壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球及其制备方法

1.本发明属于微纳米医疗技术领域，更具体地，本发明涉及一种具有胃肠道保护功能的壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球、及其制备方法。


背景技术：

2.甲氨蝶呤(methotrexate)为抗叶酸类抗肿瘤药，由于甲氨蝶呤可通过抑制二氢叶酸还原酶而降低四氢叶酸的形成并阻断dna合成，可有效抑制免疫炎症细胞增殖，起到免疫抑制及抗炎等作用，因此甲氨蝶呤是诸多炎性疾病的常用药物，已广泛用于类风湿关节炎、克罗恩肠炎、系统性红斑狼疮、血管炎、皮肌炎/多肌炎、风湿性多肌痛、银屑病关节炎等炎性疾病。
3.口服甲氨蝶呤是诸多中至高疾病活动度炎症患者的首选治疗方案，然而，口服甲氨蝶呤会引发严重胃肠道副反应，常会引起严重粘膜反应，如溃疡型胃炎、出血性肠炎，甚至会出现肠穿孔而致死，同时甲氨蝶呤自身缺乏炎症趋向性，极易引起主要脏器损伤甚至引起系统性毒性。此外，体循环中50％～60％的甲氨蝶呤会与血浆蛋白结合，生物半衰期仅约6小时。
4.牛血清白蛋白作为甲氨蝶呤的纳米载体得到广泛研究，牛血清白蛋白与甲氨蝶呤由于亲疏水作用力而有较好亲和力，因此可高效负载甲氨蝶呤，牛血清白蛋白具备炎症趋向能力可在炎症部位富集，此外，牛血清白蛋白纳米粒可延长甲氨蝶呤在体内的循环时间，同时其良好的生物安全性使其具备巨大临床转化潜力。
5.然而，牛血清白蛋白纳米药物口服经过胃部会受到胃部低ph及丰富蛋白酶等生理环境影响，易被破坏造成药物过早暴露，无法安全地通过胃部，对病情控制不够及时、彻底，甚至引发一系列毒副反应；且游离甲氨蝶呤易破坏胃肠粘膜完整性引起胃肠部副反应。因此，对口服甲氨蝶呤牛血清白蛋白纳米药物给予保护，使其安全有效地发挥治疗作用是一个急需攻克的难题。
6.结肠壁易穿透、ph接近中性、蛋白水解酶浓度较低且能够降低化疗药物对胃肠道的刺激，此外，肠道上皮细胞存在epr效应，纳米级粒子能优先被肠道细胞所摄取，因此，靶向结肠是可靠的纳米药物递送策略。
7.纳米微球由于其良好生物相容性、多样功能及合适尺寸被广泛应用于口服递药系统，多糖如壳聚糖及藻酸盐等能够被结肠酶降解，而胃和小肠中缺乏相应的酶，因此这种多糖材料来源的水凝胶微球可以实现纳米药物口服中的胃部保护。低ph稳定的海藻酸钙水凝胶微球在口服过程中可避免胃酸或酶对纳米药物的降解破坏，提高纳米药物稳定性，保护纳米药物在胃中不释放，在较高ph值肠道溶出，同时规避多种胃肠道副反应，因此，可口服ph依赖海藻酸钙微球递药系统可为纳米药物在胃肠道递送提供可靠屏障。然而，壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球对牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒的包封，存在包封速率低、不容易包封，容易解离的缺陷。


技术实现要素：

8.基于此，本发明的目的之一在于提供一种壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的制备方法，该制备方法可以实现将牛血清白蛋白载纳米药物快速、且高效地包封到壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球内部。
9.实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
10.一种壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的制备方法，所述方法包括以下步骤：
11.(1)、将甲氨蝶呤溶液滴入巯基化牛血清白蛋白溶液中，搅拌均匀后，即得牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液；
12.(2)、将浓度为10wt％～40wt％的氯金酸溶液逐滴加入步骤(1)中的牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液中，搅拌、离心后得到金交联甲氨蝶呤牛血清白蛋白纳米粒；所述氯金酸溶液与牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液的体积比为1:900～1000；
13.(3)、按体积比2：0.8～1.2的比例，将步骤(2)制备的金交联甲氨蝶呤牛血清白蛋白纳米粒，加入至海藻酸钠溶液中，得到水相；
14.(4)、将步骤(3)的水相通过同轴针头在氮气剪切下，滴入氯化钙水溶液中，得到海藻酸钙纳米粒微球；
15.(5)、将步骤(4)的海藻酸钙纳米粒微球用壳聚糖水溶液进行清洗，离心后冻干，即得。
16.在其中一些实施例中，步骤(2)中所述氯金酸溶液的质量百分浓度为15wt％～30wt％。
17.在其中一些实施例中，所述氯金酸溶液的质量百分浓度为18wt％～25wt％。
18.在其中一些实施例中，所述氯金酸溶液与牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液的体积比为1:945～955。
