牡丹根皮细胞液，含其皮肤外用剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于发酵领域，尤其涉及一种牡丹根皮细胞液，含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.由于人们生活水平的提高，饮食不合理加之环境污染，炎症皮肤情况出现越来越多，目前市售的抗炎类产品多种多样，功效各异，其配方组分不仅会对肌肤造成负担，真正有抗炎效果的成分添加量也很少，因此，亟需开发一种抗炎效果较好且不会对皮肤造成负担的产品。
3.牡丹根皮富含丹皮酚等多种生物活性物质，有清热、凉血、镇痛等功效。近年来，随着对牡丹研究的不断深入，大量研究表明它还有抗炎、抗衰老等功效，具有良好的药理活性。现有技术对牡丹根皮中的活性成分采用水提、有机溶剂(甲醇、丙酮、乙酸乙酯等)提取等方式不仅提取成本高、而且造成了资源的浪费和环境污染，采用有机溶剂也会对操作人员的身体造成一定的伤害。
4.因此，本领域亟需研发一种制备工艺简单，制备过程中不采用任何有机试剂，具有较高的安全性，符合现代皮肤外用剂对功能性和安全性的需求，可被广泛应用于皮肤外用剂领域，其具有理想抗炎和抗衰老功效的牡丹根皮细胞液。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中采用水提或有机溶剂提取的方法从牡丹根皮中提取活性成分，不仅提取成本高，还会造成有效活性成分提取率低、资源浪费和污染环境等缺陷，而提供一种牡丹根皮细胞液，含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。本发明制得的牡丹根皮细胞液具有理想的抗炎功效和抗衰老功效，制备工艺简单，制备过程中不采用任何有机试剂，具有较高的安全性，实现节能环保，符合现代皮肤外用剂对功能性和安全性的需求，可被广泛应用于皮肤外用剂领域。
6.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
7.本发明提供一种牡丹根皮细胞液的制备方法，其包括如下步骤：新鲜牡丹根皮经一次蒸馏，制得馏出液a和残渣，将所述馏出液a和所述残渣混合，经加热浸提，二次蒸馏，收集馏出液b，即得所述牡丹根皮细胞液。
8.一些实施例中，所述新鲜牡丹根皮可为3～5年生的新鲜菏泽市丹凤牡丹根皮。
9.一些实施例中，所述新鲜牡丹根皮使用前还可进一步包括清洗和/或切割的操作。按照本领域常规，所述清洗的操作后还可进一步包括沥干水分的操作。
10.一些实施例中，所述一次蒸馏的方法可为本领域常规，一般可为减压蒸馏。
11.一些实施例中，所述一次蒸馏的温度可为60～95℃，较佳地为70～95℃。
12.一些实施例中，所述一次蒸馏的真空度可为-0.1～-0.06mpa，较佳地为-0.1m～-0.08pa，例如0.09mpa。
13.一些实施例中，所述一次蒸馏的时间可为1～4h，较佳地为2～4h，例如3h。
14.一些实施例中，所述一次蒸馏可按照本领域常规在旋转蒸发仪中进行。
15.当在所述旋转蒸发仪上进行所述一次蒸馏时，所述旋转蒸发仪的转速可为20～100r/min，较佳地为30～70r/min。
16.当在所述旋转蒸发仪上进行所述一次蒸馏时，蒸馏烧瓶浸入水浴锅的体积占所述蒸馏烧瓶总体积的1/3～1/2。
17.一些实施例中，所述加热浸提的温度可为65～95℃，较佳地为80℃。
18.一些实施例中，所述加热浸提的时间可为30～60min，较佳地为40～60min，例如50min。
19.一些实施例中，所述二次蒸馏的方法可为本领域常规，一般可为减压蒸馏。
20.一些实施例中，所述二次蒸馏的温度可为60～95℃，较佳地为70～95℃，例如90℃。
21.一些实施例中，所述二次蒸馏的真空度可为-0.1～-0.06mpa，较佳地为-0.1～-0.08mpa，例如-0.09mpa。
22.一些实施例中，所述二次蒸馏的时间可为2～4h，较佳地为3～4h。
23.一些实施例中，所述二次蒸馏可按照本领域常规在旋转蒸发仪中进行。
24.当在所述旋转蒸发仪上进行所述二次蒸馏时，所述旋转蒸发仪的转速可为20～100r/min，较佳地为30～70r/min。
25.当在所述旋转蒸发仪上进行所述二次蒸馏时，蒸馏烧瓶浸入水浴锅的体积占所述蒸馏烧瓶总体积的1/3～1/2。
