一种细胞穿透肽修饰的核酸-阳离子热敏脂质体及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种细胞穿透肽修饰的核酸-阳离子热敏脂质体及其制备方法，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.脂质体是由磷脂双分子层形成的闭合囊泡，内水相可包载水溶性药物，而脂溶性药物可包载于磷脂双分子层间。脂质体已被广泛用于不稳定和难溶性药物的递送。脂质体具有优于其他纳米载体的优势，包括在体液和组织中的更高稳定性以及可生物降解性，具有长期释放药物的能力，且易于规模化生产。
3.阳离子脂质体(cationic liposome)为带有正电荷的脂质体，主要由带正电荷的脂质材料及中性脂质组成。阳离子脂质也称为细胞转染素，作为阳离子脂质体进行细胞转染的核心部位，其基本结构是一个带正电的基团连接在一个疏水基上，因其携带的正电荷可与目的基因上的负电荷相互作用而结合，从而形成稳定的复合物，增加在机体内的循环时间。最常见的阳离子基团是铵、咪唑、赖氨酸和胺/多胺；疏水基团则主要有：脂肪酰链和胆固醇环。常用的中性脂质则有：二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine,dope)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)、十八烷氨(octadecaneammonia)等。
4.在针对核酸的递送系统中，阳离子脂质体已经成为极具吸引力的载体之一。阳离子脂质体可通过静电吸引作用与带负电的核酸(如sirna、mrna、dna等)形成复合物，将核酸包载，并保护核酸免受核酸酶的降解，免疫原性低、毒性小，且生物可降解，目前已得到广泛应用。同时，阳离子脂质体可与带负电的细胞膜静电吸附，克服核酸与细胞膜之间因静电排斥导致的膜屏障，将核酸递送到细胞内发挥作用，转染效率高。
5.鱼精蛋白是带正电荷的聚阳离子，可用于将核酸凝聚成纳米级复合物。添加鱼精蛋白的目的是能够压缩核酸，促进其被阳离子脂质体完全包封。与单一阳离子脂质体或鱼精蛋白复合物相比，阳离子脂质体/鱼精蛋白复合物对于核酸的包裹效率最高，制剂稳定性最好。
6.胆固醇是哺乳动物细胞膜的主要组成部分，分布于磷脂双分子层间，并在人体内具有重要生理功能，是胆汁酸和类固醇激素合成的前体。胆固醇可作为脂质体膜材料、乳化剂、软膏基质等药用辅料，尤其在脂质体制剂中对提高制剂稳定性等有重要作用。在制备脂质体时添加适量的胆固醇，可使膜保持流动性的同时具备相对适宜的刚性。
7.麦角固醇是真菌细胞膜中的主要甾醇成分，可以通过微生物发酵合成得到，与胆固醇结构相似，化学结构如图1。麦角固醇具有抑菌、抗肿瘤、抗炎等作用，且为黄体酮、可的松、维生素d2等多种药物的前体，并且它对膜结构有重要作用，且对不同磷脂都具有增加膜的堆积，填充双层膜的作用。
8.β-谷甾醇(化学结构如图2)、豆甾醇(化学结构如图3)为植物甾醇，被称为健康型甾醇，与胆固醇结构类似，却能够抑制胆固醇在肠道的吸收并影响其代谢，对心血管代谢性
疾病和癌症等也有预防作用，β-谷甾醇、豆甾醇剂量还具有抗脂质体氧化的作用；天然的植物甾醇无毒性，是一类被允许在食品中添加的甾醇，在脂质体制剂中使用安全可靠；植物甾醇还具有与胆固醇相似的调节脂膜的能力，所得功能性脂质体能保持与原胆固醇脂质体类似的基本特征；这类健康型醇的药理作用以及不使用胆固醇扩大了脂质体制剂在降血脂领域的应用。
9.羊毛甾醇(化学结构如图4)是菌类甾醇，广泛用于食品、医药、化工行业，是一种安全性天然产物，具备生产原料成本低、易工业化生产等优势。一定浓度范围下(如20％用量)的羊毛甾醇具有脂膜调节作用。菌类甾醇丰富的药理活性以及细微的结构差异能够赋予脂质体新的特性。
10.细胞穿透肽(cell-penetratingpeptides，cpps)是一类带有正电荷的对细胞膜具有强力穿透作用的短肽，可用来修饰脂质体、纳米粒等微粒给药系统，促进细胞摄取，目前在药物递送领域受到了广泛关注。普通脂质体的入胞能力有限，经cpps修饰的脂质体能够提高脂质体的入胞率，是提高靶向给药效果的有力工具。在本团队的前期研究中(一种细胞穿透肽-甾醇耦合物及其制备方法，cn 202210245984.4)合成了一种胞穿透肽-甾醇耦合物，可作为一种带正电荷的脂质材料用于阳离子脂质体的制备，在体内具有明确的代谢途径，可代谢为甾醇和氨基酸，无细胞毒性作用。
11.现有阳离子脂质体的制备材料主要是具有季铵盐基团的阳离子脂质，在体内缺乏成熟的代谢途径，毒性较大。除此之外，通过静电吸附的入胞途径多为“内吞-溶酶体逃逸”途径，阳离子脂质体被细胞膜内陷形成的内涵体包裹，内涵体进一步变成溶酶体“消化”阳离子脂质体，仅1％左右的核酸能够从溶酶体中完整得逃逸，到达细胞质发挥生物功能，核酸的表达效率低。
