《0.01， p《0.001。
27.图12 不同处理对糖尿病伤口处sirt1/nf-κb信号通路相关蛋白的影响。其中，(a) sirt1、nf-κb、tnf-α和il-1β的蛋白条带，(b) sirt1/β-actin，(c) nf-κb/β-actin，(d) tnf-α/β-actin，(e) il-1β/β-actin。*或**或***分别代表p《0.001， p《0.01， p《0.001。
28.图13 小鼠伤口处皮肤菌群分析。其中，(a) 物种分类学注释，(b) 稀疏曲线，(c) alpha多样性分析，(d) beta多样性分析，(e) 门水平上的群落丰度分析，(f) 属水平上的群落丰度分析，(g) 各组的venn分析，(h) 种水平的差异热图，(i) 随机森林特征分析。
具体实施方式
29.下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。除非特别说明，本发明采用的试剂、
方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
30.实施例1鹿血肽提取、鉴定1.1 材料与仪器1.1.1 实验材料梅花鹿(cervus nippon temminck) vb于2020年采购于吉林省金鹿药业有限公司。
31.1.1.2 实验仪器表1 实验仪器及厂家1.1.3 实验试剂表2 实验试剂和厂家
1.2 实验方法1.2.1 鹿血肽(vbh)的制备采用两步酶解法模拟vb的体外胃肠消化制备vbh。配制20 mg/ml的vb溶液，用1 m hcl调节ph至1.5。37℃预热10min后，按酶底比1:50加入胃蛋白酶。溶液于恒温振荡器中以120 rpm的速度37℃消化2 h后，用1 m naoh调节ph值至7.5，加入胰酶(酶/底物=1:25，w/w)进一步反应 4 h，模拟肠道消化。在酶解过程中，使用1 m hcl或1 m naoh维持ph稳定。消化结束后，通过在沸水浴中加热15 min使酶失活。反应物冷却至室温，8000 rpm离心30 min获得酶解液上清。随后上清液以双层慢速滤纸过滤2次获得vbh，冷冻干燥置于-20℃保存备用。
32.1.2.2三氯乙酸-可溶性肽产量(tca-ysp)tca-ysp表示为样品上清液中三氯乙酸-可溶性肽含量占vb总蛋白含量的百分比，用以评价蛋白质的水解过程。1 ml样品与1 ml 10%(w/v)三氯乙酸混合，25℃静置30 min，然后8000
ꢀ×
g离心10 min，使用bca试剂盒测定上清液中的多肽含量，并根据以下公式计算tca-ysp：tca-ysp (%) = (a/b)
×
100%其中：a是上清液中三氯乙酸-可溶性肽的含量，b为消化前样品总蛋白的含量。
33.1.2.3 sds-page
配置5%的浓缩胶和12%的分离胶，对鹿血及其水解组分进行sds-page分析。
34.1.2.4 鹿血肽(vbh)的超滤分离配置50 mg/ml的vbh溶液，依次经过分子截留量(mw)为10 kda和3 kda的超滤膜进行分级处理，获得组分f1(》10 kda)、f2(3-10 kda)和f3(《3 kda)，并分别将3个组分通过150 da的纳滤膜进行脱盐处理，冻干后储存在-20℃备用。
35.1.2.5 蛋白含量和氨基酸组成分析蛋白含量：以bsa为标准蛋白，采用bca蛋白试剂盒测定样品的蛋白含量。
36.氨基酸组成：样品以6 m hcl在110℃下水解22 h，用l-8900型氨基酸自动分析仪测定样品中每种氨基酸的含量。
37.1.2.6 nano lc-ms/ms鉴定肽序列利用nano lc-ms/ms分析具备最优生物活性组分的肽序列。首先在样品中加入dtt使其终浓度10 mm还原1 h，加入iaa溶液使其终浓度为50 mm，室温避光烷基化反应40 min。随后使用自填脱盐柱脱盐，于45℃挥干溶剂。将多肽样品重新悬浮在20 μl的0.1% fa中，利用配备有电喷雾-组合型离子阱orbitrap 质谱仪的ultimate 3000 高效液相色谱系统进行分析。
38.色谱条件如下：1)预柱：300 μm i.d.
ꢀ×ꢀ
5 mm, packed with acclaim pepmap rplc c18, 5 μm, 100
å
,2)分析柱：150 μm i.d.
