选择性EZH2抑制剂在制备治疗干燥综合征药物中的应用的制作方法

选择性ezh2抑制剂在制备治疗干燥综合征药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及选择性ezh2抑制剂在制备治疗干燥综合征药物中的应用。


背景技术：

2.干燥综合征(syndrome,ss)是一种常见的系统性自身免疫性疾病，其特征是唾液腺(sgs)和泪腺受损，常导致口和眼干燥、疲劳和关节疼痛。ss是严重影响患者生活质量的全球性疾病，ss患者发生b细胞淋巴瘤的风险是普通人群的15-20倍。然而，到目前为止，还没有临床上有效的治疗ss的药物。已有药物侧重于对症改善症状，或控制和延缓免疫反应。对症改善症状的药物无法延缓免疫病理损伤，而延缓免疫病理损伤的药物无法改善口干、眼干等症状。因此，开发既能改善症状又能控制免疫病理损伤潜在的新药是一个非常紧迫的问题。


技术实现要素：

3.有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种选择性ezh2抑制剂在制备治疗干燥综合征药物中的应用。
4.所述选择性ezh2抑制剂包括gsk343。
5.所述选择性ezh2抑制剂还包括gsk343药学上可接受的盐。
6.所述gsk343或其药学上可接受的盐，每单位剂量5-100mg活性成分，施用于约40-100kg的人个体。
7.所述施用为每日1-2次。
8.本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求2或3的用于所述用途的化合物和一种或多种药学上可接受的载体。
9.ss的发病机制复杂，涉及多种免疫细胞。就先天免疫而言，唾液腺上皮细胞(sgec)和树突状细胞(dc)一样具有抗原呈递功能。它们释放多种趋化因子和粘附分子，促进腺体中dc、巨噬细胞和淋巴细胞的积聚，破坏自身免疫耐受。在适应性免疫方面，b细胞和t细胞是ss发病机制中公认的两个重要角色。当天然免疫细胞释放ifn-α和b细胞激活因子(baff)时，b淋巴细胞被激活并在靶器官中产生自身抗体。t细胞也参与b细胞的激活，它们产生许多与ss局部炎症相关的促炎症细胞因子，包括ifn-γ、il-17和il-21。目前认为th1、th17、t卵泡辅助细胞(tfh)和cd8+t细胞促进炎症，而treg的作用仍不明确。因此，抑制这些炎症诱导细胞的积聚或破坏其功能可能是ss的有效治疗方法。
10.事实上，一些针对先天性和适应性免疫的新型治疗方法已被证明可以缓解ss的临床症状。belimumab和利妥昔单抗主要通过抑制b细胞活化发挥作用，在临床试验中显示了良好的结果。此外，t细胞增殖、抗原呈递/共刺激和生发中心(gc)形成也是ss的潜在治疗靶点。相关药物包括gsk2618960、哌替卡汀、阿巴西普、巴米奈西普等，但疗效有待进一步研究证明。
11.zeste同源物2(ezh2)增强子是一种主要的组蛋白甲基转移酶，通过诱导组蛋白h3在赖氨酸27(h3k27me3)处的三甲基化发挥免疫调节作用。对于适应性免疫，它调节th1、th2细胞、tfh和tregs的分化，维持tregs的特性，并抑制b细胞转录程序。此外，ezh2是b细胞形成gc所需的蛋白质。对于先天免疫，它促进巨噬细胞m1极化，并影响nk细胞的终末成熟和功能。目前，ezh2抑制剂在炎症相关疾病中的作用也有报道，如肠道炎症、肝炎、腹膜炎和狼疮样疾病。然而，目前还不清楚ezh2抑制剂的使用能否改善ss症状和免疫病理损伤。
12.综上所述，免疫失衡与ss的发病存在密切的关系，ezh2的表达异常是免疫失衡发生和发展的重要因素。ezh2抑制剂在炎症性疾病中的作用逐渐被认识。我们发现，在实验性ss小鼠模型中，使用选择性ezh2抑制剂gsk343降低ezh2的活性可以减轻ss模型唾液腺炎症。cd4+t和cd8+t细胞的增殖和功能被抑制可能是gsk343发挥疗效的机制。除此之外，多种炎症相关通路被抑制。这些结果为ezh2抑制剂在ss中的治疗中应用奠定了实验基础。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
14.1.本发明首次发现选择性ezh2抑制剂可应用于制备治疗干燥综合征药物中。
15.2.本发明发现了选择性ezh2抑制剂施用于人体治疗干燥综合征的有效剂量。
附图说明：
16.图1说明抑制ezh2表达可减轻唾液腺炎症。