12.由本发明人团队申请的公开专利：一种细胞穿透肽-甾醇耦合物及其制备方法(cn 114456233 a)，对于细胞穿透肽-甾醇耦合物进行了详细的说明。
13.本发明针对现有技术的不足，在制备阳离子脂质体的过程中加入上述带有正电荷的细胞穿透肽-甾醇耦连物，用于减少季铵盐阳离子脂质的使用量，从而减小阳离子脂质体的毒性。同时，通过处方筛选优化得到相变温度(tm)约为39-45℃的热敏感阳离子脂质体，通过温和加热促进脂质体与细胞膜发生膜融合作用，将核酸直接递送至细胞质，而避免“内吞-溶酶体逃逸”途径，提高递送效率。
14.通过检索，发现如下与本发明专利申请相关的专利公开文献：
15.递送sirna的阳离子脂质体及其制备方法(cn110680804a)，其特征在于：包含如下组分：dotap、hspc、dope、chol和dspe-peg
2000
各组分的重量比例为dotap：hspc、dope：chol：dspe-peg
2000
＝60:68:64:89-x：x，其中x＝35-45。而本发明制备的阳离子脂质体，含有细胞穿透肽-甾醇耦合物提供正电荷，转染效果好，dotap用量降低，毒副作用显著降低，两发明存在明显不同。
16.阳离子脂质体核酸类药物递送系统及其制备方法与用途(cn110548007a)，此发明涉及包含dotap、dope、胆固醇和dspe-peg
2000
的阳离子脂质体，用于治疗由基因异常表达引起的疾病的用途。而本发明制备的阳离子脂质体，含有细胞穿透肽-甾醇耦合物提供正电荷，转染效果好，dotap用量降低，毒副作用显著降低，两发明存在明显不同。
17.一种含有细胞穿透肽的纳米脂质体及其制备方法和应用(cn109392900b)，此发明
公开了一种含有细胞穿透肽的纳米脂质体，包括卵磷脂、表面活性剂、维生素e和细胞穿透肽，与本发明所使用的磷脂材料明显不同，同时其主要是用于农作物与本发明用于疾病治疗明显不同。
18.除此之外，本发明为一种细胞穿透肽修饰的核酸-阳离子热敏脂质体，通过温和加热使得阳离子热敏脂质体通过膜融合途径将核酸直接递送进入细胞质，与其他阳离子脂质体“内吞-溶酶体逃逸”的递送途径完全不同，核酸表达效率显著提高。通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质不同。


技术实现要素：

19.本发明的第一个目的在于：降低现有技术阳离子脂质体的制备材料中具有季铵盐基团的阳离子脂质的添加量，降低毒性。具有季铵盐基团的阳离子脂质材料在体内缺乏成熟的代谢途径，毒性较大，而本发明中添加的带正电荷的细胞穿透肽-甾醇耦合物在体内具有明确的代谢途径，可代谢为甾醇和氨基酸，无细胞毒性作用。
20.本发明的第二个目的在于：现有技术阳离子脂质体通过“内吞-溶酶体逃逸”的递送途径将核酸递送进入细胞质，能够完整进入细胞质发挥生物功能的核酸占其递送总量的1％左右，递送效率低导致核酸表达效率低。本发明为一种细胞穿透肽修饰的核酸-阳离子热敏脂质体，通过温和加热使得阳离子热敏脂质体与细胞膜融合，将核酸直接递送进入细胞质，不经过“内吞-溶酶体逃逸”的递送途径，核酸递送效率高，表达效率显著提高。
21.本发明的第三个目的在于：现有mrna疫苗稳定性差，需要-20℃，甚至-70℃超低温保存，对于世界范围内的运输和分发造成诸多困难，成为mrna疫苗应用的瓶颈问题。本发明利用冷冻干燥工艺去除阳离子脂质体中的含水微环境，抑制mrna水解反应，长期稳定性好，是可于2-8℃保存的核酸递送纳米载体。
22.本发明的第四个目的在于：研究发现现有mrna疫苗中用于提高体系内纳米载体稳定性的peg磷脂材料可能会造成疫苗预存免疫，影响其免疫效应。本发明以冻干粉保存，长期稳定性好，无需peg磷脂材料提高体系稳定性，故在处方中不再使用peg磷脂，避免其造成的预存免疫。
23.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
24.一种细胞穿透肽修饰的核酸-阳离子热敏脂质体，包括：可电离阳离子脂质20％-50％(质量百分比)，辅助脂质5％-70％(质量百分比)，固醇类偶联物5％-25％(质量百分比)和核酸，或包括：可电离阳离子脂质20％-50％(质量百分比)，辅助脂质5％-70％(质量百分比)，固醇类偶联物5％-25％(质量百分比)，核酸，鱼精蛋白。
25.优选地，可电离阳离子脂质选自dotma、dotap或dlin-mc3-dma中的一种或多种。
26.优选地，辅助脂质选自dppc、mspc和dope中的一种或多种，优选地为两种或三种。
