一种猪蓝耳病灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫方法与流程

1.本发明属于生物制品领域，具体涉及一种猪蓝耳病灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫方法。


背景技术：

2.蓝耳病，即猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome， prrs)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，prrsv)引起的一种高传染性、高致死性的烈性传染病。目前该病的防控手段主要为“生物安全控制，饲养环境管理，接种疫苗和药物保健”，其中接种疫苗是较为有效的防控手段。我国疫苗研究种类繁多，有灭活疫苗，弱毒疫苗，以及深入分子水平的疫苗。目前蓝耳弱毒活疫苗占据了主流市场，因活疫苗产生抗体快，初期使用能产生短期控制prrs的效果。但弱毒疫苗免疫后可诱发病毒血症，长达一个月左右，使疫苗毒得以污染传播。蓝耳病会出现针对此病毒的非中和性抗体产生依赖性作用，且随着非中和抗体在体内溶度的增加prrsv的感染情况更加严重。同时蓝耳病毒本身存在容易变异与免疫逃避现象，长期高强度的蓝耳活疫苗免疫，可能会促进蓝耳病野毒的变异，甚至加速重组，毒力返强等，增加了病毒毒株的多样性。而灭活苗具有安全、不存在散毒和造成新疫源，也不返强等优点，完全符合我国未来的养猪业疫病防控需求。
3.猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，csfv)引起的一种接触性传染病，临床以高热、出血，并伴有高死亡率为特征，该病严重危害了我国养猪业的健康稳定发展。目前，该病的治疗尚无特效药物,采取免疫预防和及时淘汰感染猪是预防该病的最佳选择。当前大多数疫苗都为猪瘟弱毒疫苗，可分为细胞源的和兔源的。兔源猪瘟活疫苗又叫猪瘟脾淋苗，将猪瘟病毒接种健康家兔，收获出现定型热的兔体脾脏与肠系膜淋巴结研磨制备而成的疫苗。该疫苗进入猪机体后不仅可通过猪瘟病毒刺激机体产生抗体发挥体液免疫作用，而且脾淋组织的转移因子还能刺激机体产生细胞免疫反应。
4.目前临床上猪瘟疫苗与蓝耳疫苗是根据免疫程序分别免疫猪群的，或两种疫苗同时免疫采用分点注射，即两针或多针。存在猪群免疫应激大，猪场兽医工作强度大的缺点。蓝耳疫苗要发挥其免疫保护，不仅需要体液免疫还需细胞免疫。目前蓝耳灭活疫苗缺乏刺激机体产生特异性细胞免疫的能力。此外，现有的猪瘟脾淋苗采用研磨组织工艺进行配苗后冻干，颗粒不够细致均匀，疫苗注入机体后无法在短时间内快速大量释放脾淋因子。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种猪蓝耳病灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫方法。本发明的技术思路如下：细胞免疫在蓝耳病的防控中起着极为重要的作用。像所有其他病毒性疾病一样，细胞免疫在抗病毒感染中起着重要的作用，它对病毒的清除和疾病的预防有重要的意义。由prrsv感染引起的细胞免疫反应通常出现较晚，一般在感染后4周才能检测到，且只能维持3周左右。脾淋转移因子是提高机体细胞免疫反应的良好佐剂。为弥补