26.一些实施例中，所述二次蒸馏后还可进一步包括对所述馏出液b进行灭菌和/或与防腐剂混合的操作。
27.其中，所述灭菌的方法可为本领域常规使用的高温灭菌法。
28.当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为90～120℃，更佳地为90～110℃，例如100℃。
29.当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20～40min，更佳地为25～35min，例如30min。
30.其中，与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度可为50～80℃，较佳地为70～80℃，例如75℃。
31.其中，所述防腐剂可为本领域常规使用的防腐剂，较佳地包括对羟基苯乙酮和/或1,2-己二醇。
32.当所述防腐剂包括对羟基苯乙酮和1,2-己二醇时，所述对羟基苯乙酮占所述馏出液b的质量百分数为0.1％～1％，所述1,2-己二醇占所述馏出液b的质量百分数为0.1％～1％。
33.较佳地，当所述防腐剂包括对羟基苯乙酮和1,2-己二醇时，所述对羟基苯乙酮占所述馏出液b的质量百分数为0.5％，所述1,2-己二醇占所述馏出液b的质量百分数为0.5％。
34.本发明还提供一种牡丹根皮细胞液，其由如上所述的牡丹根皮细胞液的制备方法制得。
35.本发明还提供一种如上所述的牡丹根皮细胞液直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。
36.一些实施例中，所述牡丹根皮细胞液可作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分和/或抗炎活性成分。
37.其中，所述抗氧化活性成分可为具有dpph自由基清除作用的抗氧化活性成分。
38.其中，所述抗炎活性成分可为具有抑制透明质酸酶活性的抗炎活性成分。
39.本发明还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的牡丹根皮细胞液。
40.一些实施例中，所述皮肤外用剂中还可进一步包括本领域常规使用的活性成分，一般可包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中至少一种。
41.一些实施例中，所述皮肤外用剂可按照本领域常规包括面膜、精华或爽肤水。
42.一些实施例中，所述牡丹根皮细胞液占所述皮肤外用剂的质量百分比可为5％～99％，较佳地为60％～99％。
43.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
44.本发明所用试剂和原料均市售可得。
45.本发明的积极进步效果在于：本发明制得的牡丹根皮细胞液具有理想的抗氧化功效和抗炎功效，制备工艺简单，不采用任何有机试剂，节能环保，具有较高的安全性，符合现代皮肤外用剂对功能性和安全性的需求。
附图说明
46.本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：
47.图1为实施例1～2和对比例1～3制得的产品的dpph自由基清除能力对比图；
48.图2为实施例1～2和对比例1～3制得的产品处理人皮肤成纤维细胞后，细胞存活率对比图；
49.图3为实施例1～2和对比例1～3制得的产品中总酚含量对比图；
50.图4为实施例1～2和对比例1～3制得的产品对透明质酸酶抑制能力对比图。
具体实施方式
51.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
52.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
53.实施例1
54.选用人工种植的3～5年的新鲜菏泽市丹凤牡丹根皮，称取洗净沥干水分的新鲜菏泽市丹凤牡丹根皮进行切块处理，切成0.5cm
×
(0.5～1)cm的块状备用；将处理好的牡丹根皮置于旋转蒸发仪的蒸馏烧瓶中进行一次蒸馏，方法为减压蒸馏，打开旋转蒸发仪的加热