ꢀ×ꢀ
150 mm, packed with acclaim pepmap rplc c18, 1.9 μm, 100
å
3)进样量5 μl，柱温20℃。
39.4)流动相a：0.1% fa；5)流动相b：0.1% fa，80% acn；6)流速：600 nl/min；梯度洗脱条件见表3。
40.表3 液相洗脱条件质谱条件：1)一级质谱参数：resolution：70,000；agctarget：3e6；maximumit：40 msscanrange：100 to 1800 m/z2)二级质谱参数：resolution：17500；agctarget：1e5；maximumit：60 ms
topn：20；nce/steppednce：27利用xcalibur软件和byonic软件对原始ms/ms文件进行分析，并与uniprot数据库所属物种蛋白组进行比对鉴定多肽序列。
41.1.2.7 单肽的制备利用葡聚糖凝胶柱色谱分离制备鹿血肽中的单肽，利用waters zq 2000单四极杆质谱仪和waters alliance 2695高效液相色谱系统被分别用来分析制备的单肽的mw和纯度(》95%)。
42.1.2.8 抗氧化活性测定配制1 mg/ml的蛋白肽溶液和阳性对照溶液，以评价肽的抗氧化能力。其中，dpph、abts和羟基自由基清除能力以gsh为阳性对照，亚铁离子(fe
2+
)螯合能力以edta-2na为阳性对照。
43.1.2.8.1 dpph自由基清除活力将样品与等体积的0.2 mm的dpph乙醇溶液加入96孔板中，室温暗反应30 min，酶标仪读取517 nm处的吸光度。dpph自由基清除率的计算公式如下：dpph自由基清除率(%)=[1
−
(a
样品
−a样品空白
)/a
对照
]
×
100%式中，a
样品
代表肽和dpph溶液的吸光度，a
对照
是dpph和蒸馏水的混合吸光度，a
样品空白
代表样品和乙醇的吸光度。
[0044]
1.2.8.2 abts自由基清除活力分别制备浓度为7.4 mm和2.45 mm的abts和过硫酸钾溶液，1:1 (v/v)混合后低温暗反应12 h，使用前用蒸馏水进一步稀释溶液至734 nm处的吸光度为0.7
±
0.02。将受试样品与abts工作液1:2 (v/v)混合，室温避光孵育10min，测定734 nm处的吸光度。计算公式如下：abts自由基清除能力(%) =[1
−
(a
样品
−a样品空白
)/a
对照
]
×
100%式中，a
样品
是样品溶液和abts工作液的混合吸光度，a
对照
代表蒸馏水和abts工作液的吸光度，a
样品空白
表示样品和蒸馏水的吸光度。
[0045]
1.2.8.3 羟基自由基清除能力样品中依次加入等体积的10 mm水杨酸乙醇溶液、10 mm硫酸亚铁溶液和8.8 mm h2o2溶液。混合物在37℃暗反应30 min，3000
ꢀ×
g离心5 min，然后在510 nm处测定上清液的吸光度(a
样品
)。羟基自由基清除能力的计算公式如下：羟基自由基清除率(%) =[1
−
(a
样品
−a样品空白
)/a
对照
]
×
100%式中，a
样品空白
包括样品、水杨酸、硫酸亚铁和蒸馏水，a
对照
包含蒸馏水、水杨酸、硫酸亚铁和h2o2。
[0046]
1.2.8.4 fe
2+
螯合能力将100 μl样品与20 μl的fecl2溶液(2 mm)混合，室温下反应30 min。然后加入100 μl菲洛嗪(5 mm)，继续反应10 min，在562 nm处测定吸光度。fe
2+
螯合能力的计算公式如下：fe
2+
螯合能力(%)=[1
−
(a
样品
−a样品空白
)/a
对照
]
×
100%其中，a
样品
代表样品、fecl2和菲洛嗪的混合吸光度，a
对照
包括蒸馏水、fecl2和菲洛嗪，a
样品空白
是样品、fecl2和蒸馏水混合物的吸光度。
[0047]
1.2.9 lox抑制活性
(p《0.05，图2a)。如图2b所示，除f1外，其余组分的abts清除率都超过95%。另外，f3的羟基自由基清除和fe
2+
螯合能力均显著高于其亲本水解物和其余组分(p《0.05，图2c和d)。如图2e-g所示，f3对lox、xod和酪氨酸酶抑制活性分别为22.36%、37.23%和83.58%。
[0054]