19.在其中一些实施例中，步骤(2)中所述搅拌的温度为40℃～50℃，速度为500rpm～1000rpm，时间为4小时～8小时；和/或所述离心的转速为7500rpm～8500rpm，时间为20min～30min。
20.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述甲氨蝶呤溶液与巯基化牛血清白蛋白溶液的体积比为1：8～10。
21.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述甲氨蝶呤溶液为甲氨蝶呤dmso溶液，所述甲氨蝶呤dmso溶液的浓度为1.5mg/ml～2.5mg/ml；和/或所述巯基化牛血清白蛋白溶液的浓度为2.0mg/ml～3.0mg/ml。
22.在其中一些实施例中，步骤(3)中所述海藻酸钠溶液的浓度为4mg/ml～6mg/ml。
23.在其中一些实施例中，步骤(4)中所述氮气的流速为10m/s～20m/s。
24.在其中一些实施例中，所述氯化钙水溶液的浓度为1mg/ml～6mg/ml。
25.在其中一些实施例中，步骤(4)中所述水相与氯化钙水溶液的体积比为1:10～20。
26.在其中一些实施例中，步骤(5)中所述壳聚糖水溶液的浓度为0.8mg/ml～1.2mg/ml。
27.在其中一些实施例中，步骤(5)中所述海藻酸钙纳米粒微球与壳聚糖水溶液的用量比为0.5g～1g：40ml～80ml。
28.在其中一些实施例中，步骤(5)中所述离心的转速为4000rpm～6000rpm，时间为
20min～30min。
29.本发明还提供了上述制备方法制备而得的壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球。
30.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
31.1、在本发明中，通过在巯基牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒中逐滴加入氯金酸溶液，制备得到金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒，再以此制备壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球，在此构思下，可以实现牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒简单、快速、高效地包封到壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球内部，包封率高达90％，且牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒稳定性高。
32.2、通过本发明的制备方法制备得到的壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球具备胃部保护功能(降低口服甲氨蝶呤时胃肠部副反应)，且具有药物缓释性能，能够靶向肠道部位递送甲氨蝶呤药物，可以用于肠道炎性疾病及类风湿性关节炎等多种炎性疾病的有效治疗。
附图说明
33.图1为本发明试验例1中壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的形貌图。
34.图2为本发明试验例1中壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的粒径分布频率结果图。
35.图3为本发明试验例2中不同载药纳米粒的平均粒径检测结果图。
36.图4为本发明试验例3中不同载药纳米粒和纳米粒微球的电位分析结果图。
37.图5为本发明试验例4中不同纳米粒微球7天的粒径变化图。
38.图6为本发明试验例5中甲氨蝶呤的标准曲线。
39.图7为本发明试验例5中不同载药纳米粒和纳米粒微球的包封率结果图。
40.图8为本发明试验例6中各组小鼠的足垫厚度图。
41.图9为本发明试验例6中各组小鼠的体重变化图。
具体实施方式
42.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
43.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
44.除非另外指明，本发明的实施例中所使用的实验方法，均为常规实验方法，实施例中所用到的各种试剂耗材，均为市售产品。
45.本发明首先提供了一种壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的制备方法，所述方法包括以下步骤：
46.(1)、制备牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒
47.将甲氨蝶呤溶液滴入巯基化牛血清白蛋白溶液中，搅拌均匀后，即得牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液；
48.在该步骤中，所述甲氨蝶呤溶液与巯基化牛血清白蛋白溶液的体积比为1：8～10。
