基因药物或基因疫苗纳米递送系统和应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及基因药物或基因疫苗纳米递送系统和应用。


背景技术：

2.疫苗是疾病治疗中最早的治疗干预，大大降低了一些传染疾病的致死率，同时也用于预防或治疗恶性肿瘤、微生物感染和神经系统疾病等。继减毒活疫苗、灭活疫苗、蛋白结合疫苗后，基因疫苗作为第四代疫苗，不仅可以激活包括体内特异性ctl细胞免疫、辅助性t细胞(th，包括巨噬细胞、树突状细胞和b细胞)免疫、体液免疫等，大大降低了疫苗逆转为致病性疫苗的内在风险，并且提高了疫苗的体内吸收及干预作用，另外，基因疫苗具有生产成本低、纯化工艺易于操作等特点，为工业化生产提供了可能。因此，近年来与基因疫苗相关的研究受到了广泛关注。但是基因疫苗(dna/rna/pdna/sirna/mrna，rna最为常用)常由于自身稳定性不佳与特异性问题，靶向递送困难重重。基因递送系统大致分为病毒性载体和非病毒性载体，其中，病毒性载体能够有效侵入细胞提供治疗所需的操纵基因。然而，其成本较高，并且存在致癌性、免疫原性以及细胞病理改变等安全性问题。另外，强制进入(如电穿孔、水动力注入等)操作困难也为其应用带来了不便。非病毒性载体，如阳离子脂质、阳离子聚合物、阳离子多糖等，由于自身无免疫原性的特点，逐渐进入研究者视野。该类载体主要包含将抗原暴露于载体表面模仿病毒本身或采用载体包裹抗原两种类型，其中后者在目前研究中更为常用。聚乙烯亚胺(pei)常作为黄金标准载体进行非病毒性载体研究，但由于其电荷密度过大，存在转染活性与毒性之间的相互制约关系，会导致细胞毒性增强，无吸附特异性，且易与红细胞作用引起溶血等现象，表现出较差的生物相容性，而聚酰胺-胺树状大分子以及阳离子表活也具有同样问题。聚氨基酸虽生物相容性较好，但转染效率低，本身稳定性不佳。磷酸钙虽具有较高的细胞转染效率及溶酶体逃逸能力，但其转染细胞的过程对温度、ph和缓冲盐浓度的变化十分敏感，所实现的转染可重复性差，尤其是细胞毒性较大，实用性与安全性都无法很好满足。针对某些阳离子载体的毒性问题，常对其进行改性修饰，但反应过程复杂且可重复性差，使修饰过程中不可避免地会消耗聚阳离子上的氨基等活性基团，导致其转染能力下降。因此，如何通过改性安全有效地提高聚阳离子基因载体的转染效率并降低其细胞毒性是目前亟待解决的问题。由于疫苗给药剂量较小且血液环境复杂，给药方式通常为肌注，较静注更为严格，需设计开发出一种安全且有效的基因疫苗靶向纳米递送载体，该载体应具备以下特点：(1)良好的生物相容性、生物可降解性且无免疫原性；(2)保护基因不被降解；(3)具备一定靶向性；(4)具备较好的基因压缩能力，利于装载基因，具备较高转染效率，最好具有溶酶体免疫逃逸能力，即敏感的“质子海绵效应”；(5)具备一定的稳定性，利于储存。
3.富含(寡聚)氨基酸的细胞穿膜肽应用十分广泛，目前，许多课题组已经尝试将富含氨基酸的细胞穿膜肽应用于转基因中，以提高非病毒载体的转染效率。然而，这类载体也存在吸附以及低内涵体/溶酶体逃逸等问题。聚阴离子包覆技术可以有效地降低血液循环
过程中的血清吸附，提高基因复合物在血清中的稳定性，延长血液循环时间。但该技术依旧不能在此基础上同时实现增强内涵体/溶酶体逃逸的功能，且缺少靶向性。因此，同时也亟需制备一种工艺简单、经济成本低，且具备高转染效率及低毒性的基因疫苗纳米递送系统，以实现基因药物的靶向递送。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种基因药物或基因疫苗纳米递送系统和应用。本发明的技术方案为：