prrs疫苗免疫后出现的细胞免疫空白期，本发明采用含抗 prrsv特异性脾淋转移因子的纳米级别的兔源猪瘟活疫苗(简称兔源猪瘟活疫苗)与 prrsv灭活疫苗进行联合免疫，其中纳米级别的兔源猪瘟活疫苗进入机体后可在短时间内快速且大量的提供含抗prrsv的脾淋因子可有效刺激机体的细胞免疫反应促进细胞免疫应答。同时，所选的两种疫苗在临床上仔猪推荐的首免时间相近。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种猪蓝耳病灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫方法，包括以下步骤：
8.1)猪蓝耳病灭活疫苗的制备
9.将prrsv疫苗种毒，按细胞生长维持液体积的0.5～2％接种于长至致密单层的 marc-145细胞中，培养48～60h收获prrsv抗原，灭活前prrsv抗原效价≥10
8.5
tcid
50
/ml，将收获的prrsv抗原采用灭活剂(非甲醛)灭活，灭活剂与抗原的体积比为1:2000～1:5000，由此获得prrsv灭活抗原，待灭活检验和无菌检验合格后，将prrsv灭活抗原当成水相，与油相(佐剂)按重量比为1:1～1:9的比例混匀乳化，制成猪蓝耳病灭活疫苗。该疫苗的剂型可以是但不仅限于是水包油或水包油包水剂型。
10.2)兔源猪瘟活疫苗的制备
11.将步骤1)中获得的prrsv灭活抗原与猪瘟兔化弱毒同时接种于健康大兔中，选择出现定型热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，无菌采集兔体脾脏、淋巴结，将其与溶剂(生理盐水、pbs溶液、牛奶蔗糖保护剂等)按1:0.5～1:2的重量比混匀研磨，匀浆，100目筛过滤去除筋膜、脂肪等，得到脾淋组织，然后通过在线控温于4℃的超高压连续流均质机将此脾淋组织制备成纳米级的脾淋匀浆，再将纳米级的脾淋匀浆与牛奶蔗糖冻干保护剂按1:1～1:3的体积比冻干(要求1头份成品含脾淋组织≥0.01g)，即为含抗prrsv特异性脾淋转移因子纳米级的兔源猪瘟活疫苗冻干苗。
12.3)联合免疫方法
13.3-1)疫苗的混合
14.实行联合免疫前，将猪蓝耳病灭活疫苗和兔源猪瘟活疫苗进行回温，待回温至常温后，用1头份(2ml)的猪蓝耳病灭活疫苗溶解1头份兔源猪瘟活疫苗，得到混合疫苗；
15.3-2)免疫程序
16.将28～35日龄仔猪采用混合疫苗进行免疫，混合疫苗充分混匀后按2ml/头的剂量进行免疫，首次联合免疫后21～30d，按步骤3-1)加强免疫一次，联合免疫要求两种疫苗现混现用。
17.需要说明的是
18.步骤1)中，猪蓝耳病灭活疫苗剂型，不局限于水包油、水包油包水等剂型，只要是可溶解冻干苗的剂型均可。
19.步骤2)中，兔源猪瘟活疫苗制备时，兔子的接种方案除了采用上述方式(prrsv 灭活抗原与猪瘟活病毒直接接种于大兔)，也可以采用以下方式：大兔预先接种 prrsv灭活抗原1～2次，间隔14d，再将prrsv灭活抗原与猪瘟兔化弱毒接种于大兔。
20.3)本发明提供的联合免疫方法不局限于蓝耳病灭活疫苗和猪瘟活疫苗，其他疫苗也可以类似方法进行联合免疫。
21.本发明具有以下有益效果：
22.1、联合免疫降低免疫应激
23.猪瘟疫苗仔猪正常免疫程序：首免25-30日龄；加强免疫：60-70日龄；而蓝耳疫苗仔猪正常免疫程序：首免28-35日龄；加强免疫：56-63日龄。以上，两种疫苗分开免疫或两种疫苗同时免疫时采用分点注射，即两针或多针。
24.本发明技术方案以猪蓝耳病灭活疫苗直接稀释兔源猪瘟活疫苗，进行联合免疫，其含抗prrsv特异性脾淋转移因子的猪瘟活疫苗相当于蓝耳灭活苗的免疫增强剂，在实现一针两防的基础上还可以降低猪群免疫应激，效提高蓝耳灭活疫苗的临床免疫效果，减轻兽医工作强度。