所述甲氨蝶呤溶液为甲氨蝶呤dmso溶液，所述甲氨蝶呤dmso溶液的浓度为1.5mg/ml～2.5mg/ml；所述巯基化牛血清白蛋白溶液的浓度为2.0mg/ml～3.0mg/ml。
49.(2)、制备金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒
50.将浓度为10wt％～40wt％的氯金酸溶液，逐滴加入步骤(1)制备好的牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液中，搅拌后，置入100kd超滤管中离心，得到金交联甲氨蝶呤牛血清白蛋白纳米粒；氯金酸和巯基反应可以通过形成共价键或化学键交联使纳米粒结构更加稳定；
51.在该步骤中，所述氯金酸溶液与牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液的体积比为1：900～1000，优选为1：945～955；所述氯金酸溶液的质量百分浓度优选为15wt％～30wt％，更优选为18wt％～25wt％，最优选为20wt％。所述搅拌的温度为40℃～50℃，速度为500～1000rpm，时间为4小时～8小时；所述离心的转速为7500rpm～8500rpm，时间为20min～30min。
52.(3)、制备水相
53.按体积比2：0.8～1.2(优选为2:1)的比例，将步骤(2)制备的金交联甲氨蝶呤牛血清白蛋白纳米粒，加入至4mg/ml～6mg/ml(优选为5mg/ml)的海藻酸钠溶液中，得到水相；
54.(4)、通过气流控技术制备海藻酸钙纳米粒微球
55.将步骤(3)的水相通过同轴针头在氮气剪切下，滴入氯化钙水溶液中，得到海藻酸钙纳米粒微球；
56.在该步骤中，所述氮气的流速为10m/s～20m/s；所述氯化钙水溶液的浓度为1mg/ml～6mg/ml；所述水相与氯化钙水溶液的体积比为1:10～20。
57.(5)、制备壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球
58.将步骤(4)的海藻酸钙纳米粒微球用壳聚糖水溶液进行清洗，离心后冻干，即得。
59.在该步骤中，所述壳聚糖水溶液的浓度为0.8mg/ml～1.2mg/ml。所述海藻酸钙纳米粒微球与壳聚糖水溶液的用量比为0.5g～1g：40ml～80ml。所述离心的转速为4000rpm～6000rpm，时间为20min～30min。
60.以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
61.实施例1一种壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的制备方法
62.本实施例的一种壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的制备方法，包括以下步骤：
63.(1)、制备牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液
64.在2ml 10mm pbs溶液中加入5mg巯基化牛血清白蛋白，混匀后加入到棕色西林瓶中；取250μl甲氨蝶呤dmso溶液(将1mg甲氨蝶呤溶于500μl dmso溶液中)逐滴加入牛血清白蛋白溶液中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，30min后停止反应，即得牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液；置入4℃冰箱中保存备用；
65.(2)、制备金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒
66.将10μl20％的氯金酸溶液逐滴加入至10ml步骤(1)制备好的牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液中，转速为500rpm，搅拌6小时后，将溶液转入100kd超滤管中，8000rpm离心30min，纯化得到金交联甲氨蝶呤牛血清白蛋白纳米粒，将其置于4℃冰箱中备用；
67.(3)、制备水相
68.按体积比2:1的比例，将步骤(2)制备的金交联甲氨蝶呤牛血清白蛋白纳米粒，加
入至海藻酸钠溶液(称取500mg海藻酸钠粉末，加入100ml超纯水进行溶解，得到海藻酸钠水溶液)中进行预混合，得到水相；
69.(4)、通过气流控技术制备海藻酸钙纳米粒微球
70.将20ml步骤(3)的水相通过同轴针头在流速为20m/s的氮气剪切下，滴入200ml氯化钙水溶液(称取500mg无水氯化钙，将其溶于100ml超纯水中，得到氯化钙水溶液)中，得到海藻酸钙纳米粒微球；
71.(5)、制备壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球
72.将1g步骤(4)的海藻酸钙纳米粒微球用50ml壳聚糖水溶液(称取100mg壳聚糖，用100ml pbs水溶液将其溶解，置于4℃冰箱备用)清洗三遍，5000rpm离心20min，去上清，冻干机冻干，即得壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球。