5.第一方面，本发明提供一种基因药物或基因疫苗纳米递送系统的制备方法，是通过二茂铁羧酸或其衍生物对寡聚氨基酸进行结构修饰，结构修饰后的中间体与基因药物混匀孵化后，加入阴离子生物活性多糖进一步反应形成包覆外壳，即得。
6.进一步地，所述制备方法具体包括：
7.步骤1，当采用二茂铁羧酸与寡聚氨基酸反应，将二茂铁羧酸加入羧基活化剂活化，然后再将活化后的产物和寡聚氨基酸混合反应，反应产物经纯化并干燥，得到结构修饰的寡聚氨基酸中间体；
8.当采用二茂铁羧酸衍生物与寡聚氨基酸反应，将寡聚氨基酸配制成溶液后加入羧基活化剂活化，而后与二茂铁羧酸衍生物反应，反应产物经纯化并干燥，得到结构修饰的寡聚氨基酸中间体；
9.步骤2，将阴离子生物活性多糖配制成溶液后加入羧基活化剂使其部分羧基活化；
10.步骤3，将结构修饰的寡聚氨基酸中间体分散在溶剂中，加入基因药物混合均匀，于室温孵化；
11.步骤4，将步骤3的混合液和步骤2的溶液混合，于室温孵化，即得。
12.进一步地，所述寡聚氨基酸为寡聚精氨酸和/或寡聚赖氨酸。
13.优选地，所述寡聚氨基酸为含有2-16个精氨酸单元的寡聚精氨酸。
14.进一步地，所述阴离子生物活性多糖为透明质酸、葡聚糖、甘露糖、葡糖氨基葡聚糖中的一种。
15.优选地，所述阴离子生物活性多糖为分子量3k-1500k的透明质酸。
16.进一步地，所述基因药物是dna、rna、pdna、sirna、mirna中的一种或多种。
17.进一步地，所述二茂铁羧酸衍生物为二茂铁酰基二胺化合物。
18.进一步地，所述二茂铁酰基二胺化合物的制备方法包括：将二茂铁羧酸于40～100℃条件下进行部分氧化，氧化后混悬于二氯甲烷与甲醇的混合溶液中，加入草酰氯使其酰氯化，再加入到二胺化合物的二氯甲烷溶液中，胺化反应过夜，反应完成后采用碱的水溶液萃取，取有机层进行分离纯化，即得。
19.进一步地，所述二茂铁羧酸选自二茂铁甲酸、二茂铁乙酸、二茂铁丙酸、二茂铁丁酸、二茂铁戊酸中的一种。
20.优选地，所述二茂铁羧酸选自二茂铁甲酸或二茂铁乙酸。
21.进一步地，所述二胺化合物选自c2～c18的脂肪链端基二胺中的一种或多种。
22.优选地，所述二胺化合物选自乙二胺、1,4-丁二胺或1,18-十八二胺。
23.进一步地，所述羧基活化剂为二环己基碳二亚胺(dcc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、
4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)中的一种或几种。
24.进一步地，所述步骤1中，羧基活化剂的加入量为寡聚氨基酸或二茂铁羧酸的0.5n-1.2n，寡聚氨基酸或二茂铁羧酸的羧基活化时间为10min-2h。
25.进一步地，所述步骤1中，寡聚氨基酸与二茂铁羧酸或其衍生物的反应时间为5h-36h，反应温度为4℃-35℃，反应体系ph值为6.5-9，二茂铁羧酸或其衍生物与寡聚氨基酸反应摩尔比为0.5～1.25:1。
26.优选地，所述步骤1中，干燥方式为冷冻干燥，控制参数为：于温度为-80℃～-20℃预冻2-8h，然后保温冷冻干燥12-48h。
27.进一步地，所述步骤2中，羧基活化剂的加入量为透明质酸的0.2-0.8n，活化时间为10min～1h。
