一种聚乙二醇基粘合剂及其制备方法以及应用

1.本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种聚乙二醇基粘合剂及其制备方法以及应用。


背景技术：

2.硬膜，作为脑或脊髓表面被膜的最外层，是一层结缔组织纤维膜。硬膜的组织结构是由高度定向的胶原组织构成，基质细胞是纤维细胞。硬膜，作为一层保护性结构，其破损的常见原因有：外伤(骨折块刺穿导致硬膜缺损，80％)、医源性(硬膜内肿瘤的切除、神经外科手术并发症，16％)等。硬膜的机械强度是这三层中最大的，当硬膜破损时常常伴有脑脊液渗漏。脑脊液产生的后果包括直接后果和间接后果。直接后果包括体位性头痛、假性硬膜囊肿形成、硬膜瘘、脑疝/脊髓疝、切口愈合困难、切口感染、脑膜炎和颅内出血、硬膜外纤维化加剧等。间接后果包括住院时间延长、医疗花费增加、长期卧床导致的相关并发症(坠积性肺炎、褥疮、下肢深静脉血栓、尿路感染)。因此，积极治疗硬膜破损，防治脑脊液漏是十分必要的。
3.目前针对硬膜缺损，临床上的治疗措施主要以缺损区域缝合为主。但该治疗方法存在以下4个缺陷：
①
部分缺损区域位置较偏(如神经根袖或腋窝处the nerve root sleeve or axilla)，无法缝合或对缝合技术要求高；
②
缝合缺损硬膜理论上可能导致相关神经或脊髓继发性狭窄；
③
无论选用何种缝合针都无法避免针孔导致的脑脊液漏；
④
硬膜的缝合还可能将硬膜缺损区的低压转为高压造成持续性脑脊液漏。因此，针对硬膜缺损导致的脑脊液漏，硬膜的水密性闭合(watertight closure)是根本的治疗方案。为了达到水密性闭合，临床上采用的方案分为修复和不修复两种：修复的策略为缝合线缝合与组织凝胶联合使用，不修复的方案为单纯使用组织凝胶密封硬膜。针对是否修复，临床上的决策存在一定的争议。曾经认为缝合是硬膜缺损治疗的金标准，但近年来文献调查认为不修复硬膜的远期临床疗效甚至优于缝合组。通过详细对比相关文献，认为缺损在5mm范围内时建议不修复，超过5mm时，可以考虑修复。因为缺损较大时，发生脊髓神经疝的可能性大。目前研究的粘合剂种类主要包括生物聚合物(蛋白类、多糖类、聚合物仿生等)和合成聚合物(聚乙二醇、聚氰基丙烯酸酯、聚氨酯等)两大类。它们有各自的优缺点：比如生物聚合物的生物相容性良好、可降解，但可能存在免疫原性、传播疾病风险；合成聚合物类的机械性能较好、非免疫原性，但可能不可降解或降解产物有毒等。组织凝胶的选择，目前国内用于临床的产品主要以纤维蛋白胶为主，国外的产品还包括duroseal、coseal、adherus、cyanoacrylic acid octyl ester等。目前这几类产品不管是临床实验效果观察还是实验室研究，结果都证实他们的密封效果均不能令人满意，原因主要包括粘合剂强度机械性能低、材料的溶胀率较高、材料硬度过大等。因而制备一种具备良好的机械性能兼具低溶胀率的软性硬膜密封剂是目前的研究热点。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种聚乙二醇基粘合剂及其制备方法以及应用，本发明提供的聚乙二醇基粘合剂成交速度快，成胶机械性能好，黏附性能佳、溶胀率低，可用于封堵硬膜破损，避免脑脊液漏。
5.本发明提供了一种聚乙二醇基粘合剂，由邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇和明胶制备而成。
6.优选的，所述邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇具有式(i)、式(ii)和式(iii)结构中的任一种；
7.[0008][0009]
其中，c为聚合度，1≤c≤250；
[0010]
d为聚合度，1≤d≤166；
[0011]
e为聚合度，1≤e≤125；
[0012]
r为
[0013]
优选的，所述明胶的分子量为5万～10万。
[0014]
优选的，所述邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇和明胶的质量比为1:1。
[0015]
