一种基于ATP激活的前药抗菌体系构建方法与应用

一种基于atp激活的前药抗菌体系构建方法与应用
技术领域
1.本发明涉及一种基于atp激活的前药抗菌体系构建方法，并在实际应用中实现可控和高效的抗菌作用。


背景技术：

2.酶激活的前药治疗是一种广泛应用于癌症或抗菌领域的有效策略。利用生物酶的多样性和特异性，在特定的时间和地点将无毒前药转化为高毒性药物。最常见的前药激活策略是利用细胞微环境中过表达的酶。然而，这种方法往往受到靶组织区域内源性酶不足的限制，使得前药的激活缓慢和不充分，影响了实际的治疗效果。此外，也不是所有的前药都能被内源性酶激活。因此，人们努力开发各种载体通过将外源酶和前药共同递送到目标位置以实现高效的酶前药治疗。然而，由于酶和前药在载体中的积累和释放行为不同，这种操作往往会导致它们在目标区域中的时空分布不同。同时，酶和前药在单个载体上的同时封装，容易导致前药的提前激活。因此，通过对前药体系的合理设计，使前药体系具有区分健康组织和病变组织的响应性治疗作用，具有极其重要的意义。
3.为了使这些刺激反应系统的效能最大化，设计合理的刺激路径来达到治疗的目的是非常重要的。其中，细胞内生物分子三磷酸腺苷（atp）已被广泛应用于反应性治疗，具有广泛的适用性。atp分子是细胞内能量转移的货币单位，已知其在细胞胞质中的含量高达1*10-2 m，在细胞外液中atp含量约为0.5*10-3 m。此外，研究发现在癌组织或细菌感染组织中也存在有atp不同程度的上调。因此，在确定了特定的刺激因素后，通常需要精心设计和合成具有可降解的纳米材料或功能组件，使其具有特定反应路径的刺激敏感性。
4.金属有机框架（mofs）作为一类新型的生物纳米载体，具有高孔隙率、可调节的孔隙结构、刺激响应性和受控功能等独特的特性，近年来受到广泛关注。特别是mofs丰富的金属节点和有机官能团可以为药物的捕获提供超高容量的内在锚点。与传统模板相比，mofs能够有效的携带药物，且在受控的条件下发生药物的释放，是制备多功能和复杂化载体的候选材料。然而，mofs潜在的不足，如较差水稳定性和生物相容性限制了其在生物医学当中的应用，为了提高它们的实用价值，人们开发了膜结构、核壳结构和mofs粒子装载的水凝胶复合材料。基于水凝胶的三维多孔结构和生物相容性微环境等特性，可以实现mofs粒子和生物酶等大分子的长期固定化，并提供酶反应所需的场所。然而，最近开发的的含mofs粒子的水凝胶中，水凝胶的宏观体积在特定的精细应用中缺乏灵活性和通用性。此外，mofs在水凝胶中的随机封装和分布使得它们难以在实际应用中使用，在实际应用中需要可控和可编程的释放。这些问题极大的限制了它们在生物医学上的应用。因此，仍然期待创造具有设计形态和动态响应性的水凝胶/mofs复合材料用于前药体系的构建。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种基于atp激活的前药抗菌体系构建方法。该方法具前药和酶分隔分布、atp按需激活等特点，能够可控和高效地生产毒性小分子。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
7.一种基于atp激活的前药抗菌体系构建方法，包括以下步骤：（1）将前药和mofs混合，得到前药@mofs；（2）将所述前药@mofs和酶添加到预凝胶溶液中，配置成酶/前药@mofs/预凝胶溶液，利用微流控技术促使所述酶/前药@mofs/预凝胶溶液的凝胶化，得到酶/前药@mofs固定化水凝胶材料；（3）所述酶/前药@mofs固定化水凝胶材料经过洗涤后，即为所述基于atp激活的前药抗菌体系。
8.进一步地，所述步骤（1）具体为：将前药和2-甲基咪唑溶液混合，并加入硝酸锌溶液，反应得到前药@mofs（前药@zif-8）。
9.进一步地，所述的硝酸锌与2-甲基咪唑的摩尔比为1:4。
10.进一步地，所述的前药是吲哚-3-乙酸（iaa）。
11.进一步地，所述酶是辣根过氧化物酶（hrp）。
12.进一步地，所述预凝胶包括丙烯酰胺、n,n-亚甲基双丙稀酰胺和2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
13.进一步地，所述丙烯酰胺、n,n-亚甲基双丙稀酰胺和2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的质量比为15：1：1。
14.进一步地，所述洗涤是指用水洗涤所述酶/前药@mofs固定化水凝胶材料3次。