28.进一步地，所述步骤3中，分散结构修饰的寡聚氨基酸中间体的溶剂为ph7.4的无酶pbs溶液，该中间体与基因药物的质量比为(0.5-10):1。
29.进一步地，所述步骤4中将步骤3的混合液和步骤2的溶液混合，其中寡聚氨基酸结构修饰的中间体与多糖质量比为6:(1-6)。
30.第二方面，本发明提供一种基因药物或基因疫苗纳米递送系统，该系统为核壳结构，其中二茂铁羧酸或其衍生物修饰的寡聚氨基酸压缩基因药物形成所述核壳结构的内核，阴离子生物活性多糖包覆于所述内核表面形成外壳。
31.进一步地，所述纳米递送系统的粒径为50-200nm。
32.第三方面，本发明提供上述基因药物或基因疫苗纳米递送系统的使用方法，包括采用肌注方式注射基因药物或基因疫苗。
33.第四方面，本发明提供上述基因药物或基因疫苗纳米递送系统在体内外细胞的基因转染以及人或动物体内基因药物或基因疫苗输送上的用途。
34.本发明开发了一种全新的基因药物或基因疫苗纳米递送系统，该递送系统通过二茂铁羧酸或其衍生物对寡聚氨基酸进行结构修饰形成基础纳米粒，有利于包覆基因药物形成内核，将阴离子生物活性多糖修饰于内核外部，使其作为靶头，构建壳核结构的纳米递送系统。将该纳米递送系统用于肌肉注射基因药物，一方面寡聚氨基酸的结构修饰使得其细胞毒性大大降低，提高转染效率及靶向性，加速“质子海绵效应”即内涵体/溶酶体逃逸，提高了纳米粒的稳定性；另一方面，该系统具有体内双靶向性，毒性也大大降低，并提高了细胞摄取和转染效率。此外，本发明的纳米递送系统制备过程简单、绿色环保，经济成本低，具有广阔的应用前景。
附图说明
35.图1为本发明实施例1步骤一提供的二茂铁衍生胺器壁表面结晶图及其核磁共振氢谱图，其中图a)为二茂铁衍生胺器壁表面结晶图，图b)为二茂铁衍生胺核磁共振氢谱图。
36.图2为本发明实施例1步骤二提供的二茂铁衍生物修饰的寡聚精氨酸纳米载体的tem图。
37.图3为本发明实施例1步骤三提供的该纳米递送系统的tem图。
38.图4为本发明实施例6中基因递送系统细胞毒性测试结果图。
39.图5为本发明实施例7中zeta电位变化监测弱酸及h2o2诱导递送系统解组装行为的实验结果图。
40.图6为本发明实施例8中该纳米递送系统的细胞内吞摄取显微镜图。
41.图7为本发明实施例9中elasa测定蛋白表达图。
42.图8为本发明实施例9中实时荧光定量pcr试验图，其中图1)为1h、48h淋巴结荧光蓄积情况，图2)中左侧为非注射侧腹股沟浅淋巴结的荧光图，右侧为注射侧腹股沟浅淋巴结的荧光图。
43.图9为本发明实施例10中c57小鼠大腿肌肉注射荧光标记的载药纳米粒即icg-hf-arg@mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')，小鼠大腿的荧光变化图像。
44.图10为本发明实施例11中c57小鼠大腿肌肉注射荧光标记的载药纳米粒1h、48h浅腹股沟淋巴结荧光蓄积对比图像。
具体实施方式
45.在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
46.本发明的新型基因疫苗纳米递送系统为壳核结构，其中，内核采用二茂铁羧酸或其衍生物对寡聚氨基酸进行疏水改性形成纳米粒装载基因，常有的改性势必会消耗活性氨基而导致转染效率的降低，而二茂铁羧酸或其衍生物的加入不仅不会降低转染效率，反而有增无减：二茂铁(本身为fe
2+
，在酸性或弱酸性条件下易被氧化为fe
3+
，又可轻易被谷胱甘肽还原为fe
2+
)中部分氧化的fe
3+