27.优选地，细胞穿透肽-甾醇耦合物中的细胞穿透肽选自：cgykk(半胱氨酸-甘氨酸-酪氨酸-赖氨酸-赖氨酸)、cgyrr(半胱氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-精氨酸)、cgyyk(半胱氨酸-甘氨酸-酪氨酸-酪氨酸-赖氨酸)中的一种或多种。
28.优选地，固醇类偶联物选自细胞穿透肽-胆固醇偶联物、细胞穿透肽-麦角甾醇偶联物、细胞穿透肽-豆甾醇偶联物或细胞穿透肽-羊毛甾醇偶联物中的一种或多种。
29.优选地，阳离子热敏脂质体与核酸的包载质量比为：8:1～32:1。
30.优选地，核酸与鱼精蛋白的质量比为：3:1～9:1。
31.一种细胞穿透肽修饰的核酸-阳离子热敏脂质体的制备方法，步骤包括：
32.s1.将可电离阳离子脂质、辅助脂质、固醇类偶联物，溶于有机溶剂中，减压旋转蒸发，在瓶壁形成一层薄膜；
33.s2.在薄膜中加入无核酸酶水，水化，将薄膜从瓶壁上全部溶解；
34.s3.超声或均质，过滤整粒，制得阳离子热敏脂质体；
35.s4.将核酸与鱼精蛋白溶液混合静置，再加入阳离子热敏脂质体，孵育，制得核酸-阳离子热敏脂质体胶体溶液；
36.s5.在上述核酸-阳离子热敏脂质体中加入冻干保护剂混合均匀，分装后，进行冷冻干燥，制得核酸-阳离子热敏脂质体冻干粉。
37.优选地，一种细胞穿透肽修饰的核酸-阳离子热敏脂质体的制备方法，步骤包括：
38.s1称取可电离阳离子脂质成分，辅助脂质成分以及固醇类偶联物成分，溶于有机溶剂中，35℃-65℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；
39.s2在上述薄膜中加入无核酸酶水，30℃-65℃条件下水化5-60min，将薄膜从瓶壁上全部溶解；
40.s3超声或均质，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒，制得阳离子热敏脂质体；
41.s4将核酸与鱼精蛋白的hepes溶液混合静置，再加入阳离子热敏脂质体，孵育5-30min，制得核酸-阳离子热敏脂质体胶体溶液；
42.s5在上述核酸-阳离子热敏脂质体中加入冻干保护剂混合均匀，分装后，进行冷冻干燥，制得核酸-阳离子热敏脂质体冻干粉。
43.优选地，步骤s3中超声持续时间为2-8min，功率为50-200w；优选地，每超声工作1-2s，间隔1-2s。优选地，步骤s5中冻干保护剂选自海藻糖或蔗糖的一种或两种；优选地，海藻糖或蔗糖的质量百分比为0.5％-10％，更优选地为0.5％-5％。
44.优选地，步骤s5中冷冻干燥步骤包括为预冻、冷冻干燥和解吸干燥，优选地，为-80℃～-60℃预冻4～6小时，-60℃～25℃冷冻干燥和解吸干燥共计12～24小时。
45.一种细胞穿透肽修饰的核酸-阳离子热敏脂质体在制备药物或疫苗中的应用；优选地，为核酸的包载和递送的应用；更优选地，所述核酸包括sirna、mrna、dna。
46.本发明制备的一种细胞穿透肽修饰的核酸-阳离子热敏脂质体，具有以下优点和积极效果：
47.1、一方面包载保护核酸，避免被核酸酶降解，另一方面克服了核酸与细胞膜之间因均带有负电荷的静电排斥而形成的细胞内递送屏障。
48.2、通过添加细胞穿透肽-甾醇偶联物提供正电荷，降低季铵盐基团阳离子脂质的使用量，继而显著降低细胞毒性。
49.3、通过温和加热，利用核酸-阳离子热敏脂质体双分子层膜与细胞膜的膜融合途径，将核酸递送至细胞质中，避免“内吞-溶酶体逃逸”递送途径，显著提高核酸的递送效率和细胞内表达效率。
50.4、本发明以冷冻干燥工艺制备的一种细胞穿透肽修饰的核酸-阳离子热敏脂质体冻干粉，去除体系内含水微环境，抑制核酸水解，提高制剂长期稳定性。
51.5、本发明不使用peg磷脂作为脂质体膜材，避免其引起的预存免疫。
52.6、核酸-阳离子热敏脂质体具有脂质体强大的载药能力，能同时包载递送核酸和其他药物，使各组分发挥协同作用。
附图说明
53.图1为麦角固醇的化学结构式
54.图2为β-谷甾醇的化学结构式
55.图3为豆甾醇的化学结构式
56.图4为羊毛甾醇的化学结构式
57.图5为chol-cgykk的合成路线
58.图6为ergo-cgykk的合成路线
59.图7为实施例1阳离子脂质体的粒径和zeta电位分布图
60.图8为实施例2阳离子脂质体的粒径和zeta电位分布图
61.图9为实施例3阳离子脂质体的粒径和zeta电位分布图
62.图10为实施例4阳离子脂质体的粒径和zeta电位分布图
63.图11为实施例1与s-mrna、egfp mrna以不同质量比结合的结果图
64.图12为s-mrna与鱼精蛋白凝胶阻滞结果
65.图13为本发明中实施例14的透射电镜扫描图
66.图14为激光共聚焦显微镜下实施例9、实施例10的细胞摄取图
