一种虾原肌球蛋白诱导的小鼠白塞病研究实验方法与流程

1.本发明涉及小鼠白塞病研究实验技术领域，具体为一种虾原肌球蛋白诱导的小鼠白塞病研究实验方法。


背景技术：

2.白塞病，即贝赫切特综合征，是一种全身性免疫系统疾病，属于血管炎的一种，可累及全身多个器官，包括口腔、皮肤、关节肌肉、眼睛、血管、心脏、肺和神经系统等，主要表现为反复口腔溃疡和会阴溃疡，皮疹，下肢结节红斑，眼部虹膜炎，食管溃疡，小肠或结肠溃疡及关节肿痛等，研究表明hla-b*51基因与白塞病之间存在很强关联，但单独存在的hla-b*51基因并不能引起白塞病，白塞病最优可能是遗传与环境因素共同引起，包括病原体和污染物，研究表明单纯疱疹病毒ⅰ型hsv-1及链球菌属参与了白塞病发病，hla-b*51转基因小鼠是早期常用于白塞病研究的模型，但是该模型未出现与临床特征和病理特征相似的症状；热休克蛋白模型常出现眼部的葡萄膜炎，且不出现眼外症状，能被用于单个症状的研究，但对白塞病的整体研究来说不是一个特别优秀的模型；s抗原模型也是一种能够引起大鼠葡萄膜炎的模型，但是该模型在一周后眼部炎症将消失，和热休克蛋白模型一样只能用于单一病症的研究；原肌球蛋白免疫模型，是一种在临床治疗手段和药物筛选方面应用潜力巨大的白塞病模型，该模型将导致会阴溃疡、结肠炎症、眼部疾病以及关节炎，与临床患者部分症状类似，人血清模型，白塞病患者血清中含irbp、原肌球蛋白等能够引发相关症状的内容物，因此利用白塞病患者血清免疫动物产生白塞病相关症状是一种理想模型，该模型能够诱发与临床患者极为相似的临床和病理特征，制备该模型的困难程度并不体现在制备过程，而是获取白塞病患者血清。
3.现有技术中小鼠白塞病研究实验方法缺点不足：
4.1、现有技术中小鼠白塞病研究实验方法，使用的材料比较昂贵，一般原肌球蛋白模型使用的动物材料价格较高。
5.2、现有技术中小鼠白塞病研究实验方法，不具有模拟多种病症的作用。
6.3、现有技术中小鼠白塞病研究实验方法，抗原体积太大，会很大程度上导致动物的死亡。
7.本发明的目的在于提供一种虾原肌球蛋白诱导的小鼠白塞病研究实验方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，一种虾原肌球蛋白诱导的小鼠白塞病研究实验方法，包括(1)实验准备，所述(1)实验准备，在进行实验之前对实验所需要的动物、试剂与耗材进行准备；所述(2)虾原肌球蛋白的制备，将对虾进行处理，将对虾中的虾原肌球蛋白制备出来；所述(3)白塞病模型制备，将4周龄balb/c小鼠，适应性饲养1周后开展后续试验，模型组分别于试验的第1，8，14，21天进行免疫；所述(4)模型验证，造模完成后，对小鼠眼进行观察。
9.优选的，所述实验需要准备balb/c小鼠，雌雄不限，4w，试剂与耗材需要中国对虾，
丙酮，氯化钾，碳酸氢钠，硫酸铵，tris-hcl，dtt，完全弗氏佐剂(sigma)，pbs缓冲液(ph7.4)。
10.优选的，所述虾原肌球蛋白的制备是通过将中国对虾去头去尾和虾线后得到虾肉，置于缓冲液a(50mmol/l kcl、2mmol/l nahco3)溶液中充分匀浆，4摄氏度下离心获得沉淀，重复匀浆和离心4次；将离心的沉淀置于预冷的丙酮中充分搅拌后，发挥沉淀中的丙酮，得到粉末状沉淀物，置于缓冲液b(20mmol/l tris-hcl、1mol/l氯化钾、0.1mmol/l dtt)中抽提过夜，此后4℃离心取沉淀，上清液则调ph至4.5，并缓慢加入40％的硫酸铵溶液直至出现沉淀，4℃下12000rpm离心，取沉淀；缓冲液b分别溶解上述沉淀，沸水浴加热10min后冰上迅速冷却，4℃离心取上清，即为中国对虾原肌球蛋白，elisa法检测蛋白浓度，若浓度不满足12mg/ml以上则可通过冻干法制备中国对虾原肌球蛋白粉末制剂，使用时重新溶解。
11.优选的，所述白塞病模型制备需要取适量中国对虾原肌球蛋白粉末，溶解于pbs缓冲液中，制备为12mg/ml的中国对虾原肌球蛋白溶液，加入等体积完全弗氏佐剂，充分混匀制备为油包水乳剂，中国对虾原肌球蛋白乳剂浓度为6mg/ml，现配现用，第1天小鼠腹腔注射乳剂100μl/只，第8、14、21天则分别注射200μl/只。
12.优选的，所述模型验证是在造模完成后使用带状检影仪对小鼠眼部进行视力检验，成模小鼠将出现不同程度的近视，有条件的可以采用眼底镜对小鼠眼部进行观察，将出现葡萄膜炎和虹膜炎等类似症状，造模过程中小鼠出现会阴溃疡等外部症状，造模结束后7d，取小鼠结肠和膝关节进行he染色，将观察到小鼠结肠炎和膝关节软骨损伤和纤维增生情况，取血清进行elsia检测，发现il-4和ifn-γ水平显著上升。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