表4展示了f3中水解氨基酸的类型和含量，其中8种为必需氨基酸(65.92%)，9种为非必需氨基酸(34.08%)。4种高含量的氨基酸依次为赖氨酸(19.51%)、缬氨酸(13.41%)、亮氨酸(13.25%)和谷氨酸(10.15%)，占总氨基酸的56.73%。
[0055]
表4 f3组分的氨基酸组成1.3.3 肽序列鉴定和活性分析f3中共鉴定出372种肽，主要来源于adult beta-globin、toll-like receptor 8、tyrosine-protein kinase receptor、mhc class ii antigen和serum albumin等亲本蛋白。其中，97.78%的肽拥有《1kda的mw，其余肽的mw介于1 kda和3 kda之间。选择score》200，intensity》107的序列(27个)进行进一步分析。这些肽的生物活性、抗氧化、抗炎和抑菌性能利用在线工具进行预测，结果如表5所示。
[0056]
表5 鉴定肽活性的计算机预测
因此，根据在线预测结果，选择了ehf、fph、lfp、fsal、vgyp、lsqkfpk、hhggeftpv和lkeccdkpv以观察它们的体外生物特性。
[0057]
1.3.4 肽的生物活性分析在体外溶血实验中，所有肽在1 mg/ml浓度时的溶血率均低于1%(图3a)。lkeccdkpv在所有肽中表现出最高的dpph(89.55%)和abts(89.55%)清除能力，活性与gsh相当(p》0.05，图3b和c)。如图3d所示，这些肽的羟基自由基清除能力依次为fph (52.50%)、lfp (51.66%)、gsh (32.35%)、ehf (25.99%)、hhggeftpv (25.53%)和lkeccdkpv (22.94%)。然而所有肽的fe
2+
螯合能力均低于15%(图3e)。
[0058]
随后对这些肽的酶抑制活力进行了检测(图3f-h)。肽fsal和lfp分别展现出11.61%和10.22%的lox酶抑制活性，而其余的肽均低于10%(图3f)。如图3g所示，在1 mg/ml时对xod具有较强抑制活性的前4个肽分别为ehf(82.19%)、vgyp(73.26%)、lkeccdkpv(64.69%)和fsal(51.82%)，另外，lkeccdkpv的酪氨酸酶抑制活性显著高于其余的肽(p《0.05，图3h)。
[0059]
本发明首次从vb中分离出多生物活性肽，模拟了vb的体外消化，发现vbh具有很高的抗氧化活性，lox、xod和酪氨酸酶抑制活性，而且它的必需氨基酸含量高，满足人体需要，表明vb作为一种宝贵的蛋白质资源，经口服后可以被吸收并有助于调控生物系统平衡。另外，我们从f3中鉴定出27种具有高置信度的肽，结合在线预测、固相合成和活性分析证明了部分肽的生物功能。这些结果为vb及其衍生肽在医疗健康领域的应用提供了科学数据。
[0060]
实施例2 鹿血肽水凝胶（cavbph）的制备表征1.1仪器与材料1.1.1 实验仪器表6实验仪器及厂家1.1.2 实验试剂表7实验仪器及厂家
1.2 实验方法1.2.1 vbps的制备利用实施例1中酶解和超滤技术制备mw《3 kda的组分f3，即vbps，冻干后于-20℃备用。
[0061]
1.2.2 cavbph的制备将200 mg的cs加入10ml冰醋酸溶液(0.1m)中充分溶解，并在冰水浴搅拌的条件下逐滴加入55%(w/v)的β-gp溶液(2.5 ml)得到cs/β-gp溶液。随后向制备的溶液中加入100 mg sa粉末不断搅拌使其溶解，然后滴入0.2 ml cacl2溶液(0.5%, w/v)，连续搅拌，得到cah溶胶。为制备cavbph，将vbps粉末添加到cah体系中混合均匀使其浓度为0.1%(w/v)。
[0062]
利用倒置离心管的方法测定了cah和cavbph在37℃下的凝胶时间。结果显示，结果显示，在37℃时，空白水凝胶在5min时发生凝胶化，而鹿血肽水凝胶2min时发生凝胶化，说明所制备的水凝胶具有温敏性。所有溶液均新鲜配制并储存在4℃以备使用。
[0063]
1.2.3 水凝胶的表征1.2.3.1 微观特征采用扫描电子显微镜(sem)在15 kv下观测表面喷金的凝胶断面微观形貌。
[0064]
1.2.3.2 红外分析分别将cs、β-gp、sa、vbps、cah和cavbph的粉末与kbr按1:100的质量比混合，采用
ftir光谱仪在4000cm-500cm-1
的波数范围内扫描以检测它们的特征官能团。
[0065]
