石莲花醚提取物在抑制神经细胞死亡制剂及食品上的应用的制作方法

1.本发明涉及一种抑制神经细胞死亡制剂及食品，具体涉及一种石莲花提取物在脑神经系统疾病中的应用。


背景技术：

2.神经细胞是神经系统的组成细胞，对动物来说，承担着信息处理和信息传递这一非常重要的角色。神经细胞一旦发生异变，就会引起各种疾病。例如，阿尔茨海默症是由于大脑神经细胞发生细胞死亡而发病的。此外，帕金森病是由于中脑黑质的多巴胺神经细胞减少而发病的。之前的研究普遍认为，脑内神经细胞的细胞死亡是由淀粉样蛋白的蓄积引起的，为防止淀粉样蛋白的蓄积，已开发了各种各样的药剂。然而这些痴呆症的治疗药，没有起到应有的药效，行业内开始怀疑淀粉样蛋白的蓄积是痴呆症的直接原因这一说法。
3.因此，在开发以治疗和预防痴呆症为目的的创新药物时，对于引起神经细胞死亡的药物和防止神经细胞死亡的药物，有必要研究其作用，重新研究发病的机理。另外，通过开发抑制神经细胞死亡的药物，有望成为痴呆症等神经细胞死亡相关疾病的治疗药和预防药。
4.作为引起神经细胞死亡的主要药剂，已知的是软骨藻酸。软骨藻酸是从被用作驱虫药的红藻花杨中分离
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鉴定出的亚氨基酸，是具有谷氨酸和天冬氨酸分子骨架的分子。已知谷氨酸及天冬氨酸是脑内兴奋性神经递质，过量释放会引起神经细胞死亡。软骨藻酸作用于这类兴奋性神经递质的三种药物受体（nmda、ampa和kainate受体）中的kain酸受体。与其他受体一样，过量是由于从细胞外的钙流入和从储藏部位的钙游离，引起细胞内钙浓度，从而降低线粒体的变形和atp的产生能力。结果，软骨藻酸从游离到cace9细胞外等诱导神经细胞凋亡和死亡。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种石莲花提取物在脑神经系统疾病中的应用，本发明利用软骨藻酸具有的诱发神经细胞死亡作用，从众多天然产物中筛选出抑制其作用的物质，经过锐意研究，发现石莲花中的提取物是有效的神经细胞死亡抑制剂。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种石莲花提取物在脑神经系统疾病中的应用，其特征在于，所述的神经系统疾病为神经细胞死亡；所述的石莲花提取物是将石莲花经溶剂提取得到；所述的石莲花提取物用药剂量为0.1~10mg/kg b.w。
7.所述的石莲花提取物按以下方式取得：石莲花采取规定部位或全草后干燥后切碎货粉碎，以其作为基本提取原料；石莲花提取中使用的溶剂为有机溶剂，在室温下进行或者加温，萃取温度在室温和溶剂沸点之间，对于加温萃取，回流萃取可进一步提高萃取率；提取后过滤固体得到的提取液，提取液浓缩得到石莲花提取物。
8.所述的有机溶剂为乙醚、thf、乙酸乙酯、苯、氯仿、烃、二氯甲烷、四氯化碳、丙酮、各种醇类中的一种或几种任意比例的混合物。
9.所述的有机溶剂为二甲醚。
10.所述的有机溶剂为乙醚，乙醚提取物为0.1~10mg/kg b.w。
11.所述的乙醚提取物为0.2~5mg/kg b.w。
12.所述的提取液通过常规方法浓缩，在减压下低温进行，浓缩进行到提取液干燥为止。
13.所述的石莲花提取物添加到食品中可用作抑制神经细胞死亡的食品组合物，形式可以是固体、半固体或液体产品。
14.所述的石莲花提取物添加到食品的应用是饼干、仙贝、果冻、羊羹、酸奶、包子、清凉饮料、茶类、营养饮料、汤。
15.所述的石莲花提取物应用的食品组合物可以是片剂并用常规方法涂覆，或液体制剂，即水性或油性悬浮液、溶液、乳液、糖浆或酯的形式，或干燥产品，在使用前用水或其他合适的赋形剂再生。