本发明还提供了一种上述粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
[0016]
将明胶溶液和邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇溶液混合成胶，得到聚乙二醇基粘合剂。
[0017]
优选的，所述混合的温度为室温混合，所述成胶的时间2～3min；
[0018]
或者，所述混合的温度为37℃，所述成胶时间为52.4
±
5.59s。
[0019]
优选的，所述明胶溶液中，明胶的质量体积浓度为50～250mg/ml；
[0020]
所述邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇溶液中，邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇的质量体积浓度为50～250mg/ml。
[0021]
本发明还提供了一种上述粘合剂在制备硬膜粘合和硬膜外纤维化防治产品中的应用。
[0022]
与现有技术相比，本发明提供了一种聚乙二醇基粘合剂，由邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇和明胶制备而成。本发明利用邻苯二醛封端的聚乙二醇(4armpeg-opa)与明胶、透明质酸水溶液交联成胶，用于破损硬膜(硬脑膜和硬脊膜)的快速封堵与修复，防治脑脊液漏的同时预防硬膜外纤维化。本发明所使用的主要原料聚乙二醇、明胶已被fda批准在临床使用。该粘合剂具有良好的生物相容性，可生物降解性和良好的机械性能，同时具有低溶胀率，不引起组织神经受压。
[0023]
结果表明，本发明所使用的4armpeg-opa与天然高分子(明胶、透明质酸)在室温下2～3min成胶，37℃条件下52.4
±
5.59秒成胶，满足临床手术操作时间。因而，快速成胶能够迅速封堵破损硬膜，避免成胶时间过长导致封堵失效。同时，4armpeg-opa与天然蛋白成胶后的强度随时间逐渐增加，并且在成胶30min后可达到200cmh2o以上。动物活体实验证实该粘合剂具有良好硬膜封堵和修复效果。
附图说明
[0024]
图1：实施例1中的4armpeg-opa化学结构式；
[0025]
图2：实施例1中的4armpeg-opa/gelatin水凝胶外观和成胶时间；
[0026]
图3：实施例1中的4armpeg-opa/gelatin水凝胶流变性能；
[0027]
图4：实施例1中的4armpeg-opa/gelatin水凝胶体外和在体爆破压；a:体外爆破压测试图；b:4armpeg-opa/gelatin水凝胶和纤维蛋白胶不同成胶时间的体外爆破压值；c：4armpeg-opa/gelatin水凝胶和纤维蛋白胶5min的在体爆破压值；
[0028]
图5：实施例1中4armpeg-opa/gelatin对兔子硬脑膜修复情况外像；
[0029]
图6：实施例1中4armpeg-opa/gelatin在动物手术后1周和2周进行核磁检测，观察4armpeg-opa/gelatin与纤维蛋白胶组、空白组硬膜封堵效果；
[0030]
图7：实施例1中4armpeg-opa/gelatin的细胞毒性；
[0031]
图8：实施例4中4armpeg-opa/gelatin的体外降解和溶胀；
[0032]
图9：实施例5中4armpeg-opa/gelatin的压缩性能。
具体实施方式
[0033]
本发明提供了一种聚乙二醇基粘合剂，由邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇和明胶制备而成。
[0034]
本发明提供的粘合剂具有快速成胶、机械性能好、生物相容性好、医用可降解等优势，可应用于封堵硬膜缺损，防治脑脊液漏的同时防治硬膜外纤维化。
[0035]
所述邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇具有式(i)、式(ii)和式(iii)结构中的任一种；
[0036][0037][0038]
其中，c为聚合度，1≤c≤250；
[0039]
d为聚合度，1≤d≤166；
[0040]
e为聚合度，1≤e≤125；
[0041]
r为
