一种具有非对称性结构的管状水凝胶的制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物材料领域，具体涉及一种具有非对称性结构的管状水凝胶的制备方法和应用，该管状水凝胶可用于药物局部递送、组织再生等技术领域中。


背景技术：

2.生物活性物质的局部应用通常受到其快速稀释和半衰期短的限制。药物递送系统的开发可以有效解决这一问题。然而，目前大多数药物递送系统衍生自难以获得且需要复杂化学合成的高分子材料，其生物相容性存在很大争议，并且存在潜在的生物毒性。相比之下，天然高分子材料具有良好的生物相容性、生物降解性、低毒性以及丰富的来源，可以弥补合成材料的缺陷。然而，大部分基于天然高分子材料制备的药物递送系统缺乏精巧的微纳结构，无法实现对药物释放的局部控制，限制了其进一步应用。
3.反蛋白石是一种空间有序的多孔结构，以胶体晶体为模板进行复制得到，其相互贯通的纳米孔洞以及较大的比表面积有利于生物活性物质的加载和释放。反蛋白石已被设计为不同的形态，如微球、薄膜、块状，用于各种生物医学应用，包括药物输送、环境检测和生物传感。值得注意的是，管状反蛋白石材料已被设计并应用于不同的生物医学方面。然而，这些管状反蛋白石仅具有面向外部的多孔结构，不适合生物活性物质的局部释放。
4.因此，急需一种具有面向内部的多孔反蛋白石结构的管状水凝胶，用于药物的局部递送。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术中的不足，提供一种具有非对称性结构的管状水凝胶的制备方法。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种具有非对称性结构的管状水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
8.s1、搭建玻璃毛细管同轴装置：
9.玻璃毛细管同轴装置包括内相毛细管和外相毛细管；
10.封堵内相毛细管的开口，并将其反复浸润于二氧化硅纳米颗粒溶液中，在内相毛细管表面得到管状胶体晶体模板；内相毛细管和管状胶体晶体模板从外相毛细管的轴心穿过并固定；
11.s2、制备非对称性结构水凝胶：
12.配置包含药物的水凝胶溶液，并灌注到步骤s1搭建的玻璃毛细管同轴装置中，固化后去除管状胶体晶体模板、内相毛细管以及外相毛细管；
13.s3、负载药物：
14.配置药液，将s2制备的非对称性结构水凝胶浸泡在药液中，清洗后得到内侧负载药物的管状水凝胶。
15.为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：
16.进一步地，步骤s1中，所述二氧化硅纳米颗粒溶液的溶剂为无水乙醇，利用无水乙醇的快速挥发可以实现二氧化硅纳米颗粒在内相毛细管外壁的快速自组装。
17.进一步地，步骤s1中，所述管状胶体晶体模板的厚度可以通过调节二氧化硅纳米颗粒的浓度和/或改变内相毛细管浸润于二氧化硅纳米颗粒溶液的次数进行调节。
18.进一步地，步骤s2中，所述非对称性结构水凝胶的尺寸可以通过改变内相毛细管和外相毛细管的尺寸进行调节。
19.进一步地，步骤s2中，水凝胶材料为丝素蛋白、甲基丙烯酸酯化明胶(gelma)、壳聚糖(cs)、透明质酸(ha)中的一种或多种。
20.进一步地，步骤s2中，所述水凝胶溶液包含光引发剂。
21.进一步地，步骤s3中，所述药液包含的药物为神经生长因子(ngf)。
22.一种通过上述方法制备的具有非对称性结构的管状水凝胶用于药物递送。
23.本发明的有益效果是：本发明通过搭建玻璃毛细管同轴装置、制备非对称性结构水凝胶和负载药物三个步骤提供了一种具有非对称性结构的管状水凝胶的制备方法；玻璃毛细管同轴装置搭建过程简单，且可以通过改变内相毛细管和外相毛细管的尺寸调节非对称性结构水凝胶的尺寸；管状胶体晶体模板的厚度可以通过调节二氧化硅纳米颗粒的浓度和/或改变内相毛细管浸润于二氧化硅纳米颗粒溶液的次数进行调节；水凝胶材料选用的是具有良好生物相容性、生物降解性、低毒性以及来源丰富的天然高分子；构建的水凝胶材料仅内侧具有反蛋白石结构，适宜生物活性物质的局部释放。
附图说明
24.图1为具有非对称性结构的管状水凝胶的制备流程示意图；
25.图2为具有非对称性结构的管状水凝胶的电镜图，其中，a为管状水凝胶完整截面图，b为非对称性结构的放大图，c为反蛋白石结构部分的放大图，d为管状水凝胶内壁图；为了更好地展示管状水凝胶的微纳结构，此处选择用egdma(二甲基丙烯酸乙二醇酯)替代水凝胶进行电镜表征；
26.图3中，a为ngf的标准曲线，b为ngf的累积释放曲线；
27.图4为非对称性结构的管状水凝胶应用于坐骨神经损伤修复示意图。
具体实施方式
28.实施例1
29.制备具有非对称性结构的管状水凝胶，如图1所示，具体步骤如下：
30.s1、搭建玻璃毛细管同轴装置：
