一种没食子酸多聚体化合物在制备美白产品中的应用

1.本发明属于美容技术领域，具体涉及一种没食子酸多聚体化合物（valoneic acid dilactone methyl ester，英文简写vadme）在制备美白产品中的用途。


背景技术：

2.常言道：“一白遮三丑”，说明了人们对皮肤美白的审美观。随着文化生活水平的提高，亚洲女性对于美白有很执着的追求。皮肤的颜色与黑色素有关，黑色素是存在于每个人皮肤基底层的一种蛋白质。酪氨酸和多巴在经过酪氨酸酶的作用下，经过一系列的反应，生成黑色素，之后黑色素又经由细胞代谢的层层移动，到了肌肤表皮层，形成了我们看到的色斑和肤色不匀等皮肤问题。所以黑色素是影响皮肤白皙的最主要的色素，所以抑制黑色素的生成是美白产品最重要的一个目的。黑色素是由黑色素细胞内生成的，目前市面上有的美白产品主要以烟酰胺、熊果苷以及维生素c衍生物为主；同时研究发现根皮素、根皮苷等物质具有抑制酪氨酸酶的活性，亦即具有美白功效。
3.没食子酸（gallic acid），化学名称为3,4,5-三羟基苯甲酸，分子式c7h6o5，是一种多酚类有机化合物，广泛存在于掌叶大黄、大叶桉、山茱萸等植物中，没食子酸具有抗炎、抗突变、抗氧化、抗自由基等多种生物学活性，在食品、生物、医药、化工等领域有广泛的应用；而在天然植物中，研究发现了另一个特殊的化合物“没食子酸多聚体”，目前，人们对于没食子酸多聚体的研究还较少。
4.金边玫瑰（rosa chinensis cv jinbian）又名刺香玫瑰，蔷薇科蔷薇属木本植物，其主要种植在中国云南省文山、楚雄、大理、昆明、丽江、曲靖等地。金边玫瑰花香气纯正高雅，色泽红艳，主要作为我国玫瑰花茶的原料，产量巨大，但其衍生产品不多。研究发现，金边玫瑰具有活血化瘀、安神定气、补益气血、理气保肝、延缓皮肤衰老等广泛的药理作用。而在本发明对金边玫瑰的研究中，发现其中含有一个没食子酸多聚体化合物（vadme）；接着对该化合物进行了多方面的生物学活性实验研究，具有很大的开放利用价值。
5.经文献查询，目前未见对vadme在美白活性方面的专利及文献报道。


技术实现要素：

6.本发明提供了提供一种从金边玫瑰中获得的天然产物没食子酸多聚体化合物vadme的用途，即没食子酸多聚体化合物vadme制备美白产品中的应用，本发明的原理在于vadme可以抑制酪氨酸酶的活性，有效抑制黑色素瘤的增殖，从而有效抑制黑色素的产生，将没食子酸多聚体化合物vadme应用于面膜面霜等美白化妆品中，发挥其具有的美白活性与抗炎活性的双重功效。
7.所述没食子酸多聚体化合物vadme的结构式如下，其英文名称为valoneic acid dilactone methyl ester；
ꢀ
；本发明所述的美白产品的成分（或有效成分）为没食子酸多聚体化合物vadme，还可以加入一种或多种美白产品上可接受的辅料，以改善美白产品香气、吸收等效果或便于使用，可以制成面膜、面霜、乳液、化妆水、洗面奶等美白产品，即制成美白产品上适宜的使用剂型。
8.本发明与现有技术相比具有以下有益效果：现有的美白产品中，功能好而且使用最广泛的是对苯二酚及其衍生物。但是该类物质是典型的化学合成物质，其作用与剂量也难以控制（对不同人群的安全性存在差异），对人体皮肤有可能产生伤害。采用由天然植物提取的vadme，来自于天然，与化学合成的物质相比，具有以下有益效果：1、来自于食品原料，安全性高。vadme来源于天然植物，在本技术中是从金边玫瑰花中分离得来，而金边玫瑰花本身就是食用玫瑰花，安全性高；2、对纯化的vadme进行毒性实验，证明其安全性较高；3、vadme具有独特的溶解性能：在水中具有一定的溶解性，可以用于制作水性化妆产品；vadme在油中溶解性较好，非常适合于制作乳霜型化妆品，能够涂抹后长时间产生美白作业；4、没有强烈的酸碱性，配伍性好，对皮肤无刺激；5、没有不愉快的气味，不影响产品香气香型。
附图说明
9.图1为没食子酸多聚体化合物vadme体外酪氨酸酶抑制实验结果。
具体实施方式