25.2、制备纳米级别兔源猪瘟活疫苗
26.传统的猪瘟脾淋苗采用研磨工艺制成的含猪瘟活病毒的脾淋组织疫苗，颗粒大小不均匀，疫苗注入机体后无法在短时间内快速大量释放脾淋因子。
27.本发明将兔源猪瘟活疫苗制成纳米级别，使得脾淋组织在体内可快速的、大量的释放脾淋因子，激活机体的细胞免疫反应。
28.3、提升免疫效果
29.现有的猪蓝耳病灭活疫苗缺乏特异性的刺激机体产生细胞免疫反应的增强剂，而本发明制备含抗prrsv特异性脾淋转移因子的兔源猪瘟活疫苗，可提高蓝耳灭活疫苗的特异性的细胞免疫反应，成为猪蓝耳病灭活疫苗的一种免疫增强剂。
附图说明
30.图1是各试验组淋巴细胞活性趋势图。
具体实施方式
31.实施例1
32.不同免疫方法对比
33.1)猪蓝耳病灭活疫苗
34.将prrsv疫苗种毒，按细胞生长维持液体积的0.5～2％接种于长至致密单层的 marc-145细胞中，培养48～60h，收获prrsv抗原，灭活前prrsv抗原效价≥10
8.5
tcid
50
/ml。将收获的prrsv抗原采用灭活剂(非甲醛)灭活，灭活剂与prrsv 抗原的体积比为1:2000～1:5000，由此获得prrsv灭活抗原。待灭活检验和无菌检验合格后，将prrsv灭活抗原当成水相，与油相(佐剂)按1:1～1:9的重量比混匀乳化，制成猪蓝耳病灭活疫苗。该疫苗的剂型可以是但不仅限于是水包油或水包油包水剂型。
35.2)兔源猪瘟活疫苗的制备
36.把步骤1)中的prrsv灭活抗原与猪瘟兔化弱毒同时接种于健康大兔，选择出现定型热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，无菌采集兔体脾脏、淋巴结，将其与溶剂(生理盐水)按1:0.5～1:2的重量比混匀研磨，匀浆，100目筛过滤去除筋膜、脂肪等，得到脾淋组织，然后用在线控温于4℃的超高压连续流均质机将此脾淋组织制备成纳米级的脾淋匀浆，再将纳米级的脾淋匀浆与牛奶蔗糖冻干保护剂按1:1～1:3的体积比(要求1头份成品含脾淋组织≥0.01g)，即为含抗prrsv特异性脾淋转移因子纳米级的兔源猪瘟活疫苗冻干苗。
37.3)免疫方法
38.3-1)分组与免疫程序
39.将28-35日龄健康易感仔猪随机分为abcd四组，每组10头。
40.a组：猪蓝耳病灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫组，每头仔猪免疫方式为：将1头份(2ml)的猪蓝耳病灭活疫苗溶解1头份兔源猪瘟活疫苗，充分混匀后免疫仔猪；
41.b组：猪蓝耳病灭活疫苗免疫组，仅免疫猪蓝耳病灭活疫苗，免疫剂量2ml/头；
42.c组：兔源猪瘟活疫苗免疫组，仅免疫兔源猪瘟活疫苗，免疫剂量1头份/头；
43.d组(对照组)：注射生理盐水，剂量2ml/头；
44.免疫程序如表1：
45.表1各试验组的免疫接种程序和接种剂量
[0046][0047]
3-2)淋巴细胞免疫活性测定
[0048]
免前、免后1d、3d、5d、7d、14d、21d、28d对各组进行采血分离淋巴细胞，用 e型玫瑰花环试验方法对比各试验组淋巴细胞的活性，结果如表2、图1所示。
[0049]
表2各试验组各时间点淋巴细胞活性比例平均值 (淋巴细胞活性ea％＝e阳性细胞/200个淋巴细胞)
[0050][0051]
从图1可知，a组免后淋巴细胞的活性比例优于其他组；c组优于b组。说明脾淋组织