1.2.3.3 ph和粘度测定用ph计测定了cah和cavbph在37℃时的ph值。同样地，使用ndj-8s数字粘度计，3号转子设置转速1.5 rpm，在37℃下测量了样品的粘度。
[0066]
1.2.3.4 保水性测试将初始重量为w0的水凝胶样品放置于37℃恒温烘箱中48 h，每隔一段时间称重记为w
t
。重量保持率(wrr)由以下公式计算：wrr=w
t /w0×
100%1.2.3.5 溶胀测试参将一定质量的冻干水凝胶(w0)浸入pbs (ph=7.4)中37℃放置48 h，期间按照固定时间间隔取出样品，除去表面多余水分后称重，记为w1。溶胀率(sr)的计算公式如下所示：sr= (w
1-w0)/w0×
100%1.2.3.6 体外酶促生物降解将水凝胶样品(w0)放入含1 mg/ml溶菌酶的pbs中，37℃、100 rpm孵育14天。期间按照设置的时间间隔取出水凝胶并用滤纸除去表面多余水分，快速称重(w
t
)。每隔48 h更换一次新鲜配置的溶剂以保证溶菌酶的活力。利用下式计算水凝胶的残余重量(wr)：wr = w
t
/w0×
100%1.2.3.7 vbps的体外释放为了评估vbps在cavbph中的释放行为，将一定质量样品完全浸入20 ml pbs中，37℃以100 rpm的速度连续振荡10天。在不同的时间点取出1 ml上清液，同时添加1 ml新鲜pbs保证体积不变。利用bca法测定vbps的释放。
[0067]
1.2.4 水凝胶的体外活性1.2.4.1 体外抗氧化首先，将冻干水凝胶浸入pbs中24 h制备不同浓度(1和5 mg/l)的溶液，同时制备1 mg/ml vbps以及gsh溶液作为阳性对照。如实施例1所示，采用dpph和abts自由基清除方法对抗氧化活性进行评价。
[0068]
1.2.4.2 体外溶血水凝胶的溶血率测定按实施例1进行。
[0069]
1.2.4.3 抑菌活性根据时间依赖性共培养评估了水凝胶对大肠杆菌(e. coil, 革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(s. aureus, 革兰氏阳性菌)的抑制活性。首先，将所有受试菌株在luria-bertani (lb)液体培养基中37℃振荡培养至对数生长期，用生理盐水稀释菌液至浓度约为10
5-6 cfu/ml。将0.5 ml菌液与20 ml含有0.4 g紫外灭菌水凝胶的lb液体培养基混合，于37℃，100 rpm培养，定期测定培养液在600 nm处的吸光度。对照组不存在水凝胶样品。随后将各组细菌培养液用生理盐水适当稀释后接种在lb固体培养基上37℃孵育12 h，观察平板菌落数以评价cah和cavbph的抑菌活性。
[0070]
1.2.4.4 细胞毒性将紫外灭菌的水凝胶浸入培养基中，在37℃下孵育24 h，以获得水凝胶提取液。
hacat细胞以0.5
ꢀ×ꢀ
104细胞/孔的密度接种在96孔板中。细胞贴壁24 h后，将培养基更换为水凝胶提取液继续培养24 h。利用mtt法测定hacat细胞的存活率来确定水凝胶是否存在细胞毒性。
[0071]
1.2.5 统计分析实验一式三份，数据以平均值
±
标准差(sd)表示。采用ibm spss statistics 23.0软件进行anova, p《0.05被认为具有统计学意义。graphpad prism 5和adobe illustrator cs6软件被用来绘制图形。
[0072]
1.3 实验结果1.3.1 水凝胶的表征温敏型复合水凝胶制备方案如图4所示。在cs的结构中，c3和c6的-oh以及c2位连接的部分可质子化的-nh
3+
基团容易与水分子产生氢键，提高聚合物的水溶性。将β-gp引入cs溶液后，37℃加热，促使β-gp结构中的-po
43-与 cs分子中的-nh
3+
通过静电作用相结合，另外，cs、β-gp和h2o之间更容易相互形成稳定的氢键，进而形成cs基温敏水凝胶网络。同时体系中引入的ca
2+
可以与sa分子结构中2个古洛糖醛酸片段的-coo
‑ 和-oh形成4个配位键，进而实现sa/ca
2+
网络，增强凝胶体系的粘度和凝胶化的效果。
[0073]
利用sem观察了cah和cavbph的微观形貌，如图5a所示。cah和cavbph都具有多孔的网络互联结构。在相同放大倍数下比较cah和cavbph的图像，发现vbps的引入增加了水凝胶中的孔隙数量。水凝胶的多孔结构不仅有利于锁湿和营造潮湿环境，而且还为伤口床提供了更多的氧气。此外，cavbph的空隙也有利于vbps的释放，尽快与伤口作用。