17.在预防组中，将4周龄雌性nod小鼠分为模型组(model)与gsk343组，适应性饲养1周后，gsk343组小鼠在疾病早期(小鼠5周龄)给予腹腔注射gsk343(2mg/kg/日)，模型组小鼠给予同等剂量的pbs处理。作为对照，选取同周龄的icr小鼠作为对照组(icr组)。预防组给药4周后处死进行组织学分析。(a)icr、模型组或gsk343组小鼠颌下腺组织切片h&e染色代表性图像，显示腺体淋巴细胞浸润(标尺分别为500μm和100μm)。(b)颌下腺淋巴细胞浸润面积占颌下腺视野的总面积比值(每组n＝8，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。结果表明，模型组(model)小鼠颌下腺中的炎症明显重于对照小鼠，而经gsk预防干预的小鼠颌下腺中的炎症明显轻于模型组小鼠(model)。
18.在治疗组中，将8周龄雌性nod小鼠分为模型组与gsk343组，适应性饲养1周后，gsk343组小鼠在9周龄时给予腹腔注射gsk343(2mg/kg/日)，模型组小鼠给予同等剂量的pbs腹腔注射处理。作为对照，选取同周龄的雌性icr小鼠作为对照(icr组)，同样给予pbs腹腔处理。给药7周后处死后各组小鼠。(c、d)给药7周后将处死小鼠，并对icr、模型组或gsk343组小鼠颌下腺组织学进行分析。(c)icr组、模型组或gsk343组小鼠的颌下腺组织切片h&e染色(标尺分别为800μm和250μm)。(d)颌下腺淋巴细胞浸润面积占颌下腺视野的总面积比值(每组n＝5，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。(e)给药7周内，检测各组小鼠的唾液流率随周龄的变化。检测方法如下：麻醉后，小鼠腹腔注射毛果芸香碱(2mg/kg)。随后，研究人员立即收集了小鼠的唾液，这些小鼠保持倒立位。在口腔底部放置一根毛细血管，让唾液流入微离心管。连续收集唾液15分钟。离心后，用微量吸管测量唾液的体积。分别于10、11、12、13、14、15和16周龄测定小鼠的唾液流速(μl/15min)。(n＝5，*p《0.05，**p《0.01)。结果表明，模型组(model)小鼠颌下腺中的炎症明显重于对照小鼠，而经gsk343治疗干预的小鼠颌下腺中的炎症明显轻于模型组小鼠(model)。在唾液流率方面，在16周龄时，模型组(model)小鼠的唾液流率较对照组(icr)小鼠明显下降，而经gsk343治疗干预的小鼠唾液流
率较模型组小鼠(model)明显改善。
19.图2说明抑制ezh2可降低脾脏cd4+和cd8+t细胞
20.nod小鼠在干燥综合征疾病早期(5周龄)给予腹腔注射gsk343(2mg/kg/日)。model组的nod小鼠腹腔注射pbs。icr作为对照。给药4周后处死小鼠，取出小鼠脾脏进行流式细胞术进行检测。(a)cd4+t和cd8+t细胞的比例，(b)b细胞比例，(c)mdsc细胞的比例。差异的统计学意义采用单因素方差分析(one-way anova)检验。(n＝8/组，均数
±
s.d。***p《0.05,p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001,ns＝不显著)。结果显示，模型组(model)小鼠的脾脏中cd4+和cd8+的t细胞比例较对照组(icr)小鼠明显上升，而经gsk343干预的小鼠脾脏中cd4+和cd8+的t细胞比例较模型组小鼠(model)明显下降。模型组(model)小鼠的脾脏中b细胞比例较对照组(icr)小鼠明显下降，而经gsk343干预的小鼠脾脏中b细胞比例较模型组小鼠(model)明显上升。各组小鼠mdsc细胞比例未见明显差异。
21.图3说明抑制ezh2可降低脾脏cd4+和cd8+t细胞的功能
22.nod小鼠在干燥综合征疾病早期(5周龄)给予腹腔注射gsk343(2mg/kg/日)。model组的nod小鼠腹腔注射pbs。icr作为对照，然后进行流式细胞术检测。(a)产生ifn-γ的cd8+t细胞的比例。(b)产生tnf-α的cd8+t细胞比例。(c)产生ifn-γ的cd4+t细胞的比例。(d)产生il-4的cd4+t细胞的比例。(e)th1(cd4+ifn-γ+)/th2(cd4+il-4+)比值。差异的统计学意义采用单因素方差分析(one-way anova)检验。(n＝8/组，均数
±