10.下面结合实验实例的数据和病理切片附图来进一步的阐述本发明。这些实验的事例仅用于说明本发明，不用于限制本发明的应用范围。在阅读了本发明的记载以后，本领域的科技人员对其等效的各种改动、修改和修饰，都属于本发明权利要求所限定的范围，实施例中使用的试剂，如无特殊说明，均为常规市售产品或按常规方法配制的试剂，实施例中方法如无特殊说明，均为常规实验方法。
11.实施例1：没食子酸多聚体化合物的制备将金边玫瑰花经自然晾干后打粉；用质量浓度80%的乙醇水溶液常温下超声辅助提取30min，过滤，重复提取三次，收集合并提取液，使用旋转蒸发仪将提取液45℃减压蒸发浓缩，得浸膏；将浸膏冻干，得到干燥提取物；干燥提取物使用正相硅胶柱进行化合物分离，使用二氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，二氯甲烷:甲醇体积比依次为1:0、50:1、20:1、10:
1、4:1、2:1，采用tlc对洗脱液进行检测，将含有相同组分的洗脱液合并，其中一个析出量最大的化合物检测数据如下：白色粉末，分子式：c
22h12o13
。
13
c nmr (125 mhz, dmso): δ
c 164.6 (s, c-7
″
), 159.1 (s, c-7), 159.0 (s, c-7'), 149.2 (s, c-4), 148.5 (s, c-4'), 143.1 (s, c-5
″
), 140.5 (s, c-3'), 139.8 (s, c-3), 139.5 (s, c-3
″
), 139.5 (s, c-2
″
), 136.6 (s, c-2), 136.2 (s, c-2'), 135.2 (s, c-4
″
), 113.9 (s, c-1
″
), 113.3 (s, c-1'), 111.9 (s, c-1), 110.4 (d, c-5), 108.2 (d, c-6
″
), 108.1 (d, c-5'), 108.0 (s, c-6), 106.8 (s, c-6'), 51.6 (q, c-och3)。
12.经过数据分析，该化合物结构式如下：该化合物英文名称valoneic acid dilactone methyl ester，英文简写vadme。
13.实施例2：没食子酸多聚体化合物体外酪氨酸酶抑制率测定实验前试剂和药品准备：ph=6.8缓冲液：使用磷酸二氢钾+磷酸氢二钾进行配制，配制方法如下：将3.41g的磷酸二氢钾溶到250ml的蒸馏水中，5.7055g磷酸氢二钾溶到250ml的蒸馏水中，两种溶液混合，配制成ph=6.8的缓冲液。
14.多巴溶液配制：19.72g的多巴溶解，定容至50ml。
15.阳性对照：熊果苷（200μmol/l、100μmol/l和50μmol/l）。
16.吸取80μl不同浓度vadme溶液（200μmol/l、100μmol/l和50μmol/l）、阳性对照分别加到酶标板中，继续加入预先在37℃保温的100μl多巴溶液（2mmol/l），在37℃恒温箱中放置10 min后，加入40μl酪氨酸酶溶液启动反应，反应完成后在波长为475nm下测定吸光度值，并计算酪氨酸酶抑制率，结果见图1所示，从图中看出，vadme对酪氨酸酶存在一定的抑制作用，其抑制率随着浓度的增加而增加。在200μmol/l时抑制率为18.5%，阳性对照熊果苷在200μmol/l时的抑制率为20.4%。
17.实验例3：没食子酸多聚体化合物vadme的毒性检验hacat细胞复苏与培养：hacat细胞从液氮罐中取出，放入37℃左右的水杯中迅速解冻，在生物安全柜中，将细胞快速转移到15ml离心管中，并加入4ml完全培养基，吹打均匀，1000rmp离心3min；倒掉上清液后，向离心管中加入2ml完全培养基，吹打均匀，转移到细胞培养皿中，培养基补足10ml，摇晃均匀，放置于5% co2、37℃细胞培养箱中进行细胞培养。按时观察细胞状态，在细胞长满至培养皿内80~90%左右进行细胞传代，传至第三代时，使用细胞计数仪进行计数，观察细胞活率和状态，通过调整细胞密度后待细胞活率大于90%可进行后续实验。