31.玻璃毛细管同轴装置包括外径尺寸为1.5mm的内相毛细管和内径尺寸为2.5mm的外相毛细管；封堵内相毛细管的开口，并将其反复浸润于浓度为15％(w/v)二氧化硅纳米颗粒乙醇溶液中10次，在内相毛细管表面得到管状胶体晶体模板，管状胶体晶体模板的厚度可以通过调节二氧化硅纳米颗粒的浓度和/或改变内相毛细管浸润于二氧化硅纳米颗粒溶液的次数进行调节；内相毛细管和管状胶体晶体模板从外相毛细管的轴心穿过并利用混合硬化胶固定。
32.s2、制备非对称性结构水凝胶：
33.配制20％(w/v)的甲基丙烯酸酯化明胶和1％(v/v)光引发剂(2-羟基-2-甲基苯丙酮)的水凝胶溶液，置于水浴锅中45℃加热30min；将水凝胶溶液灌注到上述玻璃毛细管同轴装置中，静置10min，使水凝胶溶液充分填充到管状胶体晶体模板的纳米孔洞中，随后紫外光下照射1min使水凝胶固化，最后利用氢氟酸去除管状胶体晶体模板、内相毛细管以及外相毛细管，最终得到管状水凝胶(图2)；非对称性结构水凝胶的尺寸可以通过改变内相毛细管和外相毛细管的尺寸进行调节。
34.本实施例中，水凝胶材料可以替换为丝素蛋白、壳聚糖(cs)、透明质酸(ha)中的一种或多种。
35.s3、负载药物：
36.将s2制备的非对称性结构水凝胶放置在装有pbs缓冲液的无菌塑料小皿中，置于细胞超净台过夜照射紫外，进行灭菌处理，而后在超净台中配制浓度为5μg/ml的ngf溶液，并于无菌2ml离心管中保存，去除管状水凝胶表面水分，将其浸泡于ngf溶液中，置于冰箱中在4℃温度条件下过夜，之后用pbs缓冲液清洗，最终得到内侧负载ngf的管状水凝胶。
37.实施例2
38.制备具有非对称性结构的管状水凝胶，如图1所示，具体步骤如下：
39.s1、搭建玻璃毛细管同轴装置：
40.玻璃毛细管同轴装置包括外径尺寸为1.5mm的内相毛细管和内径尺寸为2.5mm的外相毛细管；封堵内相毛细管的开口，并将其反复浸润于浓度为15％(w/v)二氧化硅纳米颗粒乙醇溶液中10次，在内相毛细管表面得到管状胶体晶体模板，管状胶体晶体模板的厚度可以通过调节二氧化硅纳米颗粒的浓度和/或改变内相毛细管浸润于二氧化硅纳米颗粒溶液的次数进行调节；内相毛细管和管状胶体晶体模板从外相毛细管的轴心穿过并利用混合硬化胶固定。
41.s2、制备非对称性结构水凝胶：
42.分别配制20％(w/v)的甲基丙烯酸酯化明胶(gelma)、20％(w/v)的丝素蛋白水溶液，将gelma水溶液置于水浴锅中45℃加热30min，将丝素蛋白水溶液振荡溶解。随后，按照体积比为6：4配制gelma和丝素蛋白的混合水凝胶溶液，并加入1％(v/v)光引发剂(2-羟基-2-甲基苯丙酮)。将水凝胶溶液灌注到玻璃毛细管同轴装置中，静置10min，使水凝胶溶液充分填充到管状胶体晶体模板的纳米孔洞中，而后在紫外光下照射1min使水凝胶固化，随后加入甲醇溶液静置1h，使其进行二次交联。最后利用氢氟酸去除管状胶体晶体模板、内相毛细管以及外相毛细管，最终得到管状水凝胶(图2)；非对称性结构水凝胶的尺寸可以通过改变内相毛细管和外相毛细管的尺寸进行调节。
43.本实施例中，水凝胶材料可以替换为壳聚糖(cs)、透明质酸(ha)中的一种或多种。
44.s3、负载药物：
45.将s2制备的非对称性结构水凝胶放置在装有pbs缓冲液的无菌塑料小皿中，置于细胞超净台过夜照射紫外，进行灭菌处理，而后在超净台中配制浓度为5μg/ml的ngf溶液，并于无菌2ml离心管中保存，去除管状水凝胶表面水分，将其浸泡于ngf溶液中，置于冰箱中在4℃温度条件下过夜，之后用pbs缓冲液清洗，最终得到内侧负载ngf的管状水凝胶。
46.实施例3
47.体外ngf释放实验：
48.将实施例1或实施例2中，负载ngf的管状水凝胶置于装有1ml的pbs缓冲液的孔板中，每隔固定时间间隔取出200μl释放液于离心管中，同时再加入等体积的新鲜pbs缓冲液于孔板中补充至1ml。取出的释放液置于-20℃保存。如图3所示，全部时间点收集完成之后用elisa(酶联免疫吸附测定)试剂盒测定药物释放量，并利用标准曲线法绘制ngf累积释放曲线。
49.实施例4
50.负载ngf的管状水凝胶用于大鼠坐骨神经损伤修复：
51.s1、如图4所示，在麻醉后的sd大鼠左腿处制造切口，剥离其周围的肌肉组织，暴露坐骨神经并产生10mm的神经缺损，利用可降解8-0缝合线将负载ngf的管状水凝胶两端分别连接缺损神经的近端和远端；之后，用6-0缝合线先后缝合肌肉和皮肤。
52.s2、每周记录大鼠脚印，计算sfi(坐骨神经功能指数)，从而评估sd大鼠的功能恢复；所有大鼠均被观察8周。
53.s3、8周后，剥离再生的坐骨神经和左右腿腓肠肌，对收集的肌肉样本进行称重。用pbs溶液清洗所有样本，并用4％(w/v)的多聚甲醛溶液固定48小时。接下来，利用不同浓度(15wt％、20wt％和30wt％)的蔗糖溶液对样本进行脱水处理。然后将所得样品转移到装有最佳切割温度化合物(oct)的模具中，用于随后的冷冻切片。对再生神经中段横切面进行免疫荧光分析，选择nf200和s-100β标志物评价神经再生性能。此外，使用苏木精和伊红试剂盒(h&e)评估手术部位的腓肠肌情况。
54.以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。