73.实施例2一种壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的制备方法
74.本实施例的一种壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的制备方法，包括以下步骤：
75.(1)、制备牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液
76.在2ml 10mm pbs溶液中加入5mg巯基化牛血清白蛋白，混匀后加入到棕色西林瓶中；取250μl甲氨蝶呤dmso溶液(将1mg甲氨蝶呤溶于500μl dmso溶液中)逐滴加入牛血清白蛋白溶液中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，30min后停止反应，即得牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液；置入4℃冰箱中保存备用；
77.(2)、制备金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒
78.将10μl 25％的氯金酸溶液逐滴加入至步骤(1)制备好的9ml牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液中，转速为500rpm，搅拌6小时后，将溶液转入100kd超滤管中，8000rpm离心30min，纯化得到金交联甲氨蝶呤牛血清白蛋白纳米粒，将其置于4℃冰箱中备用；
79.(3)、制备水相
80.按体积比2:1的比例，将步骤(2)制备的金交联甲氨蝶呤牛血清白蛋白纳米粒，加入至海藻酸钠溶液(称取500mg海藻酸钠粉末，加入100ml超纯水进行溶解，得到海藻酸钠水溶液)中进行预混合，得到水相；
81.(4)、通过气流控技术制备海藻酸钙纳米粒微球
82.将15ml步骤(3)的水相通过同轴针头在流速为20m/s的氮气剪切下，滴入200ml氯化钙水溶液(称取500mg无水氯化钙，将其溶于100ml超纯水中，得到氯化钙水溶液)中，得到海藻酸钙纳米粒微球；
83.(5)、制备壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球
84.将0.8g步骤(4)的海藻酸钙纳米粒微球用40ml壳聚糖水溶液(称取100mg壳聚糖，用100ml pbs水溶液将其溶解，置于4℃冰箱备用)清洗三遍，5000rpm离心20min，去上清，冻干机冻干，即得壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球。
85.实施例3一种壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的制备方法
86.本实施例的一种壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的制备方法，包括以下步骤：
87.(1)、制备牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液
88.在2ml 10mm pbs溶液中加入5mg巯基化牛血清白蛋白，混匀后加入到棕色西林瓶中；取250μl甲氨蝶呤dmso溶液(将1mg甲氨蝶呤溶于500μl dmso溶液中)逐滴加入牛血清白蛋白溶液中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，30min后停止反应，即得牛血清白蛋白载甲氨蝶呤
纳米粒溶液；置入4℃冰箱中保存备用；
89.(2)、制备金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒
90.将10μl 15％的氯金酸溶液逐滴加入至步骤(1)制备好的10ml牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒溶液中，转速为500rpm，搅拌6小时后，将溶液转入100kd超滤管中，8000rpm离心30min，纯化得到金交联甲氨蝶呤牛血清白蛋白纳米粒，将其置于4℃冰箱中备用；
91.(3)、制备水相
92.按体积比2:1的比例，将步骤(2)制备的金交联甲氨蝶呤牛血清白蛋白纳米粒，加入至海藻酸钠溶液(称取500mg海藻酸钠粉末，加入100ml超纯水进行溶解，得到海藻酸钠水溶液)中进行预混合，得到水相；
93.(4)、通过气流控技术制备海藻酸钙纳米粒微球
94.将10ml步骤(3)的水相通过同轴针头在流速为20m/s的氮气剪切下，滴入200ml氯化钙水溶液(称取500mg无水氯化钙，将其溶于100ml超纯水中，得到氯化钙水溶液)中，得到海藻酸钙纳米粒微球；
95.(5)、制备壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球