s.d。***p《0.05,p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001,ns＝不显著)。模型组(model)小鼠的脾脏中cd4+和cd8+的t细胞比例较对照组(icr)小鼠明显上升，而经gsk343干预的小鼠脾脏中cd4+和cd8+的t细胞比例较模型组小鼠(model)明显下降。模型组(model)小鼠的脾脏中b细胞比例较对照组(icr)小鼠明显下降，而经gsk343干预的小鼠脾脏中b细胞比例较模型组小鼠(model)明显上升。各组小鼠mdsc细胞比例未见明显差异。
23.图4说明抑制ezh2表达可降低颌下腺引流颈淋巴结中cd4+和cd8+t细胞的比例和功能
24.nod小鼠在干燥综合征疾病早期(5周龄)给予腹腔注射gsk343(2mg/kg/日)。model组的nod小鼠腹腔注射pbs。icr作为对照。给药4周后处死小鼠取出颌下腺引流淋巴结。(a)cd4+t细胞、cd8+t细胞和b细胞的比值。(b)产生ifn-γ和tnf-α的cd8+t细胞比例代表cd8+t的功能。(c)th1/th2比值。差异的统计学意义采用单因素方差分析(one-way anova)检验。(n＝8/组，均数
±
s.d。***p《0.05,p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001,ns＝不显著)。结果显示，模型组(model)小鼠的颈部颌下腺淋巴结中cd4+和cd8+的t细胞比例较对照组(icr)小鼠明显上升，而经gsk343干预的小鼠颈部颌下腺淋巴结中cd4+和cd8+的t细胞比例较模型组小鼠(model)明显下降。模型组(model)小鼠的颈部颌下腺淋巴结中b细胞比例较对照组(icr)小鼠明显下降，而经gsk343干预的小鼠颈部颌下腺淋巴结b细胞比例较模型组小鼠(model)明显上升。
25.模型组(model)小鼠的颈部颌下腺淋巴结中cd4+和cd8+的t细胞功能较对照组(icr)小鼠明显上升，而经gsk343干预的小鼠颈部颌下腺淋巴结中cd4+和cd8+的t细胞功能较模型组小鼠(model)明显下降。
26.模型组(model)小鼠的颈部颌下腺淋巴结中th1细胞比例较对照组(icr)小鼠明显上升，而经gsk343干预的小鼠颈部颌下腺淋巴结中th1细胞比例较模型组小鼠(model)明显
下降。各组小鼠th1细胞比例未见明显差异。
27.模型组(model)小鼠的颈部颌下腺淋巴结中th1/th2细胞比值较对照组(icr)小鼠明显上升，而经gsk343干预的小鼠颈部颌下腺淋巴结中th1/th2细胞比值较模型组小鼠(model)明显下降。
28.图5说明抑制ezh2的表达可抑制nod小鼠的自身免疫信号通路
29.nod小鼠在干燥综合征疾病早期(5周龄)给予腹腔注射gsk343(2mg/kg/日)。model组的nod小鼠腹腔注射pbs。icr作为对照。给药4周后处死小鼠取出颌下腺，送检rna-seq分析(a)火山图表示de基因折叠变化≥2,p《0.05。红色表示相对表达量高，绿色表示相对表达量低。(b)利用kegg通路数据库进行基因功能富集分析。(c)b细胞受体、t细胞受体、th1、th2细胞分化信号通路及th17细胞分化信号通路的gsea富集图，评价模型与icr、gsk343、模型之间的所有degs，均显示模型组显著富集。
30.为了进一步阐明gsk343阻止ss发生的机制，我们对三组小鼠的颌下腺进行了批量rna测序分析。从sg组织提取的总rna中，我们筛选了gsk343或pbs处理的nod小鼠中显著的差异基因，并分析了kegg信号通路中deg的富集情况(图5a和5b)。引人注意的是，多个在自身免疫和炎症中发挥重要作用的信号通路参与其中，包括b细胞受体信号通路、toll样受体信号通路、nf-κb信号通路和t细胞受体信号通路(图5b)。结果表明nod小鼠中b细胞和t细胞受体信号通路被激活。gsk343处理后，这些信号通路显著抑制(图5c)。基于这些发现，我们得出结论，gsk343影响多种免疫细胞的功能，并抑制多种炎症相关信号通路。
具体实施方式：
31.一、抑制ezh2减轻干燥综合征模型(nod)小鼠唾液腺炎症和唾液腺的功能。
32.为了探讨ezh2对综合征发生影响，我们进行了预防实验，在nod小鼠5周龄时中给予pbs或gsk343(ezh2抑制剂)4周，nod小鼠是一种来源于远缘印迹控制区(icr)小鼠亚系的品系，通常用作ss小鼠模型。作为对照，与nod小鼠年龄和性别相同的icr小鼠同时接受pbs治疗4周。干预4周后，进一步的组织学检查证明nod小鼠的唾液腺已经出现病变，而gsk343治疗小鼠的组织炎症明显轻于pbs治疗小鼠(图1a-b)。