16.所述的液体制剂包括常规添加剂，混悬剂包括如山梨醇，糖浆，甲基纤维素，葡萄糖糖浆，明胶水添加食用脂，乳化剂包括如卵磷脂，山梨酯单油酸或阿拉伯橡胶，非水性赋形剂包括如杏仁油或分馏椰子油或甘油或丙二醇或乙醇之类的油性酯，防腐剂包括如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸，及着色剂或香料。
17.所述的石莲花提取物提取物可直接用于制备本发明的组合物，但可用作粉末状或冻干品。
18.所述的提取液可以直接使用，或在浓缩前或浓缩后单独或组合使用色谱法、离子交换色谱法、溶剂分配提取等进行纯化。
19.所述的石莲花提取物当介质稀释，以药品形式使用，包括散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或液体，用量通过up-and-down法计算50%有效量等方式确定，所述介质包括药物上可接受的赋形剂，即，粘合剂包括糖浆或阿拉伯橡胶或明胶或山梨醇或火山口或聚乙烯吡咯烷酮，填料包括如乳糖或糖或玉米淀粉或磷酸钙或山梨醇或甘氨酸，润滑剂包括硬脂酸镁或滑石粉或聚乙二醇，崩解剂包括马铃薯淀粉，润湿剂包括月桂酰硫酸钠。
20.本发明的有益效果是：本发明中使用石莲花为景天科景天属、石莲花属和青锁龙属，首次发现确认有效品种为景天科景天属铭月种sedum nussbaumerianum，也叫金景天，属于多年生亚灌木。可使用部分为石莲花的的叶和茎。作为医药、保健食品及一般食品原料。
21.本发明利用软骨藻酸具有的诱发神经细胞死亡作用，从众多天然产物中筛选出抑制其作用的物质。经过锐意研究，发现石莲花中的提取物是有效的神经细胞死亡抑制剂，石莲花醚提取物投药给大鼠腹腔时，软骨藻酸致神经细胞死亡的作用被显著抑制。在石莲花的提取物中，有机溶剂提取物（更优选乙醚提取物）的抑制效果较强。
22.此外，由于该食品组合物含有石莲花的提取物，可以起到抑制神经细胞死亡的作用。
附图说明
23.图1大鼠脑组织水平剖面图。
24.图2脑内注射软骨藻酸的大鼠头顶皮质部分的光学显微镜照片（照片左侧为未投用石莲花提取物（比较例1），照片右侧为有投用石莲花提取物（实施例1））。
25.图3脑内注射软骨藻酸的大鼠齿状回部分的光学显微镜照片（照片左侧为未投用石莲花提取物（比较例1），照片右侧为有投用石莲花提取物（实施例1））。
26.图4脑内注射软骨藻酸的大鼠ca4部分的光学显微镜照片（照片左侧为未投用石莲花提取物（比较例1），照片右侧为有投用石莲花提取物（实施例1））。
27.图5脑内注射豆腐皮酸的大鼠嗅内皮质部分的光学显微镜照片（照片左侧为石莲花提取物未给药（比较例1），照片右侧为石莲花提取物给药（实施例1））。
28.图6脑内注射软骨藻酸的大鼠prh部分的光学显微镜照片（照片左侧为未投用石莲花提取物（比较例1），照片右侧为有投用石莲花提取物（实施例1））。
具体实施方式
29.以下结合附图及实施例对本发明进一步叙述，但本发明不局限于以下实施例。
30.实施例1事先将干燥石莲花原料用醚提取，用蒸发器干燥后溶解于乙醇中保存。
31.神经细胞死亡抑制效果试验：将上述石莲花提取物乙醇溶液在无麻醉下对大鼠脑内注射软骨藻酸的前一天及当天3小时前（合计2次）腹腔内给药。剂量确定采用石莲花剂量稀释阶段预处理up-and-down法计算50%有效剂量，石莲花的剂量为乙醚提取物0.5 mg/kg b.w.。另外，进行试验的大鼠的个体数为10例以上。