[0042]
其中，本发明对所述邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇的制备方法并没有特殊限制，本领域技术人员公知的方法即可。
[0043]
聚乙二醇(peg)具有良好的亲水性和生物相容性，已经被fda批准用于临床。同时，聚乙二醇端基可以通过改性制备不同需求活性的官能团。因此，聚乙二醇常常被用于水凝胶的组分之一。
[0044]
在本发明中，所述邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇的制备方法包括以下步骤：
[0045]
a)将1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸琥珀酰亚胺酯和端基是氨基的聚乙二醇反应，得到反应产物；
[0046]
b)将所述反应产物脱保护，得到聚乙二醇衍生物。
[0047]
本发明将1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸琥珀酰亚胺酯和端基是氨基的聚乙二醇溶于有机溶剂，在缚酸剂的存在下反应，沉降，得到反应产物。
[0048]
所述1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸琥珀酰亚胺酯的摩尔当量为端基是氨基的聚乙二醇中氨基的1.2～5倍，优选为2倍；所述有机溶剂优选为无水的二氯甲烷；所述缚酸剂优选为无水吡啶。
[0049]
所述反应的时间为24～72h，优选为48h；所述反应的温度为10～40℃，优选为25℃。
[0050]
本发明优选采用无水乙醚进行沉降；将沉降固体过滤，真空干燥，得到反应产物。
[0051]
得到反应产物后，本发明将所述反应产物进行脱保护，透析和冷冻干燥，得到聚乙二醇衍生物。
[0052]
所述脱保护采用本领域技术人员熟知的技术方案即可。本发明优选采用三氟乙酸和水的混合溶剂；所述混合溶剂的体积为反应产物质量的5～20倍，优选为5倍；所述脱保护的时间为0.5～3h，优选为1h；所述脱保护的温度为10～40℃，优选为25℃。
[0053]
所述透析和冷冻干燥采用本领域技术人员熟知的技术方案即可。
[0054]
在本发明中，所述1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸琥珀酰亚胺酯按照以下方法制备：
[0055]
1)将3，4-二甲基苯甲酸通过溴代反应，制备3，4-二(二溴甲基)苯甲酸；
[0056]
2)将3，4-二(二溴甲基)苯甲酸进行水解得到3，4-二甲酰基苯甲酸；
[0057]
3)将3，4-二甲酰基苯甲酸与甲醇反应得到1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸；
[0058]
4)将1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸与n-羟基丁二酰亚胺和缩合试剂反应，得到1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸琥珀酰亚胺酯。
[0059]
其中，反应过程如下：
[0060][0061]
具体的，本发明将3，4-二甲基苯甲酸通过溴化反应，制备3，4-二(二溴甲基)苯甲酸。
[0062]
所述溴化反应采用本领域技术人员熟知的技术方案即可。本发明采用n-溴代丁二酰亚胺为溴化试剂，过氧化苯甲酰、偶氮二异丁腈中的任意一种为自由基引发剂，四氯化碳为溶剂进行溴化反应。
[0063]
所述n-溴代丁二酰亚胺的摩尔当量为3，4-二甲基苯甲酸的3～5倍，优选为4倍；所述过氧化苯甲酰的摩尔当量为3，4-二甲基苯甲酸的0.05～0.5倍，优选为0.1倍；所述四氯化碳的体积(ml)为3，4-二甲基苯甲酸质量(g)的10～50倍，优选为20倍。
[0064]
所述溴化反应的温度为70～90℃，优选为81℃；所述溴化反应的时间为10～20h，优选为15h。
[0065]
溴化反应结束后，将反应混合物过滤；滤饼选用苯、乙醚洗涤；将全部滤液合并浓缩后，真空抽干；将固体产物在乙腈中重结晶，得到3，4-二(二溴甲基)苯甲酸。