18.mtt细胞活力实验：把hacat细胞液密度调整为1.0
×
105个/ml，每孔200μl接板于96孔板中贴壁生长，培养24h后，将实施例1制得的vadme用培养基分别稀释成浓度150μmol/
l、100μmol/l和50μmol/l，每孔细胞内分别加入200μl不同浓度的vadme，每个浓度分别做5个平行组；同时设置空白组为每孔细胞内加入200μl培养基；培养20h后，每孔加入浓度为0.5mg/ml mtt溶液100μl，培养4h后，每孔加入dmso溶液100μl，并在暗处使用细胞震板仪充分震荡10min，使用酶标仪在570nm测定各孔吸光值，熊果苷做阳性对照。
19.存活率=实验组od值/空白组od值
×
100%结果见表1；表1 不同浓度药物作用下hacat的存活率（%）从表1可以看出，150μmol/l、100μmol/l和50μmol/l的vadme作用于hacat细胞时，其细胞存活率高于90%，故其对人体永生化角质形成细胞，在150 μmol/l以下无毒，安全性较高。
20.实验例4：b16黑色素瘤细胞抑制作用实验b16黑色素瘤细胞的复苏与培养方法同实施例3中的hacat细胞，把b16细胞培养液密度调整为1.0
×
105个/ml，每孔200μl接板于96孔板中贴壁生长，培养24h后，将实施例1制得的没食子酸多聚体化合物vadme用培养基分别稀释成150μmol/l、100μmol/l和50μmol/l，每孔细胞内分别加入200μl不同浓度的没食子酸多聚体化合物，每个浓度分别做5个平行组；同时设置空白组为每孔细胞内加入200μl培养基；培养24h、48h、72h后，每孔加入浓度为 0.5mg/ml mtt溶液100μl，培养4h后，每孔加入dmso溶液100μl，并在暗处使用细胞震板仪充分震荡10min，使用酶标仪在570 nm测定各孔吸光值，熊果苷做阳性对照，抑制率%={1-实验组od值/空白组od值}
×
100结果如表2；表2 样品vadme对b16黑色素瘤细胞抑制增殖作用（mtt法）（%）从表2可知，浓度为150μmol/l、100μmol/l和50μmol/l的vadme作用于b16黑色素瘤细胞时，随着时间和浓度的增加可有效抑制b16 黑色素瘤细胞的增殖。
21.实验例5：b16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶抑制活性测定把b16细胞密度调整为1.0
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105个/ml，每孔200μl接板于96孔板中贴壁生长，培养24h后，将实施例1制得的vadme用培养基分别稀释成150μmol/l、100μmol/l和50μmol/l，每孔细胞内分别加入200μl不同浓度的没食子酸多聚体化合物，每个浓度分别做5个平行组；同时设置空白组为每孔细胞内加入200μl培养基；培养24h后，将培养液吸出，加入50μl 1%曲拉通，放入-80℃冻存1h后取出，在室温下融化，使酪氨酸酶从细胞中释放出来，随后在37℃预温后加入10μl 1%的多巴溶液，在37℃下反应1h，测定492/475nm下的吸光值，熊果苷做阳性对照，抑制率%={1-实验组od值/空白组od值}
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100结果见表3；表3 样品对b16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的抑制(%)从表3可知，150μmol/l、100μmol/l和50μmol/l的vadme作用于b16黑色素瘤细胞时，vadme对b16黑色素瘤细胞具有抑制作用，随着时间和浓度的增加可对b16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的活性增强。
22.实验例6：b16黑色素瘤细胞内黑色素含量的测定把b16细胞密度调整为1.0