67.图15为以流式细胞仪测定的实施例15、对比例1转染效率图
68.图16hek-293细胞经冻干复水后的实施例14、实施例16、实施例17、实施例18处理后，s-mrna蛋白表达水平(a)western blot，marker作为内参蛋白，1’～4’为对细胞加热处理(42℃)，1～4未对细胞加热处理(37.5℃)；(b)elisa实验，**，p《0.01；****，p《0.0001.1-实施例14，2-实施例16，3-实施例17，4-实施例18。
69.图17hek-293细胞经冻干复水后的实施例19、实施例20、实施例21、实施例22处理后，s-mrna蛋白表达水平(a)western blot，marker作为内参蛋白，1～4未对细胞加热处理(37.5℃)；(b)elisa实验，**，p《0.01；****，p《0.0001.1-实施例19，2-实施例20，3-实施例21，4-实施例22。
70.图18为本发明中实施例1、实施例5与对比例1mtt毒性对比图。
71.图19冷冻干燥后的实施例14、实施例16、实施例17、实施例18于4℃储存6个月的稳定性.1-实施例14，2-实施例16，3-实施例17，4-实施例18。
72.图20体内免疫效应研究(a)小鼠分别于第0天和第14天接种mrna疫苗，免疫后第14天和第28天采集血清；(b)针对wuhan-hu-1的igg；(c)针对501y.v2的igg。ns，p》0.05；****，p《0.0001。1-实施例14，2-实施例16，3-实施例17，4-实施例18。
73.图21体内免疫效应研究(a)小鼠分别于第0天和第14天接种mrna疫苗，免疫后第14天和第28天采集血清；(b)针对wuhan-hu-1的igg；(c)针对501y.v2的igg。ns，p》0.05；****，p《0.0001。1-实施例19，2-实施例20，3-实施例21，4-实施例22。
具体实施方式
74.下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性
的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
75.下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
76.实施例1
77.以dotap:dope:dppc:chol-cgykk:mspc＝40％:10％:10％:10％:30％(质量比)制备脂质体，按比例称取dotap、dope、dppc、chol-cgykk、mspc溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着加入2.88ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体2min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得阳离子热敏脂质体，其粒径分布和zeta电位见图7。
78.实施例2
79.以dotap:dppc:chol-cgykk:mspc＝40％:20％:10％:30％(质量比)制备脂质体，按比例称取dotap、dppc、chol-cgykk、mspc溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着加入3.28ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体2min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得阳离子热敏脂质体，其粒径分布和zeta电位见图8。
80.实施例3
81.以dotap:dope:dppc:chol-cgykk:mspc＝35％:10％:10％:15％:30％(质量比)制备脂质体，按比例称取dotap、dope、dppc、chol-cgykk、mspc溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着，加入2.93ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体2min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得阳离子热敏脂质体，其粒径分布和zeta电位见图9。
82.实施例4