[0074]
cs、β-gp、sa、vbps、cah和cavbph的ir光谱如图5b所示。对于cs，1655、1597、1383 cm-1
处的吸收峰分别代表酰胺i (c-o伸缩振动)、伯胺(n-h弯曲振动)和c-h弯曲振动。对于β-gp，po
43-的对称和不对称伸缩振动峰分别出现在978 cm-1
和1080 cm-1
附近。po
43-基团的面内弯曲振动位于800-500 cm-1
。在sa的ir光谱中，1634和1420 cm-1
的特征吸收峰归属于羧基(c=o)的对称和不对称伸缩振动，c-o的伸缩振动峰位于1032 cm-1
。在vbps的红外光谱中，1629和1583 cm-1
的吸收峰归属于酰胺ⅰ和ⅱ的特征吸收带，c-h和o-h的弯曲振动分别出现在1456和1404 cm-1
，1111 cm-1
的吸收峰是由c-o的伸缩振动引起的。对于cah和cavbph，po
43-的对称和不对称伸缩振动峰(973和1081 cm-1
)以及n-h振动吸收峰(1568 cm-1
)减弱，表明cs的部分-nh
3+
与β-gp的po
43-之间发生了静电作用。经ca
2+
交联后，水凝胶中与sa相关的o-h变形振动、c=o和c-o的伸缩振动明显减弱。cs的n-h变形振动(1634 cm-1
)以及sa的c=o伸缩振动(1597 cm-1
)峰强度减少或消失，这可能是sa结构中的-coo-和cs分子的-nh
3+
之间的相互作用所致。
[0075]
伤口的ph值一般介于弱酸性和中性范围内(5.4-7.4)，直接或间接地在伤口愈合中起重要作用。如图5c所示，cah和cavbph的ph值约为6.8。cah和cavbph的粘度分别为73.49
±
0.51 pa
·
s和76.75
±
0.01 pa
·
s (图5d)。
[0076]
适当潮湿的环境可以促进皮肤伤口愈合。图5e显示了水凝胶的重量随时间变化的曲线。在前6 h，cah和cavbph的重量迅速下降，10~48 h略有下降并至恒定。总体而言，水凝胶的初始含水量在85%以上，能较好地保持创面周围的湿润环境。良好的吸湿性相当于皮肤敷料吸收伤口分泌物的能力，与cah相比，cavbph具有更快的吸水能力，由于其丰富的多孔结构，在前1 h内就达到了最大的sr(图5f)，说明水凝胶支架可以迅速吸收渗出液，防止其
在创面过度堆集。
[0077]
生物聚合物材料的可降解性是影响其医学应用的最重要特征之一。cah和cavbph的重量随着孵育时间的延长而逐渐降低(图5g)。前12 h的快速降解是由β-gp引起的，水凝胶在浸泡过程中，β-gp从中游离出来，使交联度降低。培养14天后，cah和cavbph的重量分别从100%下降到56.85
±
8.42%和59.26
±
2.70%，具有一定的生物降解性和抗水解性。
[0078]
vbps从cavbph中的累积释放行为如图5h所示。vbps在最初的48 h内迅速释放，前24 h约有50%的vbps被释放。水凝胶在培养液中孵育10天后，共释放82.04
±
1.10%的vbps。因此，cavbph水凝胶可以满足持续释放vbps的要求。
[0079]
1.3.2 体外生物活性皮肤破损处会产生大量自由基，导致dna断裂、脂质过氧化和相关酶失活。越来越多的研究表明，具有抗氧化活性的皮肤敷料提高了组织修复的治疗效果。1 mg/ml和5 mg/ml的cavbph对dpph和abts自由基的清除能力显著高于cah组(p《0.05)，表明水凝胶的抗氧化能力与vbps的引入有关(图6a和b)。
[0080]
在本研究中，水凝胶和vbps处理组上清均呈无色透明状，阳性对照组为鲜红色(图6c)。定量结果表明，cah、cavbph和vbps的溶血率均低于5%，几乎不会引起溶血。因此，这些材料是生物安全的，可以用于皮肤护理。
[0081]
cah和cavbph对s. aureus (32 h)和e. coli (24 h)的抑菌活性如图6d-f所示。与对照组相比，cah和cavbph对s. aureus和e. coli的生长和增殖都有明显的抑制作用，一部分来源于cs固有的抑菌作用，而vbps的加入进一步增强了cs水凝胶的长效抑菌性能，从而减少了细菌入侵皮肤创面的机会。
[0082]