32.按照上述方法，对腹腔内投用石莲花提取物的大鼠，使用urethane 1 g/kg i.p.实施麻醉，并用钻头钻孔，使其能够在颅骨头顶部刺入27 g注射针头。用脑定位仪垂直钻孔，将注射针插入孔内，深约3.5 mm后，3
×
10-7
注入g/ml的豆腐皮酸溶液20μl（切片制作后添加碳以方便分辨）。之后，慢慢拔出注射针，对伤口进行消毒缝合。
33.细胞凋亡检测方法：用软骨藻酸处理的大鼠，第二天用4%多聚甲醛溶液灌流固定全身，包埋石蜡，切薄石蜡块。切片的厚度为1μm。将切片放入玻璃杯预片固定，进行苏木精
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伊红染色。另一种试料采用了细胞凋亡检测试剂盒（tdt-mediated uutp backend labeling 3
‘‑
oh terminal transferase方法）。显色是浸泡pod conjugated antibody，清洗后用dab显色。细胞凋亡通过细胞核显色为茶褐色很容易辨别。并且轻施苏木精染色，未凋亡的细胞核呈蓝色深色。
34.（比较示例1）在比较例1中，腹腔内投用生理盐水代替石莲花提取物。其他处理与实施例1相同，省略说明。
35.大鼠脑组织水平剖面图如图1所示。另外，将软骨藻酸注入脑内后各部位的光学显微镜照片如图2~图6所示。
36.头顶皮质的结果（参照图2）：如图2左侧照片所示，在比较例1（即投用生理盐水的对照组）中，位于颞前区的头顶皮质中，tunel阳性细胞成束密集，其中大部分是比较小的细胞。其中零星可见一些阴性
细胞。由上可知，在未投用石莲花提取物的比较例1中，软骨藻酸显著引起神经细胞死亡。与此相对，如图2右侧照片所示，在投用石莲花提取物的实施例1中，几乎没有观察到这样的tunel阳性细胞，发现其对神经细胞死亡的抑制效果显著。
37.齿状回（参照图3）和ca4（参照图4）的结果：另一方面，在比较例1中，在海马带中与hill和ca4相邻的齿状回中，发现大细胞和小细胞均为tunel染色阳性的细胞，小细胞聚集部位的大细胞被强烈地染色为阳性（见图3和图4）。从这些结果可以明显地发现由软骨藻酸引起的神经细胞死亡。与此相对，在预先投用石莲花提取物的实施例1中，几乎看不到小的阳性细胞，大的细胞仅有少许阳性，对神经细胞死亡的抑制效果显著。
38.嗅内皮质（参照图5）和prh（参照图6）的结果：另外，在嗅内皮质和prh中，在比较例1中，tunel染色阳性的细胞仅限于小细胞。另一方面，在预先投用石莲花提取物的实施例1中，发现这种小细胞的阳性也得到了抑制。这些小细胞被认为是神经细胞，而神经胶质细胞也因石莲花提取物而tunel染色转阴，显示石莲花对由软骨藻酸引起的凋亡细胞死亡有较强的抑制作用。
39.关于有效剂量：石莲花有效剂量调查结果见表1。根据该表，通过up-and-down法求出50%有效用量，结果计算出0.15 mg/kg b.w.。上述的神经细胞死亡抑制效果试验全部使用了1 mg/kg b.w.，约为50%有效量的10倍，因此可以认为在所有大鼠病例中都显示了充分的有效性。
40.如表1所示，以上试验结果明确表明，石莲花的乙醚提取物可以预防性抑制神经细胞由软骨藻酸引起的凋亡。软骨藻酸与谷氨酸
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天冬氨酸具有相同的结构，这表明石莲花醚提取物对预防自然发病的痴呆症是有效的。不仅可以通过石莲花本身直接抑制脑内神经细胞的凋亡，而且神经胶质细胞也可以通过石莲花提取物使tunel染色转阴，强烈抑制凋亡细胞死亡，因此可以作为今后阐明重大神经退行性疾病的药理学工具。另外，作为这些疾病的治疗药物也是值得期待的。