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105个/ml，每孔200μl接板于96孔板中贴壁生长，培养24h后，将实施例1制得的vadme用培养基分别稀释成150μmol/l、100μmol/l和50μmol/l，每孔细胞内分别加入200μl不同浓度的没食子酸多聚体化合物，每个浓度分别做5个平行组；同时设置空白组为每孔细胞内加入200μl培养基；培养24h、48h、72h后，收获细胞，用pbs洗涤2次，加入1mol/l naoh 1ml，并用双蒸水将naoh的终浓度稀释至0.2mol/l，置于80℃水浴中1h使细胞团块完全溶解，然后用酶标仪检测，波长492nm，熊果苷为阳性对照；黑色素合成抑制率（%）=(1-样品od值/空白孔od值)
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100结果见表4；表4 样品对b16黑色素瘤细胞内黑色素含量的测定(%)
从表4得知，浓度为150μmol/l、100μmol/l和50μmol/l的vadme作用于b16黑色素瘤细胞时，随着时间和浓度的增加可有效抑制b16黑色素瘤细胞内黑色素的产生。
23.实验例7：细胞内no含量的测定no测定使用raw264.7巨噬细胞进行测定，该细胞为人体免疫应答的第一道防线，是免疫力的主要部分，也是机体非特异性免疫的重要组成；所以假如vadme可以抑制该细胞炎症因子的产生，该化合物添加至面膜液中，在面部有炎症的情况下，不会引起面部刺激作用。采用mtt实验法测定样品对该细胞的毒性，实验方法同实验例3；根据mtt实验结果显示，150μmol/l的vadme以及熊果苷对该细胞无毒；故在该剂量下测定其抗炎效果。
24.no在体内或水溶液中极易氧化生成no2，在酸性条件下，no2与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物，进一步与萘基乙烯基二胺偶合，产物在550nm处有特征吸收峰，测定其吸光值，可以计算no含量，结果如表5；表5vadme对细胞no含量的影响表5的实验结果显示，该化合物在细胞no产生中，与模型组相比，可以明显抑制其no的生成（p《0.05）。
25.实验例8:vadme的抗炎作用实验测定的炎症因子主要为il-6、il-1β、tnf-α，使用elisa试剂盒进行测定；以il-6为例，用il-6抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的il-6会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，依次加入生物素化的il-6抗体和过氧化物酶标记的亲和素；il-6抗体与结合在包被抗体上的il-6结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去；加入显色底物(tmb)，tmb在过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色；用酶标仪在450nm波长处测od值，il-6浓度与od450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中il-6的浓度。但是结构活性不佳的il-6蛋白可能不容易被本试剂盒检出，例如原核重组表达的il-6蛋白可能无法被试剂盒检出，结果见表6；表6抗炎作用实验结果（%）实验结果显示，与dxm（阳性对照）相比，该化合物对三种炎症因子均有抑制效果（p《0.05）。
26.实验例9：vadme用于面膜液配制面膜基液配制：a相：甘油 10%、卡波姆/羟乙基纤维素 0.1%、海藻酸钠 0.1%、甜菜碱 0.5%、edta-2na 0.05%、氢化蓖麻油 0.2%；b相：低分子透明质酸 3%、高分子透明质酸 3%、寡聚分子透明质酸 3%、d-泛酸 0.5%、丙二醇 3%、尿囊素 0.15%；c相：按以下三种进行对比。