系统进行加热，打开水循环系统进行冷凝馏出液，蒸馏烧瓶1/2的体积浸入水浴锅中，旋转蒸发仪的转速为70r/min，减压蒸馏的温度为90℃，真空度为-0.09mpa，减压蒸馏的时间为3h；蒸馏结束后得到的馏出液a与蒸馏烧瓶中的残渣混合，进行加热浸提，加热浸提的温度为80℃，加热浸提的时间为50min，加热浸提结束后，制得的混合物料在蒸馏烧瓶中进行二次蒸馏，二次蒸馏的方法为减压蒸馏，打开旋转蒸发仪的加热系统进行加热，打开水循环系统进行冷凝馏出液，旋转蒸发仪的转速为70r/min，蒸馏烧瓶1/2的体积浸入水浴锅中，减压蒸馏的温度为90℃，真空度为-0.09mpa，减压蒸馏的时间为3h；二次蒸馏结束，制得馏出液b，将馏出液b在温度为100℃灭菌锅中灭菌30min，灭菌结束后于75℃条件下与己二醇和对羟基苯乙酮混合，制得牡丹根皮细胞液；其中，己二醇和对羟基苯乙酮占馏出液b的质量百分比均为0.5％。
55.实施例2
56.与实施例1相比，区别仅在于一次蒸馏和二次蒸馏时的温度为70℃，其他条件参数同实施例1。
57.对比例1
58.与实施例1相比，区别仅在于不进行加热浸提，一次蒸馏操作后将馏出液a与蒸馏烧瓶中牡丹根皮残渣混合继续进行二次蒸馏操作，其他条件参数同实施例1。
59.对比例2
60.与实施例1相比，区别仅在于不进行二次蒸馏操作，加热浸提后进行离心，收集上清液，再经灭菌与防腐剂混合，即可，其他条件参数同实施例1。
61.对比例3
62.与实施例1相比，区别仅在于在一次减压蒸馏前，先将牡丹根皮与去离子水混合，牡丹根皮与去离子水的质量比为1：2，其他条件参数同实施例1。
63.效果实施例1 dpph自由基清除实验
64.dpph是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，dpph的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对dpph自由基的清除效果。
65.dpph自由基清除实验的具体实验步骤为：
66.(1)取等体积(1ml)的待测液与2
×
10-4
mol/l的dpph溶液混匀(a1管)；
67.(2)取等体积(1ml)的无水乙醇(待测物溶剂)与2
×
10-4
mol/l的dpph溶液混匀(a2管)；
68.(3)取等体积(1ml)的无水乙醇与待测液混匀(a3管)；
69.(4)避光反应30min后，在517nm下测a1管、a2管、a3管吸光度值；清除率计算公式为：清除率＝[(a2+a3)-a1]/a2×
100％。
[0070]
本实验待测液为实施例1～2或对比例1～3制得的产品，dpph自由基清除实验测试结果见表1和图1(图1中，***p＜0.001，表示与实施例1相比有极其显著性统计学差异，极显著降低；**p＜0.01，表示与实施例1相比有显著性统计学差异，显著降低)。
[0071]
表1
[0072] dpph自由基清除率(％)
实施例178.8
±
1.19实施例271.83
±
1.57对比例138.86
±
1.36对比例251.46
±
1.15对比例342.78
±
1.23
[0073]
结合表1和显著性计算分析可知，实施例1～2制得产品的dpph自由基清除能力极显著高于对比例1～3制得产品的dpph自由基清除能力。
[0074]
效果实施例2人体皮肤成纤维细胞毒性实验
[0075]
本实验采用人体皮肤成纤维细胞，来自中国科学细胞库，验证上述实施例和对比例制得产品的细胞毒性。
[0076]
试剂：0.25％(含edta)胰蛋白酶的生产厂家为美国gibco公司；dmem培养基的生产厂家为美国gibco公司；双抗的生产厂家为美国corning公司；cck-8的生产厂家为北京拜尔迪生物技术有限公司；胎牛血清的生产厂家为美国gibco公司；磷酸盐缓冲液的生产厂家为北京百瑞极生物科技有限公司。
[0077]
设备：wj-80a
‑ⅱ
型co2恒温培养箱的厂家为上海圣科仪器设备有限公司；sunrise酶标仪的厂家为帝肯贸易有限公司；tl80-2型医用离心机的厂家为江苏天力医疗器械有限公司；nunc 96孔细胞培养板的厂家为赛默飞世尔科技公司。
[0078]
1、实验步骤：
[0079]
分别将上述实施例1～2和对比例1～3制得的产品用无血清的dmem培养基配置成体积百分数为10％、5％、2.5％的实验组待测液。人体皮肤成纤维细胞养于含10％胎牛血清以及1％双抗(1
×
105u/l的青霉素、100mg/l的链霉素)的dmem培养基中。细胞生长于37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中，当细胞融合达到85％以上时，以0.05％胰酶消化对数生长期细胞，用含血清的dmem终止消化反应。细胞计数板计数，将细胞悬液浓度调整到7