[0066]
本发明优选采用旋转蒸发仪进行浓缩；优选浓缩温度为30℃；优选浓缩至10％的液体体积。
[0067]
所述重结晶采用本领域技术人员熟知的技术方案即可。
[0068]
本发明将3，4-二(二溴甲基)苯甲酸进行水解反应得到3，4-二甲酰基苯甲酸。
[0069]
所述水解反应采用本领域技术人员熟知的技术方案即可。本发明优选将3，4-二(二溴甲基)苯甲酸溶于碳酸钠的水溶液进行水解反应。
[0070]
所述碳酸钠水溶液的质量-体积浓度为10％；所述碳酸钠水溶液的体积为3，4-二(二溴甲基)苯甲酸质量的5-20倍，优选为10倍。
[0071]
所述水解反应的温度为60～80℃，优选为70℃；所述水解反应的时间为3-5h，优选为4h。
[0072]
水解反应结束后，选用浓盐酸将反应液的ph调至0～3，优选为1；选用乙酸乙酯进行萃取；浓缩、真空抽干后得到3，4-二甲酰基苯甲酸。
[0073]
本发明将3，4-二甲酰基苯甲酸与甲醇、催化剂反应得到1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸。
[0074]
所述催化剂优选为三氟甲烷磺酸钪；所述反应的温度为10～40℃，优选为25℃；所述反应的时间为6～24h，优选为12h。
[0075]
本发明将1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸与n-羟基丁二酰亚胺、缩合试剂在有机溶剂中反应，得到1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸琥珀酰亚胺酯。
[0076]
所述缩合试剂为二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸
盐、二异丙基碳二亚胺中的任意一种，优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；所述有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈中的任意一种，优选为乙腈。
[0077]
所述反应的温度为10～40℃，优选为25℃；所述反应的时间为6～24h，优选为12h。
[0078]
反应结束后，粗产物通过硅胶柱层析进行提纯，得到1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸琥珀酰亚胺酯。所述柱层析的流动相优选为正己烷和乙酸乙酯，体积比为1：5～1：1，优选为1：3。
[0079]
在本发明中，所述聚乙二醇基粘合剂的制备原料还包括明胶。
[0080]
在本发明中，所述明胶来源于猪皮肤，分子量为5万～10万。
[0081]
作为胶原蛋白部分降解的产物，明胶用来制备粘合剂具有明显优势。一方面，明胶具有良好的生物学特性，如低免疫原性、可降解、无毒、低成本。另一方面，明胶提供一系列官能团，如赖氨酸的ε-氨基、天冬氨酸和羧酸的羧基、组氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基以及末端α-羧基和α-氨基，为其与其他材料交联或对其进行改性进而改变明胶的机械性能提供了条件。相较于其他生物聚合物(甲羟乙基纤维素、淀粉)，明胶具备更优的机械性能。同时其他明胶(如鱼)相比，哺乳动物明胶(如牛、猪)表现出更好的机械性能。但明胶本身在水环境下并不稳定，需要化学交联才能形成稳定的网络。
[0082]
所述邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇和明胶的质量比为1:1。
[0083]
本发明还提供了一种上述粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
[0084]
将明胶溶液和邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇溶液混合成胶，得到聚乙二醇基粘合剂。
[0085]
所述混合的温度为室温混合，所述成胶的时间196.4
±
11.82秒；
[0086]
或者，所述混合的温度为37℃，所述成胶时间为52.4