27.空白组c1相：肌肽 2%阳性对照组c2相：肌肽 2%，熊果苷3%。
28.vadme样品组c3相：肌肽 2%，vadme 3%。
29.a、b、c（实验组、阳性对照组）相中组分按上述质量分数溶于水中制成不同的溶液，将a相与b相溶液按1:1的比例混合，搅拌均匀并均匀分成3份，一份加入同体积的c1溶液做成空白组c1面膜液、一份加入同体积的c2溶液形成熊果苷对照组c2面膜液、一份加入同体积的含vadme的c3相制成面膜液c3，得到三种面膜液；接着测定各组面膜液的美白功能。肌肽在此面膜中的作用为保护作用，验证得知肌肽无美白活性，故将其作为空白对照，熊果苷+肌肽为阳性对照组，验证样品vadme的美白性能。
30.vadme在面膜液中的含量为0.1%-10.0%。
31.实验例10：vadme面膜液美白性能测定吸取实施例9制备的80μl面膜溶液加到酶标板中，继续加入预先在37℃保温的100μl多巴溶液（2mmol/l），在37℃恒温箱中放置10min后，加入40μl酪氨酸酶溶液启动反应，测定波长为475 nm。
32.根据结果显示，vadmec3面膜液对酪氨酸酶具有抑制作用，其抑制率为10.16%,达到熊果苷的77.8%，对酪氨酸酶具有较好的抑制效果。
33.表7 面膜液对酪氨酸酶的抑制作用实验结果。实验例11：实施例9面膜液mtt细胞活力实验测定把hacat细胞密度调整为3.0
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105个/ml，每孔200μl接板于96孔板中贴壁生长，培养24h后，每孔细胞内分别加入200μl面膜液，每个浓度分别做5个平行组；同时设置空白组为每孔细胞内加入200μl培养基；培养20 h后，每孔加入浓度为 0.5mg/ml mtt溶液100μl，培养4h后，每孔加入dmso溶液100μl，并在暗处使用细胞震板仪充分震荡10min，使用酶标仪在570nm测定各孔吸光值。
34.根据结果显示，面膜液对人体永生化角质形成细胞hacat无毒害作用，并且细胞存活率为95.1
ꢀ±ꢀ
1.6%。
35.实验例12：vadme面膜液对b16黑色素瘤细胞内黑色素含量的影响把b16细胞密度调整为1.0
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105个/ml，每孔200μl接板于96孔板中贴壁生长，培养24h后，每孔细胞内分别加入200μl面膜液，每个浓度分别做5个平行组；同时设置空白组为每孔细胞内加入200μl培养基；培养24h后，收获细胞，用pbs洗涤2次，加入1mol/l naoh 1ml，并用双蒸水将naoh的终浓度稀释至0.2mol/l，置于80℃水浴中1 h使细胞团块完全溶解，然后用酶标仪检测，波长492 nm，熊果苷为阳性对照；结果显示，面膜液对b16黑色素瘤细胞中黑色素的产生有一定的抑制作用，其抑制率为6.25
ꢀ±ꢀ
0.44%。
36.表8 面膜液对b16细胞黑色素含量的抑制作用实验结果。
37.实验例13：人体敏感实验将实施例9配制的面膜液进行人体敏感实验，实验中志愿者共30名，将其涂抹于皮肤上，实验进行2天，每次敷10-20分钟，两天后发现，完好的皮肤未发现过敏红肿现象，除此之外，对皮肤有破损的进行了少量实验，实验后发现，破损的皮肤并未因此发生更严重的破损和过敏。故该实验面膜可应用于市场。
38.综上，本技术通过科学规范的方法制得的没食子酸多聚体化合物vadme对酪氨酸酶有较好的抑制活性，并且应用于面膜上，在无毒副作用的剂量下，可以抑制b16黑色素瘤细胞中黑色素的产生，除此之外，该化合物还具有抗炎效果，可以明显影响细胞内炎症因子以及no含量的产生，添加于面膜中具有美白和抗炎功效。
39.以上所述仅为本发明的部分实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的原理和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。