33.为了探讨ezh2对综合征发展的影响，我们进行了治疗实验。由于nod小鼠的唾液流率的下降通常发生在大约12
–
16周。故我们在nod小鼠9周龄时中给予pbs或gsk343(ezh2抑制剂)处理，同样使用同周龄同性别icr小鼠进行对照，并给予pbs处理。治疗7周后，与pbs处理的nod小鼠相比，gsk343处理的小鼠唾液腺he切片中计算的病变和浸润的炎症细胞显著减少(图1c-d)，在小鼠16周龄时，pbs干预的模型鼠唾液流率较icr小鼠明显下降，但给予gsk343干预后的nod小鼠唾液率率明显高于模型组小鼠。
34.综上所述，这些结果表明，使用gsk343处理可以改善nod小鼠唾液腺炎症和唾液腺的功能。
35.二、cd4+t和cd8+t细胞是gsk343改善ss的关键
36.由于ss是一种典型的自身免疫性疾病，在其发生和发展过程中，先天性和适应性免疫细胞起着重要作用，我们通过流式细胞术(fcm)进一步探讨gsk343如何改变各种免疫细胞的浸润。
37.首先，与icr小鼠相比，nod小鼠的外周免疫器官脾脏中的cd4+t和cd8+t细胞比例
显著增加(图2a)，在gsk343处理的nod小鼠中发现cd4+t和cd8+t细胞的比例降低(图2a)。但在nod小鼠中，b细胞的比例降低(图2b)。b细胞被认为是重要的免疫细胞，主要在晚期ss中浸润。因此，整个免疫细胞(cd45+)中的b细胞比例降低可能是由于cd4+t和cd8+t细胞比例的降低引起的，但在gsk343处理的nod小鼠中发现b细胞的比例回升(图2b)。在以前的报告中，gsk343减轻了结肠炎，与mdscs的增加有关，而在ss中，mdscs没有发生变化，gsk343对其比例也没有影响(图2c)。
38.为了进一步研究gsk343是否影响ss的发展过程cd4+t和cd8+t细胞的功能，我们检测了t细胞的功能。值得注意的是，cd8+t细胞分泌ifn-γ和tnf-α的能力在nod小鼠中增加，但在gsk343治疗后降低到正常水平(tnf-α)甚至更低(ifn-γ)(图3a和b)。同样，在nod小鼠中，cd4+t细胞产生ifn-γ的能力增强，但降低到正常水平(图3c)。nod小鼠中cd4+t细胞产生il-4的能力有所提高，但gsk343治疗对cd4+t细胞il-4无明显影响(图3d)。鉴于th1/th2细胞平衡在ss的发病机制中起着至关重要的作用，我们分析了th1和th2的比率，发现nod小鼠的th1/th2比率升高，并在gsk343治疗后恢复正常(图3e)。
39.为了验证这些免疫细胞在局部病变中是否发挥同样的作用，我们检测了颌下腺浸润淋巴结并且发现gks343治疗显著改善nod小鼠的淋巴结肿大。nod小鼠中颌下腺浸润淋巴结中cd8+t细胞数量和功能较icr小鼠明显增多和增强(图4a-b)，但在gsk343治疗后cd8+t细胞的数量和功能得到明显地抑制。nod小鼠中颌下腺浸润淋巴结中th1细胞数量及th1/th2的比例较icr小鼠明显增多，但在gsk343治疗后th1细胞数量及th1/th2的比例得到明显地抑制(图4c)。此外，b细胞在nod小鼠的颌下腺淋巴结中比例下降，gks343治疗显著提高b细胞的比例(图4a)。th2细胞在颌下腺淋巴结的比例nod小鼠与icr小鼠无明显差别，gsk343治疗后亦无明显差别(图4c)。
40.总之，这些发现表明ezh2活性的抑制可发挥免疫抑制作用，使ss发展过程cd4+t和cd8+t细胞的异常升高的数量和功能得到纠正，同时纠正了ss发展过程中th1/th2的平衡。
41.三、gsk343抑制多种免疫细胞和炎症信号通路
42.为了彻底揭示gsk343缓解ss发病的潜在途径，我们通过批量rna测序分析了三组小鼠的唾液腺组织，筛选出gsk343或pbs治疗nod小鼠的显著差异基因，并在kegg信号通路中富集筛选出的基因(图4a和b)。引人注目的是，在自身免疫和炎症中起重要作用的多种信号通路都参与其中，包括b细胞受体信号通路、toll样受体信号通路、nf-κb信号通路和t细胞受体信号通路(图4b)最近有报道称il-17在ss的发病机制中起重要作用，我们发现il-17信号通路和th17细胞分化也参与了ss的富集随后，进行gsea富集，结果发现nod小鼠的b和t细胞受体信号通路被激活，并且gsk343的施用显著抑制了这些信号(图4c)基于上述发现，我们得出结论，gsk343影响多种免疫细胞并抑制多种炎症相关信号通路。
43.以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。