提供的正电荷可与带负电荷的基因药物发生静电作用、两个可以自由旋转的环戊二烯环可与基因药物的碱基产生疏水、堆积作用而发生沟面结合即引入多重作用，其所独具的优良的电荷传导能力也能进一步增强寡聚氨基酸的基因装载及压缩能力。同时，二茂铁作为非结合铁与血清转铁蛋白(tf)两个高亲和位点结合进行转运。细胞铁摄取涉及载铁的tf与细胞膜上转铁蛋白受体1(tfr1)，tf与tfr1结合介导细胞内吞作用，以此增强了寡聚氨基酸的细胞内吞作用。除此之外，茂环独特的骨架支撑使得该纳米载体具备优良的空间结构，更容易捕获质子，引起cl-与h2o内流至溶酶体，使其快速肿胀破裂，释放内吞的基因药物，减少内涵体/溶酶体中基因药物的酶解。与此同时，在该环境二茂铁中更多的fe
2+
可被氧化为fe
3+
，亲水性变强，形似弹簧触发装置逐步释放包载的基因药物。改性工艺简单，将在一定程度上提高细胞的内吞能力，有望解决寡聚氨基酸改性后转染能力下降及内涵体/溶酶体逃逸功能受限的问题。
47.同时，外部壳通过阴离子活性多糖的修饰，并且阴离子生物活性多糖通过共价键、氢键作用、静电作用包覆于内核表面，可进一步保护基因药物并减少泄露，同时加长体内循环时间，提供靶向细胞的靶头。除此之外，活性多糖因其柔性基团使得纳米载体更易穿过细胞膜；与此同时在血液循环中，其所含的阴离子基团可有效隐藏其内核所带的正电荷，减少该纳米载体与红细胞或血浆蛋白的结合，降低该系统的细胞毒性。
48.该基因药物或基因疫苗纳米递送系统的制备方法，是通过二茂铁羧酸或其衍生物对寡聚氨基酸进行结构修饰，结构修饰后的中间体与基因药物混匀孵化后，加入阴离子生物活性多糖进一步反应形成包覆外壳，即得。
49.在本发明的实施例中，所述制备方法具体包括：
50.步骤1，当采用二茂铁羧酸与寡聚氨基酸反应，将二茂铁羧酸加入羧基活化剂活化，然后再将活化后的产物和寡聚氨基酸混合反应，装入相应大小的透析袋中，透析液为纯水，进行纯化后干燥，得到结构修饰的寡聚氨基酸中间体；
51.当采用二茂铁羧酸衍生物与寡聚氨基酸反应，将寡聚氨基酸溶于tris溶液中，加入羧基活化剂活化，而后与二茂铁羧酸衍生物反应，反应产物经制备液相进行纯化并干燥，得到结构修饰的寡聚氨基酸中间体；
52.步骤2，将阴离子生物活性多糖溶于ph6.5-9的pbs溶液中，加入羧基活化剂使其部分羧基活化；即使得多糖大分子中少部分羧基得到活化，即末端的-cooh易于与寡聚氨基酸中残余的胺基发生反应；
53.步骤3，将结构修饰的寡聚氨基酸中间体分散在ph7.4的无酶pbs溶液中，加入基因药物混合均匀，涡旋1-5min并于室温孵化20min-2h；
54.步骤4，将步骤3的混合液和步骤2的溶液混合，形成粒径为50-200nm的纳米递送系统。
55.在本发明的一些实施例中，所述寡聚氨基酸为寡聚精氨酸和/或寡聚赖氨酸。
56.在本发明的优选实施例中，所述寡聚氨基酸为含有2-16个精氨酸单元的寡聚精氨酸。更加优选地为寡聚精氨酸是含有4-10个精氨酸单元的寡聚精氨酸。
57.在本发明的一些实施例中，所述阴离子生物活性多糖为透明质酸、葡聚糖、甘露糖、葡糖氨基葡聚糖中的一种。
58.在本发明的优选实施例中，所述阴离子生物活性多糖为分子量3k-1500k的透明质酸。更加优选地，所述透明质酸的分子量为10k-300k。