±
5.59秒。
[0087]
所述明胶溶液中，明胶的质量体积浓度为50～250mg/ml，优选为50、100、150、200、250，或50～250mg/ml之间的任意值；
[0088]
所述邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇溶液中，邻苯二醛封端的多臂聚乙二醇的质量体积浓度为50～250mg/ml，优选为50、100、150、200、250，或50～250mg/ml之间的任意值。
[0089]
本发明还提供了一种上述粘合剂在制备硬膜粘合和硬膜外纤维化防治产品中的应用。
[0090]
本发明利用邻苯二醛封端的聚乙二醇(4armpeg-opa)与明胶、透明质酸水溶液交联成胶，用于破损硬膜(硬脑膜和硬脊膜)的快速封堵与修复，防治脑脊液漏的同时预防硬膜外纤维化。本发明所使用的主要原料聚乙二醇、明胶已被fda批准在临床使用。该粘合剂具有良好的生物相容性，可生物降解性和良好的机械性能，同时具有低溶胀率，不引起组织神经受压。
[0091]
结果表明，本发明所使用的4armpeg-opa与天然高分子(明胶、透明质酸)在室温下196.4
±
11.82秒成胶，37℃条件下52.4
±
5.59秒成胶，满足临床手术操作时间。因而，快速成胶能够迅速封堵破损硬膜，避免成胶时间过长导致封堵失效。同时，4armpeg-opa与天然蛋白成胶后的强度随时间逐渐增加，并且在成胶30min后可达到200cmh2o以上。动物活体实验证实该粘合剂具有良好硬膜封堵和修复效果。
[0092]
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的聚乙二醇基粘合剂及其制备方法以及应用进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
[0093]
邻苯二醛封端的四臂聚乙二醇的合成
[0094]
将3，4二甲基苯甲酸(15g，0.10mol)和n-溴代丁二酰亚胺(89g，0.50mol)置于500ml圆底烧瓶中，加入300ml四氯化碳和过氧化苯甲酰(2.4g，10mol)，加热至81℃回流反应15h。将反应混合物经砂芯漏斗过滤，固体再用苯和乙醚分别洗涤3次。将滤液合并，旋蒸。将得到的固体(30g)溶解在300ml碳酸钠溶液(10％(w/v))中，用二氯甲烷洗涤三次。水溶液用浓盐酸酸化到ph 1，析出大量固体，用乙酸乙酯萃取三次。有机相用饱和食盐水洗涤三次，用无水硫酸钠干燥。过滤，旋蒸除去溶剂，得到的浅黄色固体在乙腈中重结晶。
[0095]
将上步反应得到的3，4-二(二溴甲基)苯甲酸(18g)置于250ml圆底烧瓶中，加入180ml碳酸钠溶液(10％(w/v))，加热至70℃反应4h。将反应混合物经砂芯漏斗过滤，滤液用浓盐酸酸化到ph1，用乙酸乙酯萃取三次。有机相用饱和食盐水洗涤三次，用无水硫酸钠干燥。过滤，旋蒸，得到黄色固体(5.0g)。随后，加入100ml干燥的甲醇和三氟甲烷磺酸钪(0.75g)，25℃反应12h。反应结束后，旋蒸，得到固体产物。加入100ml干燥的乙腈，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(5.0g)、n-羟基丁二酰亚胺(8.0g)，25℃反应12h。反应结束后，旋蒸，剩余物溶解在二氯甲烷中，用饱和食盐水洗涤三次，用无水硫酸钠干燥。粗产物用硅胶柱层析进行提纯，洗脱剂为正己烷/乙酸乙酯(3/1，v/v)，得到1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸丁二酰亚胺酯。
[0096]
将上步反应得到的产物(0.51g，1.6mmol)和胺基封端的四臂聚乙二醇(2.0g，0.20mmol)溶于25ml干燥的二氯甲烷中，加入0.5ml无水吡啶，25℃反应48h。反应结束后，将溶液倒入冰乙醚中沉降，得到白色粉末。
[0097]
将上步反应得到的产物溶于10ml去离子水和三氟乙酸的混合溶剂(1/1，v/v)中，室温反应1h。反应结束后，再加入50ml去离子水稀释，透析(分子量3500)2d，经冷冻干燥得到白色絮状固体，即邻苯二醛封端的4臂聚乙二醇(4armpeg-opa)(2g，产率～100％)。