83.以dotap:dppc:chol-cgykk:mspc＝40％:10％:10％:40％(质量比)制备脂质体，按比例称取dotap、dppc、chol-cgykk、mspc溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着加入2.98ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体2min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得阳离子热敏脂质体，其粒径分布和zeta电位见图10。
84.实施例5
85.以dotap:dope:dppc:ergo-cgykk:mspc＝40％:10％:10％:10％:30％(质量比)制备脂质体，按比例称取dotap、dope、dppc、egro-cgykk、mspc溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着加入3.13ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体5min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得阳离子热敏脂质体。
86.实施例6
87.以dotap:dppc:ergo-cgykk:mspc＝40％:20％:10％:30％(质量比)制备脂质体，
按比例称取dotap、dppc、egro-cgykk、mspc溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着，加入2.93ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体5min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得阳离子热敏脂质体。
88.实施例7
89.以dotap:dope:dppc:ergo-cgykk:mspc＝35％:10％:10％:15％:30％(质量比)制备脂质体，按比例称取dotap、dope、dppc、egro-cgykk、mspc溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着，加入2.97ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体5min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得阳离子热敏脂质体。
90.实施例8
91.以dotap:dppc:ergo-cgykk:mspc＝40％:10％:10％:40％(质量比)制备脂质体，按比例称取dotap、dppc、egro-cgykk、mspc溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着加入2.98ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体5min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得阳离子热敏脂质体。
92.实施例9
93.以dotap:dope:dppc:chol-cgykk:mspc＝40％:10％:10％:10％:30％(质量比)制备脂质体，按比例称取dotap、dope、dppc、chol-cgykk、mspc，以及1mg香豆素6(cou-6)溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着加入2.88ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体2min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得cou-6阳离子热敏脂质体。
94.实施例10
95.以dotap:dope:dppc:ergo-cgykk:mspc＝40％:10％:10％:10％:30％(质量比)制备脂质体，按比例称取dotap、dope、dppc、egro-cgykk、mspc，以及1mg香豆素6(cou-6)溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着加入3.13ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体5min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得cou-6阳离子热敏脂质体。
96.实施例11ctl包载mrna比例筛选