59.在本发明的一些实施例中，所述基因药物或基因疫苗是dna如asct2基因(5'-aaatatcttcccttccaacctggtgtcagcagcctttcgctca-3')、rna如anti-asct2(5'-uuuauagaagggaagguuggaccacagagucgucggaaagcgagu-3')、pdna、sirna如asns(nm_001673)、mirna如mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')中的一种或多种。
60.在本发明的一些实施例中，所述二茂铁羧酸衍生物为二茂铁酰基二胺化合物。其中，二茂铁酰基二胺化合物的制备方法包括：将二茂铁羧酸于40～100℃条件下进行部分氧化，大约发生5～80％的氧化，氧化后混悬于二氯甲烷与甲醇的混合溶液中，二氯甲烷与甲醇的体积比为5～10:1，加入适量dmf，并加入草酰氯的二氯甲烷溶液，在4-30℃搅拌30min-5h，使其酰氯化，再加入到二胺化合物的二氯甲烷溶液中，胺化反应12～30h，反应完成后采用碱的水溶液萃取，取有机层浓缩后进行柱层析分离纯化，干燥得到黄色晶体即为二茂铁酰基二胺化合物。
61.在本发明的一些实施例中，所述二茂铁羧酸选自二茂铁甲酸、二茂铁乙酸、二茂铁丙酸、二茂铁丁酸、二茂铁戊酸中的一种。
62.在本发明的优选实施例中，所述二茂铁羧酸选自二茂铁甲酸或二茂铁乙酸。
63.在本发明的一些实施例中，所述二胺化合物选自c2～c18的脂肪链端基二胺中的一种或多种。
64.在本发明的优选实施例中，所述二胺化合物选自乙二胺、1,4-丁二胺或1,18-十八二胺。
65.在本发明的一些实施例中，所述羧基活化剂为二环己基碳二亚胺(dcc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)中的一种或几种。
66.在本发明的一些实施例中，所述步骤1中，羧基活化剂的加入量为寡聚氨基酸或二茂铁羧酸的0.5n-1.2n，寡聚氨基酸或二茂铁羧酸的羧基活化时间为10min-2h。
67.在本发明的一些实施例中，所述步骤1中，寡聚氨基酸与二茂铁羧酸或其衍生物的反应时间为5h-36h，反应温度为4℃-35℃，反应体系ph值为6.5-9，二茂铁羧酸或其衍生物与寡聚氨基酸反应摩尔比为0.5～1.25:1。
68.在本发明的优选实施例中，所述步骤1中，干燥方式为冷冻干燥，控制参数为：于温度为-80℃～-20℃预冻2-8h，然后保温冷冻干燥12-48h。复溶后通过透射电镜可见规则形状物质，粒径约为30nm-100nm。
69.在本发明的一些实施例中，所述步骤2中，羧基活化剂的加入量为透明质酸的0.2-0.8n，活化时间为10min～1h。
70.在本发明的一些实施例中，所述步骤3中，分散结构修饰的寡聚氨基酸中间体的溶剂为ph7.4的无酶pbs溶液，该中间体与基因药物的质量比为(0.5-10):1。
71.在本发明的一些实施例中，所述步骤4中将步骤3的混合液和步骤2的溶液混合，其中寡聚氨基酸结构修饰的中间体与多糖质量比为6:(1-6)。
72.本发明制备的多糖修饰的核壳式基因疫苗纳米递送系统用于体内外细胞的基因转染以及人或动物体内基因药物输送的用途，其中所述基因是dna、rna、pdna、sirna、mirna中的任一种或多种。dna如asct2基因：5'-aaatatcttcccttccaacctggtgtcagcagcctttcgctca-3'；rna如anti-asct2：5'-uuuauagaagggaagguuggaccacagagucgucggaaagcgagu-3'；sirna如asns：nm_001673；mirna如mirna-8485：5'-cacacacacacacacacguau-3'。