15.本发明还提供所述基于atp激活的前药抗菌体系在抗菌领域中的应用。
16.本发明的有益效果：本发明的酶、前药、mofs固定化方法简单，条件要求温和，易于实现；水凝胶能保护酶的催化活性和前药@zif-8的稳定性；mofs/水凝胶复合材料为前药和酶提供了有效的时空分布和加载，且在酶保有高活性的同时前药不会提前被激活；mofs受atp反应性降解的作用，随atp水平的变化发生规律性解体并释放前药，通过酶在水凝胶微环境中原位激活前药产生大量的高毒性药物，从而提高细菌感染的高效、可控治疗。
附图说明
17.图1为本发明的实施例1中的fam@zif-8在有无atp存在下的扫描电镜图。
18.图2显示了本发明的实施例3中hizp分别在0、2、5 mm atp处理后ros的生成行为。
19.图3为iaa@zif-8 + hrp和hizp体系的生物催化活性比较图。
20.图4显示了不同反应体系iaa + hrp、iaa@zif-8 + hrp 和 hizp 的抗菌性能。
具体实施方式
21.本发明提供一种基于atp激活的前药抗菌体系构建方法，使用具有atp响应性的金属有机框架（mofs）作为前药载体与酶在空间上发生分隔，同时作为atp的激活单元；利用微流控装置构建了加载前药和酶的水凝胶，在保护前药和酶稳定性的同时为它们提供了反应空间。所述基于atp激活的前药抗菌体系又称为固定化酶前药的水凝胶/金属有机框架复合材料，其具体构建步骤可以为：1）将一定质量前药置于配体500 mm 2-甲基咪唑溶液中搅拌混匀后，加入125 mm金属盐硝酸锌溶液继续搅拌3 h，得到复合材料前药@zif-8；
2）将步骤1）制备得到的前药@zif-8和酶添加到预凝胶溶液中配置酶/前药@mofs/预凝胶溶液，利用微流控技术促使酶/前药@mofs/预凝胶溶液的凝胶化，以制备酶/前药@mofs固定化水凝胶材料；3）将上述步骤2）中得到的复合材料用水洗涤3次后，即得到固定化前药和酶的水凝胶/金属有机框架复合材料。
22.其中，所述的酶是辣根过氧化物酶（hrp）。所述的前药是吲哚-3-乙酸（iaa）。所述的预凝胶包括丙烯酰胺、n,n-亚甲基双丙稀酰胺和2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。所述丙烯酰胺、n,n-亚甲基双丙稀酰胺和2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的质量比为15：1：1。所述的金属盐与配体的摩尔比为1:4。
23.本发明还提供上述的固定化酶前药的水凝胶/金属有机框架复合材料在抗菌领域中的应用。
24.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
25.在以下的实施例中，荧光素钠标记为fam，吲哚-3-乙酸标记为iaa，辣根过氧化物酶标记为hrp，三磷酸腺苷标记为atp，丙烯酰胺标记为aam，n,n-亚甲基双丙稀酰胺标记为bis，2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮标记为pi，金属有机框架标记为zif-8，金色葡萄球菌标记为s. aureus，固定化fam的zif-8标记为fam@zif-8，固定化hrp、iaa@zif-8的水凝胶复合材料标记为hizp。
26.实施例1按照以下步骤制备iaa@zif-8或fam@zif-8，并比较其在atp有/无情况下的扫描电镜图：（1）将1 ml的30 mg/ml iaa或fam溶液加入到2 ml的500 mm 2-甲基咪唑水溶液中，在磁搅拌下加入2 ml的125 mm硝酸锌水溶液；（2）将所得混合物在室温下搅拌3 h；（3）最后用ph = 7.4的pbs洗涤三次得到iaa@zif-8或fam@zif-8；（4）将得到的iaa@zif-8或fam@zif-8分别置于0，2 mm atp溶液中孵育30 min；（5）将孵育后的iaa@zif-8或fam@zif-8用超纯水洗涤，并置于扫描电镜中观察形貌变化。
27.实施例2按照以下步骤制备hizp：（1）称取3 mg/ml hrp、1.5 mg/ml iaa@zif-8、aam（15% wt）、bis（1% wt），pi（1% wt），配置成1 ml酶/预凝胶混合溶液；（2）根据微流控技术促酶/预凝胶溶液凝胶化，制备得到hizp。
28.实施例3结合rh6g-i-的ros活性实验，利用荧光分光光度计记录其最大发射峰对应的强度，以检测hizp在不同atp作用下的药物活性。具体方法步骤为：（1）以ph = 7.4的磷酸盐（pbs）作为缓冲溶液，总体积100μl，反应温度37℃，反应