97.将实施例1分别与s-mrna、egfp mrna以质量比2：1、4：1、8：1、16:1、24：1、32：1混合，孵育20min，分别取10μl于琼脂糖凝胶上样，结果见图11。由图11可以看出，以裸s-mrna、egfp mrna为对照，以琼脂糖凝胶为单条带观察。当阳离子脂质体与s-mrna、egfp mrna以2:1和4:1的质量比复合时，仍可观察到s-mrna、egfp mrna的迁移。这是由于过量的s-mrna、egfp mrna与脂质体没能静电吸附。这种现象可能与zeta电位有关，因为对于两个r+/-值，zeta电位都没有达到最大值，这证实了系统中存在一部分游离mrna。从阳离子脂质体与s-mrna、egfp mrna的质量比为8:1开始，s-mrna、egfp mrna的清晰条带不再可见。由此可知，阳离子脂质体与s-mrna、egfp mrna的质量比应等于或高于8:1，则s-mrna、egfp mrna可被
完全包载吸附。
98.实施例12mrna与鱼精蛋白比例筛选
99.以s-mrna与鱼精蛋白的质量比为1:0、20:1、15:1、10:1、5:1、3:1、1:1、1:2、1:3混合，进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图12，表明当s-mrna与鱼精蛋白的质量比≤1:1时，易发现大部分的s-mrna被鱼精蛋白吸附住，说明此时的鱼精蛋白的量过多，故s-mrna与鱼精蛋白的质量比不宜低于1:1。然后测定zeta电位，如表1所示，s-mrna与鱼精蛋白的质量比为1:1时为正电荷，故不能选择此比例，而s-mrna与鱼精蛋白的质量比≥3:1时，均为负电荷。
100.以s-mrna与鱼精蛋白的质量比(w/w)为10:1、5:1、3:1混合静置20min后，再与实施例1混合，采用粒度仪测其粒径，并与未加入鱼精蛋白的包载mrna的阳离子脂质体(s-mrnactl)的粒径相对比。如表1所示，s-mrnactl(未加鱼精蛋白)的粒径为220.6
±
1.2nm，而以s-mrna与鱼精蛋白的质量比(w/w)为10:1时，粒径为244.5
±
1.2nm，粒径相较于未加鱼精蛋白时，粒径偏大，推测是由于鱼精蛋白的加入量过小，未起到浓缩s-mrna链长的作用；以s-mrna与鱼精蛋白的质量比(w/w)为5:1，3:1时，粒径差异不大。可见，s-mrna与鱼精蛋白的质量比(w/w)为3:1～9:1是最佳比例范围。
101.表1鱼精蛋白加入量对于mrna-ctl粒径电位的影响
[0102][0103][0104]
实施例13包载mrna的阳离子热敏脂质体的制备(mrna-ctl)
[0105]
以mrna与鱼精蛋白的质量比(w/w)为5:1混合静置20min后，再将不同处方的ctl与mrna以质量比8:1混合，制备包载mrna的阳离子脂质体，即mrna-ctl，继而加入冻干保护剂，进行冷冻干燥，以冻干粉性质于2～8℃保存。
[0106]
表2不同处方的mrna-ctl
[0107]
名称ctl处方包载mrna种类实施例14实施例1s-mrna实施例15实施例1egfpmrna实施例16实施例2s-mrna实施例17实施例3s-mrna实施例18实施例4s-mrna实施例19实施例5s-mrna实施例20实施例6s-mrna实施例21实施例7s-mrna实施例22实施例8s-mrna
[0108]
对比例1
[0109]
市售的转染试剂lipo2000。
[0110]
对比例2
[0111]
dotap:dppc:ergo-cgykk:mspc＝40％:20％:10％:30％(质量比)脂质体制备以40％:20％:10％:30％(质量比)称取一定量的dotap、dppc、egro-cgykk、mspc溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着，加入2.93ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体1min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得阳离子热敏脂质体。
[0112]
对比例3
[0113]
dotap:dppc:ergo-cgykk:mspc＝40％:20％:10％:30％(质量比)脂质体制备以40％:20％:10％:30％(质量比)称取一定量的dotap、dppc、egro-cgykk、mspc溶于3ml三氯甲烷中，50℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜；接着，加入2.93ml无核酸酶水在55℃条件下水化40min；然后将脂质体转入试管中，使用超声波细胞粉碎机探头超声处理脂质体10min(100w，工作2s，间隔2s)，再通过0.22μm无菌滤膜过滤整粒得阳离子热敏脂质体。