×
104个/ml，将细胞悬液按照每孔100μl的比例接种到96孔板上，37℃、5％co2条件下孵育12h。去除旧培养液，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两遍。实验组中每孔加入100μl上述配置的已过滤除菌的不同浓度的实验组待测液，每个待测液做6个复孔；对照组含有细胞，加入无血清的dmem培养基；空白对照组无细胞，加入100μl的pbs。再于37℃、5％co2条件下孵育24h。然后每孔加入10μl的cck-8溶液，再孵育3h，在450nm波长下测定吸光度值，计算各组细胞存活率，结果见表2和图2。
[0080]
细胞存活率的计算公式如下：
[0081]
细胞存活率(％)＝(a实验组-a空白对照组)/(a对照组-a空白对照组)
×
100％。
[0082]
表2
[0083][0084][0085]
结果表明，本发明实施1～2制得产品的细胞毒性低于对比例1～3制得产品的细胞毒性。
[0086]
效果实施例3总酚含量测定
[0087]
在碱性溶液中，多酚类化合物可以将钨钼酸还原(w
6+
变成w
3+
)生成蓝色化合物，在760nm处有最大吸收，颜色的深浅与多酚含量呈正相关。一般用没食子酸(或焦性没食子酸)作为参照标准，提取物中总多酚的含量以等同于没食子酸的量来表示。
[0088]
实验药品：
[0089]
1.焦性没食子酸标准品；
[0090]
2.福林-酚试液；
[0091]
3.26.7％na2co3溶液：称取26.7g na2co3固体粉末，加入蒸馏水至100g，搅拌溶解。
[0092]
实验仪器：精密天平、分光光度计
[0093]
实验操作：
[0094]
1.标准曲线的绘制
[0095]
准确称取真空干燥至恒重的焦性没食子酸标准品44.3mg，用蒸馏水溶解定容至100ml，分别取2.0、4.0、8.0、12.0、16.0和20.0ml于100ml容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度。再分别取上述不同浓度溶液1ml加到10ml比色管中，然后依次加入1ml蒸馏水，0.5ml 2倍稀释的福林-酚试液，1.5ml 26.7％na2co3溶液，用水定容至10ml，室温下反应2h，于760nm下测定吸光值。以吸光值对标准品含量作图，得到典型的标准曲线。
[0096]
2.样品测定
[0097]
取1ml待测样品(实施例1～2或对比例1～3制得产品)加到10ml比色管中，然后依次加入1ml蒸馏水，0.5ml 2倍稀释的福林-酚试液，1.5ml 26.7％na2co3溶液，用水定容至10ml，室温下反应2h，于760nm下测定吸光值。所得吸光值对照标准曲线，计算样品所含多酚含量，结果见表3和图3(图3中，***p＜0.001，表示与实施例1相比有极其显著性统计学差异，极显著降低；**p＜0.01，表示与实施例1相比有显著性统计学差异，显著降低)。
[0098]
表3
[0099]
编号总酚含量(μg/ml)实施例156.84
±
1.62实施例250.13
±
1.35对比例136.81
±
1.17
对比例241.83
±
1.33对比例329.44
±
0.93
[0100]
结合表3和显著性计算分析可知，实施例1～2制得产品中总酚含量极显著高于对比例1～3制得产品中总酚含量。
[0101]
效果实施例4透明质酸酶抑制实验
[0102]
透明质酸酶是一种能分解多糖的溶酶体之一，能够水解透明质酸钾生成β-n-乙酰葡糖胺，该物质在碱性条件下与乙酰丙酮缩合生成生色原2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物，生色原与埃尔利希试剂在浓盐酸乙醇中显色。透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，是i型过敏反应的参与者，因此透明质酸酶体外抑制实验可作为快捷的抗过敏测定方法。
[0103]
试剂：透明质酸酶、透明质酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、无水碳酸钠、浓盐酸、对-二甲氨基苯甲醛、乙酰丙酮、冰醋酸、无水氯化钙。
[0104]