时间为60 min；（2）用3支0.5ml离心管，分别编号为a、b、c；（3）离心管a中溶液的配制方法为：0 μl atp (40 mm)、10 μl ik(20 %)和10 μl hizp混合液于80 μl ph = 7.4的pbs缓冲溶液中；（4）离心管b中溶液的配制方法为：5 μl atp (40 mm)、10 μl ik(20 %)和10 μl hizp混合液于75 μl ph = 7.4的pbs缓冲溶液中；（5）离心管c中溶液的配制方法为：12.5 μl atp (40 mm)、10 μl ik(20 %)和10 μl hizp混合液于67.5 μl ph = 7.4的pbs缓冲溶液中；（6）将3支离心管置于反应温度37℃下暗反应60 min；（7）随后加入5 ul 200 mm的rh6g溶液，摇匀，利用荧光分光光度计分别测量溶液的相对荧光强度。
29.检测结果如图2所示，随着atp浓度在hizp分散体中的增加，导致rh6g-i-在550 nm处的荧光强度逐渐猝灭。表明水凝胶微球固定化的iaa@zif-8在atp的作用下发生了解体，导致iaa的释放和活化。这主要是由于水凝胶本身的通透性允许atp自由的进入，并且其内部的水环境在一定程度上决定了hrp高效活化iaa生成ros的能力。
30.实施例4游离iaa@zif-8 + hrp和hizp体系的生物催化活性比较，随后利用荧光分光光度计记录最大发射峰对应的强度。具体方法是：（1）以ph = 7.4的磷酸盐（pbs）作为缓冲溶液，总体积100μl，反应温度37℃，反应时间为60 min；（2）用2支0.5ml离心管，2支离心管中分别加入10 μl hizp和10 μl等浓度的iaa@zif-8 + hrp混合液；（3）在各试管中加入底物 12.5 μl abts (40 mm)在暗处反应后，加入5 ul 200 mm的rh6g溶液，摇匀，利用荧光分光光度计分别测量溶液的相对荧光强度；检测结果如图3所示与混合的 iaa@zif-8 + hrp体系相比，hizp体系的构建具有较高毒性分子转化活性。表明了iaa可以在atp诱导下从纳米载体中释放出来，并在后续过程中实现高效iaa前药的活化和ros的释放。
31.实施例5不同反应体系：iaa + hrp，iaa@zif-8 + hrp和hizp的抗菌性能比较，随后利用琼脂培养板培养，计数菌落数量。具体方法是：（1）以25 g/l的肉汤培养基作为溶液，总体积2.2 ml，反应温度37℃，反应时间为30 h；（2）用3支5 ml玻璃管，分别编号为a、b、c；（3）玻璃管a中溶液的配制方法为：50 μl hizp于2.15 ml含1
×
10
8 (cfu)/ml s. aureus的肉汤培养基溶液中；（4）玻璃管b中溶液的配制方法为：50 μl相同浓度iaa + hrp混合液于2.15 ml含1
×
10
8 (cfu)/ml s. aureus的肉汤培养基溶液中；（5）玻璃管c中溶液的配制方法为：50 μl 相同浓度iaa@zif-8 + hrp混合液于2.15 ml 含1
×
10
8 (cfu)/ml s. aureus的肉汤培养基溶液中；
（6）将3支玻璃管置于37℃的湿培养箱中作用30 h；（7）随后利用琼脂培养板培养，计数菌落数量。
32.检测结果如图4所示，含有hizp的平板在20 h后几乎达到了完全灭菌作用，而单独使用iaa或iaa@zif-8和hrp混合物处理的s. aureus仍可发现大量的细菌存活。因此，hizp具有更高的抗菌活性，因为在水凝胶基质中释放的iaa与hrp的邻近接触，可以提供更高的细胞毒剂浓度。且 iaa 与 hrp 混合物的抗菌活性略高于 iaa 封装时的情况，这表明了iaa在zif8中的受控状态。与对照组相比，含有hizp的平板在20 h后几乎完全阻止了菌落形成，而单独使用iaa或iaa@zif-8和hrp混合物处理的luria-bertani(lb)琼脂上仍可见大量的菌落。
33.综上所述，本发明提出了一种新的酶前药抗菌体系的构建方法，利用水凝胶对酶空间构象的保护作用，以及mofs对前药的装载和atp激活的释放作用，制备了hizp抗菌材料，实现高效、可控的抗菌作用。在该抗菌体系中前药在酶的催化作用，实现药物小分子在一锅中的高效催化转化，并且生产的高毒性药物能通过水凝胶壁实现有效的转运。
34.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。