96.将0.5g步骤(4)的壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球用40ml壳聚糖水溶液(称取100mg壳聚糖，用100mlpbs水溶液将其溶解，置于4℃冰箱备用)清洗三遍，5000rpm离心20min，去上清，冻干机冻干，即得壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球。试验例1本发明实施例1中壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的形貌及粒径分布频率
97.1、形貌
98.将实施例1中的壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球，用pbs重悬后，置于载玻片上，使用荧光显微镜观察其形貌，结果如图1所示。
99.从图1可以看出，实施例1的壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球呈粒径均一、分散性良好的球形。
100.2、粒径分布频率
101.将实施例1中的壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球在显微镜下进行粒径观察，并记录其大概粒径大小，将记录的数据进行统计。
102.实施例1中的壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球的粒径分布频率如图2所示，共统计84个微球粒径，平均粒径大约在226
±
13μm。
103.试验例2不同纳米粒的平均粒径检测
104.本试验例使用激光粒度分析仪，对不同纳米粒的平均粒径进行了检测。其中纳米粒包括：
105.1、牛血清白蛋白载甲氨蝶呤(实施例1步骤1的牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒)
106.2、金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤(实施例1步骤2的牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒)
107.3、金交联牛血清白蛋白(制备方法为：在2ml 10mm pbs溶液中加入5mg巯基化牛血清白蛋白，混匀后加入到棕色西林瓶中，将1ml 20％的氯金酸溶液逐滴加入至900ml牛血清白蛋白溶液中，转速为500rpm，搅拌6小时后，将溶液转入100kd超滤管中，8000rpm离心30min，得到金交联牛血清白蛋白纳米粒)
108.不同纳米粒的平均粒径检测结果如图3所示。
109.从图3可知，金交联牛血清白蛋白纳米粒、牛血清白蛋白载甲氨蝶呤及金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒平均粒径分别为205、225及270，无统计学差异，说明制备的纳米粒均符合纳米给药尺寸，金离子的加入没有破坏纳米尺寸。
110.试验例3不同载药纳米粒和纳米粒微球的电位分析
111.本试验例使用马尔文粒度仪，对不同载药纳米粒和纳米粒微球进行了电位分析。其中不同载药纳米粒和纳米粒微球包括：
112.1、金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤(实施例1步骤2的牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒)
113.2、海藻酸钙微球
114.制备方法为：将水相(海藻酸钠水溶液20ml)通过同轴针头在流速为20m/s的氮气剪切下，滴入200ml氯化钙水溶液(称取500mg无水氯化钙，将其溶于100ml超纯水中，得到氯化钙水溶液)中，得到海藻酸钙微球。
115.3、海藻酸钙载金牛甲纳米粒微球(即海藻酸钙载金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒微球，实施例1中步骤4的海藻酸钙纳米粒微球)
116.4、壳聚糖海藻酸钙纳米载金牛甲纳米粒微球(即壳聚糖海藻酸钙载金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒微球，实施例1最终制备得到的产物)
117.不同载药纳米粒和纳米粒微球的电位分析结果如图4所示。
118.从图4可以看出，海藻酸钠微球具有较强的负电势，包载纳米粒之后电势得到中和，外面壳聚糖的加入使正电荷加强，表明本发明的壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球在胃部h
+
丰富条件下可能更稳定。
119.试验例4不同纳米粒的7天粒径变化
120.本试验例比较了牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒(即实施例1步骤1中牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒)和金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒(即实施例1步骤2中金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒)7天内的粒径变化。