设备：sunrise酶标仪的厂家为帝肯贸易有限公司；上海博讯实业有限公司医疗设备厂的数显恒温水浴锅；
[0105]
取0.1ml cacl2溶液(0.25mmol/l)和0.5ml透明质酸酶液(100u/ml)于37℃下水浴恒温培养20min；加入受试样品液0.5ml(实施例1～2或对比例1～3制得的产品)，继续保温20min；再加入0.5ml透明质酸钠溶液(0.5mg/ml)，37℃水浴恒温培养30min后取出，在常温下放置5min；加入0.1ml naoh溶液(0.4mol/l)和0.5ml乙酰丙酮溶液(3.5ml乙酰丙酮溶于50ml的1.0mol/l碳酸钠溶液中)，于沸水浴中加热15min后立即转移至冰水水浴冷却5min；滴加1.0ml埃尔利希试剂(0.8g对-二甲基氨基苯甲醛溶于15ml浓盐酸和15ml无水乙醇中)，并用3.0ml无水乙醇稀释，室温放置20min显色，用分光光度计测定波长为540nm处吸光度值。样品对透明质酸酶抑制率的测定计算公式如下，测试结果见表4和图4(图4中，**p＜0.01，表示与实施例1相比有显著性统计学差异，***p＜0.001，表示与实施例1相比有极其显著性统计学差异，极显著降低)；
[0106]
透明质酸酶抑制率＝[(a-b)-(c-d)]/(a-b)
×
100％；
[0107]
式中：a—对照溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替受试样品溶液)；b—对照空白溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替受试样品溶液及酶液)；c—受试样品液吸光度值；d—受试样品空白溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)；
[0108]
表4
[0109]
编号透明质酸酶抑制率(％)实施例183.63
±
1.3实施例277.06
±
1.09对比例160.8
±
1.26对比例255.32
±
1.5对比例346.87
±
1.56
[0110]
结合表4和显著性计算分析可知，实施例1～2制得产品对透明质酸酶抑制能力极显著高于对比例1～3制得产品对透明质酸酶抑制能力。
[0111]
效果实施例5安全性检测
[0112]
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。根据《化妆品卫生规范》(2015)对实施例1～2和对比例1～3制得的产品进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其
皮肤刺激性进行评估。
[0113]
1、试验对象：
[0114]
严格按照《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》要求，选择受试对象，皮肤的待测部位出现瘢痕、鲜红斑痣等影响结果判定的受试者、体质高度敏感者均不能参与试验。本试验选择选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
[0115]
2、实验方法
[0116]
分别将0.2ml上述实施例1～2和对比例1～3制得的产品滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。设置空白对照，即在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应，接着于24h和48h后观察皮肤的反应。体斑贴试验皮肤不良反应分级标准参见表5。
[0117]
表5皮肤不良反应分级标准
[0118][0119]
3、试验结果
[0120]
结果参见表6，从表中可以看出；本发明实施例1～2制得的牡丹根皮细胞液试敏结果都是阴性反应，说明本发明制得的牡丹根皮细胞液具有良好的安全性和耐受性，不会给人体带来不良反应。而使用对比例1～3制得的牡丹根皮细胞液后，部分受试者出现不良反应。
[0121]
表6
[0122][0123][0124]
最后，还需要说明的是，在本发明中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0125]
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。