的脾淋因子进入机体后可活化外周血的淋巴细胞，提高机体的细胞免疫水平。免后5-7d其活化的淋巴细胞上升较快且于免后21d趋于平稳，在免后28d后处于下降趋势，而猪群免疫蓝耳疫苗后一般在免后21天出现抗体转阳。因此，活化的淋巴细胞在抗体转阳后下降，这可达到填补蓝耳疫苗的免疫空白期的作用。
[0052]
2-3)抗体检测
[0053]
一免后30d，二免后7d、14d，对各试验组进行采血分离血清，用试剂盒检测各组抗体水平。其中检测猪瘟抗体水平用idexx猪瘟抗体检测试剂盒检测，阻断率≥40％时为阳性，检测蓝耳抗体水平用hipra蓝耳抗体检测试剂盒检测，irpc＞20时为阳性。抗体阳性率结果如表3、表4所示。
[0054]
表3各试验组一免后30d，二免后7d、14d的蓝耳抗体阳性率 (抗体阳性头数/免疫总头数)
[0055][0056]
表4各试验组一免后第30天，二免后15天猪瘟抗体阳性率 (抗体阳性头数/免疫总头数)
[0057][0058]
从表3可知，a组二免后7d蓝耳抗体阳性率(7/10)高于b组(4/10)，说明本发明所述的兔源猪瘟活疫苗可提高蓝耳灭活疫苗的抗体水平。从表4可知，a组的蓝耳灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫同c组兔源猪瘟活疫苗相比，其猪瘟抗体阳性率于一免后30d均达10/10的阳性。说明蓝耳灭活疫苗不影响兔源猪瘟活疫苗产生抗体。
[0059]
3-4)疫苗保护率(攻毒后剖检观察)
[0060]
于二免后14d进行攻毒，强毒为prrsv检验用强毒，攻毒剂量为1ml/头。攻毒后14d剖检观察肺脏、淋巴结的病变情况。攻毒后内脏剖检发病标准：肺脏呈红褐色花斑状，不塌
陷；淋巴结中度到重度肿大。
[0061]
表5各试验组攻毒后肺脏、淋巴结保护情况
[0062]
分组疫苗接种疫苗保护率a组蓝耳灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫8/10b组蓝耳灭活疫苗6/10c组兔源猪瘟活疫苗1/10d组(对照组)生理盐水0/10
[0063]
从表5可知，a组蓝耳灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫组的攻毒保护率高于其余三组。说明蓝耳灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫可提高蓝耳灭活疫苗的临床保护效果。
[0064]
综上，本实施例采用含抗prrsv特异性脾淋转移因子的纳米级别的兔源猪瘟活疫苗与猪蓝耳病灭活疫苗进行联合免疫，其中纳米级别的兔源猪瘟活疫苗进入机体后可在短时间内快速且大量的提供含抗prrsv的脾淋因子，有效刺激机体的细胞免疫反应促进细胞免疫应答，提高猪蓝耳病灭活疫苗的临床免疫效果。同时，猪蓝耳病灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫，可实现一针防两病，减少免疫接种次数，降低猪群免疫应激，提高免疫效果。
[0065]
实施例2
[0066]
一种猪蓝耳病灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫方法，包括以下步骤
[0067]
1)猪蓝耳病灭活疫苗的制备
[0068]
将prrsv疫苗种毒，按细胞生长维持液体积的0.5％接种于长至致密单层的 marc-145细胞中，培养48h收获prrsv抗原，灭活前prrsv抗原效价≥10