细胞毒性是水凝胶敷料临床应用的重要指标。如图6g所示，当水凝胶浓度从10 μg/ml增加到100 μg/ml时，细胞活力几乎保持不变。当浓度达到1000 μg/ml时，cah和cavbph处理的hacat细胞活力分别为81.29%和86.74%。根据gb/t 16886.5-2003 (iso 10993-5: 1999)，细胞存活率超过75%的样本通常被认为是无细胞毒性的。基于以上结果，cah和cavbph的毒性可忽略不计。
[0083]
实施例3鹿血肽水凝胶对糖尿病型慢性皮肤伤口的作用研究1.1仪器与材料1.1.1 实验仪器表8 实验仪器及厂家
1.1.2 实验试剂表9 实验试剂及厂家
1.2 实验方法1.2.1
ꢀⅱ
型糖尿病(t2d)的诱导和皮肤伤口模型的建立100只健康雄性icr小鼠，体重18-20 g，购自长春亿斯实验动物科技有限公司(证书编号：scxk-2020-0001)。适应性饲养一周后(22
±
2℃，60
±
5%湿度，昼夜交替光照)，除正常对照组(nc)饲喂普通饲料外，其余小鼠连续五周给予高糖高脂饮食以诱导胰岛素抵抗。在随后的3天内首先禁食不禁水12 h，然后依次按照80 mg/kg体重/天、70 mg/kg体重/天、60 mg/kg体重/天的剂量腹腔注射stz (ph=4.3，0.1 m柠檬酸缓冲液)诱导t2d，nc组仅注射柠檬酸缓冲溶液。第三次注射stz后一周，测量尾静脉血中的空腹血糖(fbg)，筛选fbg值≥11.1 mm且表现出临床典型的多饮、多食、多尿且体重下降的小鼠作为t2d，将其随机分为糖尿病模型组(t2d)、cah治疗组(cah)和cavbph治疗组(cavbph)，用于伤口实验。
[0084]
将糖尿病成模小鼠，腹腔注射相应比例的5%水合氯醛溶液(0.1 ml/10 g体重)麻醉小鼠，用电动剃须刀剃除背部毛发，并于背部诱导直径为1 cm的圆形全层切除创面，给药剂量为0.2 ml/wound。术后nc和t2d组仅以pbs处理伤口，而cah和cavbph组分别给予cah和cavbph水凝胶治疗，并于第0、3、9、15天时测量创面面积计算伤口愈合率。创面面积(wound area)计算公式为：wound area = unhealed area/ initial area
×
100%1.2.2 普通病理学和ihc染色分析术后治疗15天取皮肤创面组织用10%福尔马林溶液固定，分别进行h&e、masson和ihc染色。
[0085]
1.2.3 western blot分析
加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa裂解缓冲液(冰水浴预冷)裂解皮肤创伤组织提取总蛋白，并利用bca试剂盒测量裂解上清的蛋白浓度。各裂解上清中加入1/4体积的5
×
loading buffer，沸水浴10 min使样品变性。通过10% sds-page电泳分离样品蛋白并转移到pvdf膜上，5% bsa封闭2 h后将膜与一抗pi3k、akt、mtor、p-pi3k、p-akt、p-mtor、sirt1、nf-κb、il-1β、tnf-α和β-actin在4℃孵育过夜，tbst冲洗，然后置于二抗溶液中室温孵育1 h，利用增强化学发光法(ecl)检测蛋白条带，并用image j软件进行定量分析。
[0086]
1.2.4 皮肤菌群的16s rrna测序分析第15天，取无菌棉签在医用生理盐水中浸湿，于小鼠伤口周围的新生皮肤处多次轻轻擦拭，采集每组菌群样本(n=10)。将样品置于无菌离心管中-80℃暂存，一周内用于分析。以silva为参考数据库，16s v3v4扩增和测序委托上海派森诺生物科技有限公司进行，并利用基因云平台分析结果。
[0087]
1.2.5 统计分析实验一式三份，数据以平均值
±
sd表示。采用ibm spss statistics 23.0软件进行anova，p《0.05被认为具有统计学意义。graphpad prism 5和adobe illustrator cs6软件被用来绘制图形。
[0088]
1.3 结果1.3.1 t2d模型验证在整个动物实验过程中，糖尿病小鼠fbg的水平一直高于11.1 mm且表现出典型的“三多一少”症状。与nc组小鼠相比，糖尿病小鼠胰腺组织的h&e染色证实了腹腔注射stz后的病理变化。如图7所示，糖尿病小鼠的胰岛面积和数量减少，腺泡细胞肿胀，胰岛β细胞受损，以上结果证明t2d模型已成功建立。
[0089]