121.结果如图5所示，牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒的粒径在一周内呈逐渐增大的趋势，而金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒的粒径在一周内基本保持稳定，说明氯金酸溶液的加入，有助于纳米粒的粒径稳定。
122.试验例5不同载药纳米粒和纳米粒微球的包封率
123.本试验例对不同载药纳米粒和纳米粒微球进行了包封率检测。
124.制备0mg/ml、0.00005mg/ml、0.0005mg/ml、0.0025mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.00125mg/ml的甲氨蝶呤溶液，取1ml，使用紫外-可见光分光光度计，在303nm处分别检测其吸光度值，然后以浓度为横坐标以吸光度为纵坐标做直线图，标准曲线如图6所示，得到标准曲线方程y＝42.681x-0.006；r2＝0.9998。
125.使用上述同样的方法，检测不同载药纳米粒和纳米粒微球中甲氨蝶呤的吸收值，并根据标准曲线方程计算出对应甲氨蝶呤浓度，计算包封率，结果如图7所示。
126.其中，载药纳米粒和纳米粒微球包括：
127.1、牛血清白蛋白载甲氨蝶呤(即实施例1步骤1中牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒)
128.2、金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤(即实施例1步骤2中金交联牛血清白蛋白载甲
氨蝶呤纳米粒)
129.3、壳聚糖海藻酸钙纳米微球载牛甲纳米粒(即壳聚糖海藻酸钙微球载牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒，实施例1中省略步骤2制备得到的产物)
130.4、壳聚糖海藻酸钙纳米微球载金牛甲纳米粒(即壳聚糖海藻酸钙微球载金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒，实施例1最终制备得到的产物)
131.结果如图7所示，牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒(序号1)的包封率为80％左右，而金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤纳米粒(序号2)的包封率为90％左右，包封率略有升高。
132.壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球载金牛甲纳米粒(即序号4)与壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球载牛甲纳米粒(序号3)相比，包封率显著提高，说明金离子的加入提高微球负载白蛋白纳米粒时的稳定性，使白蛋白载药纳米粒在微球制备过程中不易解聚。
133.试验例6本发明的壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球对类风湿性关节炎的治疗效果
134.本试验例验证了本发明的壳聚糖海藻酸钙纳米粒微球对类风湿性关节炎的治疗效果。
135.实验方法包括如下：
136.1、在sd大鼠右足底注射200ul弗氏完全佐剂，从第7天开始，按以下分组每天灌胃给药300ug。
137.2、分组
138.(1)、正常对照组
139.(2)、造模不治疗组
140.(3)、甲氨蝶呤组
141.(4)、牛血清白蛋白载甲氨蝶呤组(实施例1步骤1的产物)
142.(5)、金交联牛血清白蛋白载甲氨蝶呤组(实施例1步骤2的产物)
143.(6)、壳聚糖海藻酸钙微球载牛甲纳米粒组(实施例1省略步骤2的产物)
144.(7)、壳聚糖海藻酸钙微球载金牛甲纳米粒组(实施例1的最终产物)
145.3、治疗30天后，对大鼠足垫厚度进行了测量，对大鼠的体重进行了称量。
146.结果如图8和图9所示。
147.结果表明：与除正常鼠的其他各组相比，壳聚糖海藻酸钙微球载金牛甲纳米粒组(即第7组，实施例1的最终产物壳聚糖海藻酸钙载药微球)的足垫厚度显著降低，治疗效果更好。与壳聚糖海藻酸钙微球载牛甲纳米粒组(即第6组)相比，壳聚糖海藻酸钙微球载金牛甲纳米粒组(即第7组)，大鼠足垫厚度也表现出显著降低(图8)。
148.与除正常鼠的其他各组相比，壳聚糖海藻酸钙微球载金牛甲纳米粒组(即第7组，实施例1的最终产物壳聚糖海藻酸钙载药微球)的体重变化更接近正常鼠体重变化，因此推测其腹泻肠胃副反应更低，在保证治疗效果的前提下减轻了毒副反应。与壳聚糖海藻酸钙微球载牛甲纳米粒组(即第6组)相比，壳聚糖海藻酸钙微球载金牛甲纳米粒组(即第7组)，大鼠的体重变化也表现出更小(图9)。
149.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
150.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并
不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。