[0114]
试验例1超声时间对于阳离子脂质体粒径电位的影响
[0115]
将对比例2、对比例3和实施例6稀释适当倍数后，使用malvern nano-zs 90激光粒度仪，在室温条件下分析脂质体的粒径和电位，测定结果如表3。可见超声时间与阳离子脂质体粒径呈正相关，超声时间越长，粒径越小。对于mrna的递送载体来说，粒径控制在70-100nm为宜，不应过小或过大，故基于试验例数据，针对添加有ergo-cgykk的脂质体，超声时间应控制在3-8min。
[0116]
表3超声不同时间粒径电位对比结果
[0117][0118][0119]
试验例2微观形态观察
[0120]
取铜网，滴加实施例14所制备的s-mrna-ctl20μl，3min后用滤纸吸走多余样品，然后滴加20μl的2％磷钨酸对吸附样品进行负染，负染色时间为3s，继而用滤纸吸走多余染料，晾干后通过透射电镜(tem)确定s-mrna-ctl的微观形态。由图13可以看出实施例14所制备的脂质体为均匀分散的球形。
[0121]
试验例3细胞摄取实验
[0122]
培养hepg2细胞以5
×
104/ml铺板于6孔板，放入培养箱进行培养36h。吸出原有培养基加入1ml pbs清洗后，加入1ml dapi染色液，分别加入实施例9，实施例10各60μl于细胞培养板中，在42℃水浴环境中温和加热30min后，吸去染色液，每隔5min用1mlpbs清洗一次，洗两次后以pbs溶液利用倒置荧光显微镜观察。由图14可见，实施例9，实施例10在温和加热过程中，可通过膜融合途径进入细胞，表明其具有良好的摄取能力，且二者无显著差异，说
明胆固醇和麦角固醇在细胞摄取过程中具有几乎相同的作用效果。
[0123]
试验例4转染效率实验以细胞密度1
×
105/ml将hek-293细胞铺6孔板，细胞培养箱中培养24h。并将对比例1与egfp mrna混合后与实施例15分别加入细胞培养板中，二者mrna加入量一致，接着孵育24h后通过流式细胞仪测定转染效率。如图15可见实施例15的转染效率高达66.70％，对比例1的转染效率仅为48.30％，证明实施例14具有高的转染效率。
[0124]
试验例5s蛋白表达实验以细胞密度1
×
106/ml将hek-293细胞铺6孔板，细胞培养箱中培养24h。将冷冻干燥后的实施例14、实施例16、实施例17、实施例18、实施例19、实施例20、实施例21和实施例22分别加20μl无核酸酶水复溶后处理细胞，转染4h后更换为含血清的培养基；再培养24h后采用pbs消化细胞并将其转移至离心管离心(2500r/min，5min)，收集细胞，采用1ml pbs吹匀，转移到1.5ml的ep管中，离心(2500r/min，5min)后收集下层沉淀。每个样品加入200μl的蛋白裂解液(每100μl chaps加入1μl protease inhibiter)，冰上裂解1h。提前将离心机4℃预冷，离心(13500r/min，20min)后取上清，将样品分别进行western blot实验以及elisa实验。
[0125]
western blot实验
[0126]
首先将电泳装置检漏(采用水检漏，向其中加满水，若5min内液面不降，则代表装置不漏)，待检漏完成，将水清干净；再将12％的分离胶加入到电泳装置中，加入无水乙醇(用于压气泡)，将其静置30min，分离胶逐渐凝固，将无水乙醇倒掉，并采用滤纸吸掉多余的液体；加入浓缩胶并迅速插入梳子，放置30min，浓缩胶凝固；将此装置放到电泳槽中，加入电泳液(1
×
sds-page缓冲液)没过铂丝，缓慢拔出梳子，分别依次加入5μl marker、20μl实施例14、实施例16、实施例17、实施例18、实施例19、实施例20、实施例21和实施例22；电泳(100v，300ma)，在电泳的过程中观察溴酚蓝以及marker的位置，待其到达凝胶底部后停止；取出电泳后的凝胶，按照浓缩胶和分离胶的分界线处分开，保留分离胶，将分离胶和滤纸浸泡于1
×
bloting buffer，pvdf膜浸泡于无水甲醇中；按照3层滤纸、1层pvdf膜、凝胶、3层滤纸的顺序放在转膜仪上并将气泡赶出，打开电源，300ma恒流下转印1h 40min；将pvdf膜(转有蛋白)浸于含有5％脱脂奶粉的1
×
pbst中，于室温下封闭2h，2h后使用1
×
pbst洗去过量的脱脂奶粉；将pvdf膜放入含有一抗(按照说明书采用5％脱脂奶粉稀释)的15ml离心管中，4℃条件下孵育过夜后，1
×
pbst洗洗去过量一抗；将已经封闭完一抗的pvdf膜放入含有二抗(按照说明书采用5％脱脂奶粉稀释)的15ml离心管中，在室温条件下孵育1h(注意避光)，洗去过量的二抗，采用odyssey红外激光成像系统检测。