8.5
tcid
50
/ml，将收获的prrsv抗原采用非甲醛灭活剂灭活，灭活剂与抗原的体积比为1:2000，由此获得prrsv灭活抗原，待灭活检验和无菌检验合格后，将prrsv 灭活抗原当成水相，与油相(佐剂)按1:1的重量比混匀乳化，制成猪蓝耳病灭活疫苗。
[0069]
2)兔源猪瘟活疫苗的制备
[0070]
将步骤1)中获得的prrsv灭活抗原与猪瘟兔化弱毒同时接种于健康大兔中，选择出现定型热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，无菌采集兔体脾脏、淋巴结，将其与溶剂(pbs溶液)按1:0.5的重量比混匀研磨，匀浆，100目筛过滤去除筋膜、脂肪等，得到脾淋组织，然后通过在线控温于4℃的超高压连续流均质机将此脾淋组织制备成纳米级的脾淋匀浆，再将纳米级的脾淋匀浆与牛奶蔗糖冻干保护剂按1:1的体积比冻干(要求1头份成品含脾淋组织≥0.01g)，即为含抗prrsv特异性脾淋转移因子纳米级的兔源猪瘟活疫苗冻干苗。
[0071]
3)联合免疫方法
[0072]
3-1)疫苗的混合
[0073]
实行联合免疫前，将猪蓝耳病灭活疫苗和兔源猪瘟活疫苗进行回温，待回温至常温后，用1头份(2ml)的猪蓝耳病灭活疫苗溶解1头份兔源猪瘟活疫苗，得到混合疫苗；
[0074]
3-2)免疫程序
[0075]
将28～35日龄仔猪采用混合疫苗进行免疫，混合疫苗充分混匀后按2ml/头的剂量进行免疫，首次联合免疫后21d，按步骤3-1)加强免疫一次，联合免疫要求两种疫苗现混现用。
[0076]
实施例3
[0077]
一种猪蓝耳病灭活疫苗与兔源猪瘟活疫苗联合免疫方法，包括以下步骤
[0078]
1)猪蓝耳病灭活疫苗的制备
[0079]
将prrsv疫苗种毒，按细胞生长维持液体积的2％接种于长至致密单层的 marc-145细胞中，培养60h收获prrsv抗原，灭活前prrsv抗原效价≥10
8.5
tcid
50
/ml，将收获的prrsv抗原采用非甲醛灭活剂灭活，灭活剂与抗原的体积比为1:5000，由此获得prrsv灭活抗原，待灭活检验和无菌检验合格后，将prrsv 灭活抗原当成水相，与油相(佐剂)按1:9的重量比混匀乳化，制成猪蓝耳病灭活疫苗。
[0080]
2)兔源猪瘟活疫苗的制备
[0081]
将步骤1)中获得的prrsv灭活抗原与猪瘟兔化弱毒同时接种于健康大兔中，选择出现定型热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，无菌采集兔体脾脏、淋巴结，将其与溶剂(牛奶蔗糖保护剂)按1:2的重量比混匀研磨，匀浆，100目筛过滤去除筋膜、脂肪等，得到脾淋组织，然后通过在线控温于4℃的超高压连续流均质机将此脾淋组织制备成纳米级的脾淋匀浆，再将纳米级的脾淋匀浆与牛奶蔗糖冻干保护剂按1:3的体积比冻干(要求1头份成品含脾淋组织≥0.01g)，即为含抗prrsv 特异性脾淋转移因子纳米级的兔源猪瘟活疫苗冻干苗。
[0082]
3)联合免疫方法
[0083]
3-1)疫苗的混合
[0084]
实行联合免疫前，将猪蓝耳病灭活疫苗和兔源猪瘟活疫苗进行回温，待回温至常温后，用1头份(2ml)的猪蓝耳病灭活疫苗溶解1头份兔源猪瘟活疫苗，得到混合疫苗；
[0085]
3-2)免疫程序
[0086]
将28～35日龄仔猪采用混合疫苗进行免疫，混合疫苗充分混匀后按2ml/头的剂量进行免疫，首次联合免疫后30d，按步骤3-1)加强免疫一次，联合免疫要求两种疫苗现混现用。