[0098]
邻苯二醛封端的六臂聚乙二醇的合成
[0099]
邻苯二醛封端的六臂聚乙二醇的合成方法同邻苯二醛封端的4臂聚乙二醇的合成，只是将得到的1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸丁二酰亚胺酯产物与6臂聚乙二醇混合的投料比为(2.4mol:0.2mol),余同上。
[0100]
邻苯二醛封端的八臂聚乙二醇的合成
[0101]
邻苯二醛封端的六臂聚乙二醇的合成方法同邻苯二醛封端的4臂聚乙二醇的合成，只是将得到的1，3-二甲氧基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸丁二酰亚胺酯产物与8臂聚乙二醇混合的投料比为(3.2mol:0.2mol),余同上。
[0102]
实施例1:
[0103]
(1)4armpeg-opa/gelatin凝胶的制备、成胶状态及成胶时间
[0104]
该水凝胶采用邻苯二醛封端的4臂聚乙二醇(4armpeg-opa)与明胶交联反应获得。基于氨基封端的聚乙二醇改性与丁二酰亚胺活性酯合成的4apeg-opa分子式结构式如图1所示。其成胶机理是利用对位的两个醛基与-nh2交联发生缩醛反应成胶。首先，将猪源的明胶先用去离子水透析2-3天后，去除杂质后冻干，然后将材料按照100mg/ml溶解在pbs中。由于明胶本身属于温敏性凝胶，因此10％(w/v)的明胶溶液使用时需提前在37度水浴加热溶解。配制10％的4apeg-opa溶液时，需先将固体粉末从-20℃中取出，恢复室温半小时后再称量。然后将称量合适质量的4apeg-opa溶解在pbs中。最后将10％(w/v)明胶溶液和10％(w/
v)4apeg-opa按照体积比1:1充分混合均匀，静置成胶。图2a为4armpeg-opa/gelatin成胶状态，呈淡黄色，具有一定的机械强度。图2b为4armpeg-opa/gelatin在不同环境下的成胶时间，在室温条件下2-3分钟成胶，而在37℃水浴条件下，52.4
±
5.59秒成胶。该水凝胶的成胶时间符合临床使用需求。
[0105]
(2)4armpeg-opa/gelatin的流变性能测试
[0106]
通过流变仪测量4apeg-opa/gelatin凝胶在37℃条件下，储存模量g’和损耗模量g”与时间的关系，结果如图3所示。在早期，储存模量g’迅速增大，在5min时已达万帕级别，证实了该凝胶具有良好的粘弹性能。
[0107]
(3)4armpeg-opa/gelatin的体外及在体爆破压
[0108]
(i)体外爆破压：通过定制了一个聚四氟乙烯模具，测量体外爆破压。模具的模式图如图4a所示。向聚四氟乙烯垫片中加入充分混匀的水凝胶材料50ul。放入37℃水浴中5min、15min、30min后，采用输液泵往小室内注pbs，速率0.8ml/min，测量凝胶的爆破压，多次重复实验获得相应材料的数据。测量的结果如图4b所示。在5min时,4armpeg-opa/gelatin的强度与纤维蛋白胶类似，但随着固化时间的延长，4armpeg-opa/gelatin的强度逐渐增大，可达200cmh2o，性能远强于纤维蛋白胶。
[0109]
(ii)在体爆破压：在体爆破压的测量原理依照图4a中的模式图进行，只是将小室换成了实验动物。本次选择了日本大耳白兔作为实验对象。于颅顶正中做一长约3cm的皮肤切口，显露颅骨。在矢状缝前后各做一直径10mm的圆形骨缺损。并在后方颅顶缺损区硬脑膜上做一长约5mm的纵行切口，在额顶区颅骨缺损处埋置留置针，以0.8ml/min的速度往颅内注射生理盐水，保证在后方硬膜缺损区有脑脊液持续稳定的漏出。此时，往缺损区加4armpeg-opa/gelatin或者纤维蛋白胶(胶量刚好填充整个颅骨缺损)成胶5min后测量两组材料的爆破压，结果如图4c所示。同样，在体条件下，4armpeg-opa/gelatin的机械性能明显优于纤维蛋白胶。
[0110]
(4)4armpeg-opa/gelatin对兔子硬脑膜的修复
[0111]