1.3.2 体内伤口愈合效果实验期间，各组均未发现明显的感染或其他并发症，且随时间延长各组创面均逐渐减小(图8a)。与nc组相比，由于糖尿病的影响，t2d组在整个伤口恢复过程中愈合缓慢，而且第9天仍有组织液渗出。经过cah和cavbph治疗，以上情况发生明显改善(p《0.05)。第15天时，cavbph组(96.55%)和nc组88.77%)的伤口已基本愈合，大部分区域均被毛发覆盖，而cah和t2d组的愈合率分别为84.23%和63.81%(图8b)。
[0090]
1.3.2 组织学评估h&e染色显示cavbph和nc组纤维细胞排列致密、规则，汗腺、毛囊等皮肤附属物正在生成且淋巴细胞可忽略不计；而t2d组上皮化过程尚未完成，肉芽组织较少，仍存在浸润性淋巴细胞，表明具有持续的炎症反应(图9a)。利用masson染色和定量分析评价ecm的沉积和成熟。如图9a所示，术后15天时cavbph和nc组胶原纤维染色较深并且分布范围更广泛。定量分析显示，cavbph和nc组的胶原含量均显著高于其余两组(p《0.05，图9b)。
[0091]
1.3.3 ihc分析采用ihc法染色cd31、pcna、α-sma和cd68检测创面的血管生成、细胞增殖、ecm分泌和炎症反应情况。结合染色图片和定量分析，我们发现与nc组相比，t2d组中cd31、pcna和α-sma蛋白的表达显著受到抑制(p《0.001)。经水凝胶治疗后上述情况有所改善，并且以上3种蛋白在cavbph组中的表达量与nc组相近，同时高于cah组(图10a-d)。这些现象表明cavbph
改善了糖尿病伤口血管生成受限的状况，增强了皮肤细胞的增殖和ecm的再生，从而促进了伤口愈合。在接下来的cd68染色结果中，除t2d组之外，nc、cah和cavbph组未发现肉眼可见的阳性表达，定量分析与图像观察结果一致，即t2d组cd68的阳性表达量显著高于其余3组(p《0.001，图10 a和e)，因此cah和cavbph可以明显缓解糖尿病伤口处的持续炎症(p《0.001)。
[0092]
1.3.4 western blot分析如图11所示，第15天cavbp组创面组织中p-pi3k/pi3k、p-akt/akt、p-mtor/mtor、hif-1α和vegfa的表达均显著高于t2d组(p《0.01)。我们发现cah水凝胶在一定程度上激活了糖尿病伤口中pi3k/akt/mtor/hif-1α相关蛋白的表达，但是相比之下，cavbph的表现更为突出，从而促进了伤口愈合进程中的血管生成(p《0.05)。
[0093]
糖尿病伤口处的高糖环境容易诱发细菌感染和慢性炎症，与nc相比，t2d组sirt1蛋白的表达明显降低(p《0.05)，同时nf-κb、tnf-α和il-1β的表达水平显著升高(p《0.01，图12)。cavbph水凝胶治疗后，sirt1的表达被显著上调(p《0.05)，而且下调了nf-κb、tnf-α和il-1β蛋白的表达(p《0.001)。另外，与空白水凝胶，即cah组相比，cavbph对sirt1的上调和对nf-κb、tnf-α和il-1β的下调作用更显著(p《0.05)。
[0094]
1.3.5 皮肤菌群分析如图13a所示，所有样本的测序信息基本上都可在silva数据库中找到，未分类序列可忽略不计，表明样品质量合格。另外，各组的稀疏曲线均随着抽平深度的增加而逐渐平缓，最后趋于饱和，说明测序深度是合理的，同时也反映了样品中微生物的真实情况(图13b)。
[0095]
以observed species和simpson指数评估样本的alpha多样性，结果如图13c所示。其中observed species指数代表样品中的物种丰富度，simpson指数被用来表征多样性。我们发现cavbph和nc组的observed species指数高于t2d组和cah组(p=0.065)；t2d组的simpson指数较nc组有所下降，而给予cah和cavbph治疗后样品中菌群的多样性有所改善，其中cavbph和t2d组间的simpson指数有显著性差异(p=0.0041)。因此，t2d组的群落多样性和丰富度发生了明显的变化，经cavbph干预后这种情况有所恢复。同时，利用主坐标分析(pcoa)比较组间的群落差异以反映beta多样性。如图13d所示，首先nc组和t2d组被明显的划分到两个区域，cah组与t2d组样本存在部分重叠，而相比于t2d和cah组，cavbph组样本分布更集中且更接近于nc组。这一结果说明经cavbph治疗后，由于t2d诱导的伤口处皮肤菌群紊乱状况得以改善。