[0127]
表4分离胶和浓缩胶的配制
[0128][0129][0130]
elisa实验
[0131]
取适量的校准品将其稀释至50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/
ml依次添加于孵有抗体的elisa板中，再取经处理的细胞样品稀释60倍，将其依次添加于elisa板中，于37℃孵育1h；倒掉上层液体，采用1
×
pbst洗掉多余液体，依次加入100μl一抗，于37℃孵育1h；倒掉上层液体，采用1
×
pbst洗掉多余液体，依次加入100μl酶标抗体，于37℃孵育0.5h；倒掉上层液体，采用1
×
pbst洗掉多余液体，依次加入100μl tmb，于37℃孵育0.25h；取出，迅速加50μl h2so4(2m)，并使用酶标仪进行测量(450nm)测其od值。以校准品的浓度对od值作标准曲线；由样品的od值，可计算出样品的浓度。
[0132]
s蛋白表达量＝样品浓度
×
稀释倍数(60)
×
裂解液体积
[0133]
由样品浓度，可计算出每孔细胞中s-mrna蛋白的表达量。
[0134]
上述实验结果见附图16和附图17。
[0135]
试验例6脂质体毒性实验
[0136]
将对数生长期的hepg2细胞分别以5
×
104cells/ml的密度接种到96孔细胞培养板中，培养24h后加入系列不同体积的空白阳离子脂质体，设置6个复孔。常规条件下孵育48h后，在避光的条件下每孔加20μl mtt(5mg/ml)溶液，避光4h后，吸出孔内培养基加入100μl dmso溶解甲臜晶体，使用酶标仪在492nm和630nm处测吸光度。继而分别以对比例1、实施例1、实施例5用相同剂量进行细胞毒性mtt实验，结果见附图18。可以明显看出实施例1与实施例5均比对比例1的细胞存活率高，证明其毒性较小。
[0137]
试验例7冷冻干燥工艺研究
[0138]
取实施例14100μl共27份，加入质量分数为1％、5％、10％的冻干保护剂(甘露醇、海藻糖和蔗糖)，三次平行，于-70℃预冻4h，24h冷冻干燥+解吸干燥，复水后测粒径和pdi。结果见表5.
[0139]
表5初筛冻干保护剂的结果
[0140][0141]
将冻干保护剂在初次筛选的基础上细分，为1％海藻糖、3％海藻糖、5％海藻糖以及1％的蔗糖，分别加鱼精蛋白以及不加鱼精蛋白进行对比筛选最佳的冻干保护剂。将s-mrna与鱼精蛋白的以质量比为5∶1混合静置20min，加入实施例1，再依次加入冻干保护剂，于-70℃预冻4h，于冷冻干燥机中冻干24h，采用粒度仪测其粒径、pdi以及电位，结果见表6。由表6可知，加入鱼精蛋白的粒径明显比不加鱼精蛋白的粒径偏小，故鱼精蛋白在一定程度上可以浓缩s-mrna的链长，进而减小粒径；加入鱼精蛋白时，冻干保护剂为5％的海藻糖时，实施例14粒径最小，为158.3
±
1.6nm，pdi为0.168
±
0.004＜0.3，分布均匀，电位为49.9
±
2.3mv，结果理想。
[0142]
表6再次筛选冻干保护剂的结果
[0143][0144]
试验例8稳定性研究
[0145]
将实施例14、实施例16、实施例17和实施例18置于4℃储存6个月，采用凝胶阻滞实验测稳定性。将两份相同的实施例14、实施例16、实施例17和实施例18(2μg)分别溶于40μl无核酸酶水中，一份加入2μl 1％triton x-100溶液(破膜，使包载的s-mrna完全释放)加到上样孔，一份复溶后直接加到上样孔，以s-mrna作空白对照，进行电泳(100ma，220v)，20min后凝胶成像系统拍照并分析，结果见附图19。可见冷冻干燥去除水分，有效降低了mrna水解反应的发生，显著提高稳定性。
[0146]
试验例9体内免疫效果
[0147]
为评价冷冻干燥后的实施例14、实施例16、实施例17、实施例18、实施例19、实施例20、实施例21和实施例22对wuhan-hu-1isolat和501y.v2的体内免疫功能，取6～8周龄balb/c雌性小鼠肌肉注射，生理盐水为对照，每组6只(n＝36)。分别于第0天和第14天免疫接种，第14天和第28天采血检测新型sars-cov-2s蛋白igg。采集血样，8000rpm，4℃离心6min，分离上清液，加匀，-20℃冷冻，避免反复冻融。采用elisa法测定血清中s蛋白igg，首先采用96孔elisa板在4℃过夜，用s蛋白(1μg/ml)包被，并用4％的牛血清白蛋白阻断。将血清倍数稀释后加入每孔，用山羊抗小鼠igg-hrp孵育平板，每孔加入100μltmb培养。实验结果见附图20和附图21。
[0148]
综上所述，本发明制备的一种含有细胞穿透肽的阳离子热敏脂质体，可用于递送核酸，转染效率高，稳定性良好，且毒副作用低。