选择日本大耳白兔，设立分组：4apeg-opa/gelatin组、纤维蛋白胶组、空白组。兔子麻醉后额顶部皮肤备皮、消毒后延正中做一切口，后至枕后隆凸处，长约3cm。然后选用traus 204电动打磨机在冠状缝后方、矢状缝右侧做一直径1cm的圆形骨缺损，过程中注意小心剥离颅骨下层骨皮质，避免损伤硬膜。显露硬膜后，采用显微剪刀剪开硬脑膜和蛛网膜，做一长5mm的硬脑膜缺损模型。造模成功后，根据每组要求分别在不同组别上添加相应材料(用量为能够填补颅骨缺损)，填充缺损区堵硬脑膜，或不处理。相应处理结束后给予全层缝合，消毒，放回笼具。术中及术后给予头孢曲松钠注射，抗感染治疗。术后给予观察切口外像、核磁检测，结果如图所示。从图5的外像中，可以看出，与空白组相比，纤维蛋白胶与空白组伤口差不多，而4armpeg-opa/gelatin明显优于纤维蛋白胶组和空白组。图6的核磁数据显示，在1周时，空白组和纤维蛋白胶组皮下大量积聚脑脊液，而4armpeg-opa/gelatin未观察到脑脊液渗漏。在2周时，纤维蛋白胶和空白组略有改善，但仍旧比4armpeg-opa/gelatin差。
[0112]
(5)4armpeg-opa/gelatin的细胞毒性。
[0113]
为了测定干粉粘合剂的细胞毒性，采用cck-8法。将材料按照国家医疗器械标准，以200mg/ml浸泡在dmem培养基中，37
°
，孵育24h，获取浸提液。复苏成纤维细胞3t3后，进行
稳定传代一次后，接种于96孔板中，细胞密度约5000/孔。于37
°
，5％co2中培养24小时后确定细胞生长状态良好后，将培养基换成浸提液进行细胞培养，于24h，48h观察细胞的活力。从图7中可以看出在按照国家医疗器械标准制备的浸提液无细胞毒性，表面材料在细胞水平具有良好的生物相容性。
[0114]
实施例2:4armpeg-opa/gelatin水凝胶和纤维蛋白胶对大鼠硬脊膜修复
[0115]
选择sd大鼠，分为4apeg-opa/gelatin组、纤维蛋白胶组、空白组，每组4只大鼠。设立两个时间观察点：1周，2周。采用戊巴比妥钠麻醉成功后，后背部皮肤备皮、消毒。沿后背正中腰段切开皮肤、皮下组织、肌肉，显露棘突及椎板。采用单关节骨剪咬除棘突、椎板，暴露硬膜囊，直视下可见硬膜囊搏动。采用显微钩聂和显微剪刀纵行剪开硬膜及下层的蛛网膜，长度1cm，可见清亮的液体流出证实造模成功。造模过程中注意勿损伤脊髓。造模成功后，分别根据不同组别的需求给予不同的水凝胶材料封堵硬膜缺损。术后立即出现神经功能障碍的大鼠给予安乐死，并补充相应实验动物。在术后观察动物切口情况，注意各组有无伤口渗出液等。在术后第1周、第2周将实验动物安乐死，打开切口，观察并记录切口浅层愈合情况。之后将手术节段区域整段脊柱及后方组织剪下，放入4％多聚甲醛中固定，然后采用edta脱钙液进行脱钙，每隔2-3天换一次脱钙液，定期观察脱钙情况。脱钙完成后，将软化的骨头取出，用流水冲洗。之后放入脱水吊篮，于脱水机内依次梯度酒精脱水，完成后进行包埋、切片、染色，进行组织学分析。伤口愈合外像。可见，空白组由于脑脊液漏的持续存在，与皮下形成大量积液，纤维蛋白胶的封堵效果较差，同样出现的相类似的情况，而4apeg-opa/gelatin组伤口愈合良好，未见不良情况。为了进一步验证硬膜修复作用，组织学分析结果可见在1周时，可明显看见未治疗组和纤维蛋白胶组的硬膜存在缺损，肉芽组织尚未完全填充缺损区域。4apeg-opa/gelatin组的硬膜缺损区可见明显的肉芽组织填充，封堵缺损硬膜，局部可见残留的凝胶组织。在2周时，未治疗组和纤维蛋白胶组可见稀疏的肉芽组织开始完全覆盖了缺损区。4apeg-opa/gelatin组硬膜缺损区域可见肉芽组织填充，并且肉芽组织逐渐成熟。结果证实4apeg-opa/gelatin在封堵硬膜的基础上具有促进了硬膜的修复作用。
[0116]
实施例3:4armpeg-opa/gelatin水凝胶封堵硬膜的同时预防硬膜外纤维化
[0117]