[0096]
进一步分析了四组小鼠皮肤菌群组成的差异，发现各组在门水平上的优势菌群为firmicutes、proteobacteria和actinobacteria(图13e)。其中，firmicutes在nc、t2d、cah和cavbph组中分别占比34.05%、80.22%、70.52%和46.96%；四组中proteobacteria的含量分别为62.63%、16.13%、28.21%和48.79%；而actinobacteria在nc、t2d、cah和cavbph组中分别占有1.46%、0.90%、0.84%和3.47%。此外，bacteroidetes在nc组和cavbph组中也占有一定的比例(分别为0.85%和0.30%)，而在t2d组和cah组中分别为0.09%和0.11%。因此，我们可以认为，在门水平上，与普通伤口皮肤相比，t2d导致皮肤伤口处的firmicutes的相对丰度增加，同时降低了proteobacteria、actinobacteria和bacteroidetes；而cavbph处理改善了菌群紊乱的情况，使皮肤表面4个主要的细菌菌门趋于正常水平。另外，四组在属水平上的微生
物相对丰度同样存在差异(图13f)：与nc组相比，t2d组中staphylococcus的相对丰度增加，vulcaniibacterium、cupriavidus、pseudomonas、lactobacillus、anoxybacillus和chelatococcus相对丰度降低；cah和cavbph处理改善了这种异常情况，其中cavbph治疗使菌群的组成更趋向于nc组。除此之外，与其余组相比，cavbph显著增加了weissella (20.66%)和corynebacterium_1 (2.71%)的水平。
[0097]
随后，对各组的分类单位(otu)进行venn分析，结果如图13g所示。nc、t2d、cah和cavbph组分别含有3989、3627、3110和3879条out，我们推测cavbph干预可能与out数量恢复有关。t2d组和cah组含有1186条重叠otu，其次是cah和cavbph组(1142条)、t2d组和cavbph组(966条)、nc组和cavbph组(935条)、nc组和cah组(730条)，而nc组和t2d组的重叠otu最少，仅670条；另外，四组共有的otu为350条。
[0098]
图13h在种水平上展示了前20种细菌在四组间的相对表达丰度，其中t2d和cah组被聚为一类，而cavbph组在聚类中与nc组相邻。与nc组相比，t2d组中clostridiales_bacterium、staphylococcus_lentus、streptococcus_hyointestinalis、dorea_sp.、dechloromonas_sp.、lactobacillus_reuteri、pseudogracilibacillus_auburnensis、lactobacillus_intestinalis、streptococcus_danieliae、pseudomonas_stutzeri、lactobacillus_hominis、chelatococcus_sp.和acinetobacter_lwoffii的相对丰度被下调，staphylococcus_sciuri被上调，cavbph有效的缓解并逆转了这种情况；另外，与其余三组相比，corynebacterium_ammoniagenes、corynebacterium_glutamicum、corynebacterium_stationis、weissella_paramesenteroides和leuconostoc_citreum在cavbph组中的相对丰度显著增加。
[0099]
图13i中，应用随机森林分析和差异性检验，识别对组间差异影响最大的标志菌属。结果发现，staphylococcus、jeotgalicoccus、weissella、ruminococcaceae_ucg-013和candidatus_stoquefichus在四组间变化最敏感，表明它们是对t2d小鼠皮肤伤口愈合影响力较大的菌属，但给予cavbph则加剧了weissella的上调。