14.1、本发明中小鼠白塞病研究实验方法，与转基因小鼠和人血清模型相比材料简单易得，价格便宜，与一般原肌球蛋白模型相比使用了较为便宜的balb/c小鼠，具有价格优势。
15.2、本发明中小鼠白塞病研究实验方法，与热休克蛋白模型和s抗原模型相比具有模拟多种病症的优势。
16.3、本发明中小鼠白塞病研究实验方法，在原基础上调整了抗原免疫过程中的注射体积，降低了由于抗原体积太大引起的动物死亡。
附图说明
17.图1为本发明的方法流程图。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的
方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
20.在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
21.请参阅图1，一种虾原肌球蛋白诱导的小鼠白塞病研究实验方法，包括(1)实验准备，(1)实验准备，在进行实验之前对实验所需要的动物、试剂与耗材进行准备；(2)虾原肌球蛋白的制备，将对虾进行处理，将对虾中的虾原肌球蛋白制备出来；(3)白塞病模型制备，将4周龄balb/c小鼠，适应性饲养1周后开展后续试验，模型组分别于试验的第1，8，14，21天进行免疫；(4)模型验证，造模完成后，对小鼠眼进行观察，实验需要准备balb/c小鼠，雌雄不限，4w，试剂与耗材需要中国对虾，丙酮，氯化钾，碳酸氢钠，硫酸铵，tris-hcl，dtt，完全弗氏佐剂(sigma)，pbs缓冲液(ph7.4)，虾原肌球蛋白的制备是通过将中国对虾去头去尾和虾线后得到虾肉，置于缓冲液a(50mmol/l kcl、2mmol/l nahco3)溶液中充分匀浆，4摄氏度下离心获得沉淀，重复匀浆和离心4次；将离心的沉淀置于预冷的丙酮中充分搅拌后，发挥沉淀中的丙酮，得到粉末状沉淀物，置于缓冲液b(20mmol/ltris-hcl、1mol/l氯化钾、0.1mmol/l dtt)中抽提过夜，此后4℃离心取沉淀，上清液则调ph至4.5，并缓慢加入40％的硫酸铵溶液直至出现沉淀，4℃下12000rpm离心，取沉淀；缓冲液b分别溶解上述沉淀，沸水浴加热10min后冰上迅速冷却，4℃离心取上清，即为中国对虾原肌球蛋白，elisa法检测蛋白浓度，若浓度不满足12mg/ml以上则可通过冻干法制备中国对虾原肌球蛋白粉末制剂，使用时重新溶解，白塞病模型制备需要取适量中国对虾原肌球蛋白粉末，溶解于pbs缓冲液中，制备为12mg/ml的中国对虾原肌球蛋白溶液，加入等体积完全弗氏佐剂，充分混匀制备为油包水乳剂，中国对虾原肌球蛋白乳剂浓度为6mg/ml，现配现用，第1天小鼠腹腔注射乳剂100μl/只，第8、14、21天则分别注射200μl/只，模型验证是在造模完成后使用带状检影仪对小鼠眼部进行视力检验，成模小鼠将出现不同程度的近视，有条件的可以采用眼底镜对小鼠眼部进行观察，将出现葡萄膜炎和虹膜炎等类似症状，造模过程中小鼠出现会阴溃疡等外部症状，造模结束后7d，取小鼠结肠和膝关节进行he染色，将观察到小鼠结肠炎和膝关节软骨损伤和纤维增生情况，取血清进行elsia检测，发现il-4和ifn-γ水平显著上升。
22.实施例一：
23.(1)实验准备，在进行实验之前，对实验所需要的动物、试剂与耗材进行准备；
24.(2)虾原肌球蛋白的制备，将对虾进行处理，将对虾中的虾原肌球蛋白制备出来；
25.(3)白塞病模型制备，将4周龄balb/c小鼠，适应性饲养1周后开展后续试验，模型组分别于试验的第1，8，14，21天进行免疫；
26.(4)模型验证，造模完成后，对小鼠眼进行观察。
27.实施例二：
28.(1)实验准备，在进行实验之前，对实验所需要的动物、试剂与耗材进行准备；
29.(2)虾原肌球蛋白的制备，将对虾进行处理，将对虾中的虾原肌球蛋白制备出来；
30.(3)白塞病模型制备，将5周龄balb/c小鼠，适应性饲养3周后开展后续试验，模型
组分别于试验的第1，8，14，21天进行免疫；
31.(4)模型验证，造模完成后，对小鼠眼进行观察，由于抗原体积太大会导导致死亡。
32.实施例三：
33.(1)实验准备，在进行实验之前，对实验所需要的动物、试剂与耗材进行准备；
34.(2)虾原肌球蛋白的制备，将对虾进行处理，将对虾中的虾原肌球蛋白制备出来；
35.(3)白塞病模型制备，将3周龄较为昂贵的小鼠，适应性饲养2周后开展后续试验，模型组分别于试验的第1，7，15，20天进行免疫；
36.(4)模型验证，造模完成后，对小鼠眼进行观察。
37.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。