选择实施例1中的材料，按照实施例2中的实验方法，将实验动物改为实验兔。实验动物麻醉成功，以l4、l5为中心备皮、消毒。采用11号刀片做一长约4cm的手术切口，钝性分离皮下组织、肌肉。充分暴露棘突、椎板。采用单关节骨剪去除棘突及椎板，保留关节突，显露硬膜。手术过程动作要轻，避免损伤神经造成下肢瘫痪。然后采用显微剪刀剪开硬脊膜及下层的蛛网膜，见清亮的脑脊液流出证实造模成功。然后采用相应的材料封堵缺损硬膜。待胶稳定后闭合伤口，逐层缝合。用碘伏消毒伤口，放回笼具中。在1个月和3个月进行核磁检测，结果显示未治疗组手术区域可见长t1、短t2的低信号团块组织，为新生的瘢痕组织，其与硬膜、脊髓分别不清，并随着时间的延长(1个月到3个月)，其对脊髓的压迫有增大趋势。纤维蛋白胶组同样存在相类似的问题，脊髓硬膜与后方组织分界不清。在1个月时，植入的纤维蛋白胶可见少量的残留影像，而在三个月时，纤维蛋白胶已经被完全降解到。4apeg-opa/gelatin组的核磁影像可以清晰的看见植入的水凝胶。其在1个月时，填充在脊髓和后方软组织之间，起到屏障作用，各层组织结构清晰明了。在3个月时，植入的凝胶残留大小大约为1个月时的1/2大小。证实4apeg-opa/gelatin在封堵硬膜的同时可以充当屏障作用预
防硬膜外纤维化。
[0118]
实施例4
[0119]
降解性能具体方法如下：
[0120]
进行体外降解实验是用来初步评价凝胶的降解性能情况。首先，选择2ml离心管，并称重，然后将10％(w/v)的凝胶前驱液充分混匀后转移到离心管中，在37℃水浴中成胶固化，2h后称重离心管+胶的质量。将两者相减获得凝胶的初始质量w0，然后向离心管中根据实验需要加入1ml pbs溶液或原酶(10u/ml、5u/ml)。之后将样品放在37℃振荡箱中孵育。分别在不同时间点将样本的浸泡液吸除、滤纸吸干后称取凝胶的质量，记录凝胶质量随时间变化曲线。结果如图8所示，表明，本发明提供的4armpeg-opa/gelatin水凝胶可生物降解，同时溶胀率低：33.28％
±
5.00％。
[0121]
实施例5
[0122]
具体方法如下：
[0123]
为了测定水凝胶的压缩性能，定制了一个聚四氟乙烯圆环形模具。模具的内径为8mm，厚度5mm。为了方便加材料和剥离胶，在模具的一个口制造了内径约2mm的空缺。模具处理好后，分别向每个模具里加入250ul上述的材料(4apeg-opa/gelatin、4apeg-opa/4apeg-ssnh2、纤维蛋白胶)。在37℃条件水浴下稳定成胶2小时后在万能试验机上测试其压缩强度。测试条件：室温(22-25℃)、传感器为50n、触发力为0.004n、速率2mm/min。记录凝胶随位移变化而产生的应力变化(f)。结果如图9所示，结果表明，本发明提供的4armpeg-opa/gelatin水凝胶机械性能良好。压缩模量112kpa
±
17.15，远高于纤维蛋白胶(商用)的强度31.97kpa
±
2.08。
[0124]
实施例6
[0125]
6armpeg-opa/gelatin和8rampeg-opa/gelatin水凝胶的制备、成胶状态及成胶时间
[0126]
按照实施例1(1)中的实验方法，将10％的6armpeg-opa和8armpeg-opa与明胶按照1:1一锅混的办法制备6armpeg-opa/gelatin和8rampeg-opa/gelatin。采用试管倒置法测试6armpeg-opa/gelatin和8rampeg-opa/gelatin水凝胶的成胶时间，结果显示在37℃时，6armpeg-opa/gelatin，8rampeg-opa/gelatin成胶时间分别为45.0
±
3.48秒和41.72
±
5.71秒。证实随着peg的臂增加，醛基基团增加，成胶时间更近一步缩短。多臂peg-opa与明胶的成胶时间证实多臂peg-opa能够与明胶快速成胶，成胶时间窗符合临床使用场景。
[0127]
实施例7
[0128]
按照实施1(1)中选择了不同浓度(5％和25％)的4armpeg-opa和不同浓度(5％和25％)明胶按照质量分数1:1混合。同样采用试管倒置法进行测试水凝胶的成胶时间。结果显示在37℃时5％的4armpeg-opa/gelatin的成胶时间为102.3
±
2.61秒，25％的4armpeg-opa/gelatin成胶时间为26.7
±
4.21秒。证实，随着聚合物浓度的增加，4armpeg-opa/gelatin成胶时间逐渐缩短。
[0129]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。