73.此外，该基因疫苗纳米递送系统用于肌肉注射基因药物，降低纳米载体毒性的同时，进一步提高载体靶向能力。
74.以下通过实施例的具体实施方式对本发明的上述内容作进一步的详细说明。
75.实施例1
76.本实施例提供一种多糖修饰的核壳式基因疫苗纳米递送系统，按照以下步骤制备的：
77.步骤一：二茂铁甲酸与乙二胺反应制备二茂铁衍生胺：将1.0g二茂铁甲酸置于烘箱中60℃，8h，后混悬于60ml二氯甲烷与甲醇的混悬溶液中，其中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1，加入0.2mol/l的草酰氯的二氯甲烷溶液10ml，在4℃搅拌3h，使其酰氯化，将所得溶液加入乙二胺(3ml)的二氯甲烷溶液(30ml)中反应24h，后采用10％氢氧化钠的水溶液进行萃取，取有机层，旋干后采用v
甲醇
:v
二氯甲烷
＝1:1进行柱层析分离，取第一个物质。干燥即为二茂铁甲酰乙二胺。
78.步骤二：二茂铁衍生物修饰的寡聚精氨酸纳米载体的制备：将95.4mg(0.1mmol)寡聚精氨酸(n＝6)溶于tris溶液中，加入12.4mg(0.06mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)、6.9mg(0.06mmol)n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)作为羧基活化剂活化，与步骤一所得的二茂铁衍生胺(0.028g)反应，采用纯水进行透析(透析袋为1kda)纯化，得到二茂铁衍生物修饰的寡聚精氨酸纳米载体；
79.上述，羧基活化时间为2h，反应时间为24h，反应温度为25℃，羧基活化剂的加入量为0.6n，二茂铁衍生胺与寡聚精氨酸的反应摩尔比为1:1，反应ph值为7.4。预冻时间为8h，温度为-40℃，冷冻干燥时间为40h。得到二茂铁衍生胺修饰的寡聚精氨酸。
80.步骤三：透明质酸修饰的寡聚精氨酸/二茂铁衍生物核壳式基因疫苗纳米递送系统：将透明质酸(分子量为50k)200mg溶于20mlph7.4的pbs溶液中，加入少量4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)80mg，为溶液a，反应20min。将步骤二制备的寡聚精氨酸/二茂铁衍生物冻干粉均匀分散在10ml的ph为7.4的无酶pbs(0.1mol/l)溶液，得到溶液b；再向适量b溶液中加入mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')，寡聚精氨酸/二茂铁衍生物与基因药物的质量比为4:1，涡旋1min，室温孵化1h，为溶液c，即为载有基因的内核纳米粒，将溶液a加入溶液c，寡聚精氨酸/二茂铁衍生物与透明质酸的质量比为1:0.8，涡旋1min并室温孵化1h，获得一种基因药物或基因疫苗纳米递送系统。
81.其中透明质酸大分子通过酰胺键与氢键等作用将内核包裹。采用无酶超纯水透析28h(透析袋大小为8k-14kda)除去未包裹的基因药物与杂质等，所得纳米粒的粒径为120nm左右。
82.结论：图1提供了本实施例的二茂铁衍生胺的形貌图及其核磁共振氢谱图，从形貌图可见规则结晶，可见纯度较高，通过核磁共振氢谱图可知谱图结构与目标化合物谱图对应，可见合成成功；图2提供了本实施例步骤二获得的二茂铁衍生物修饰的寡聚精氨酸纳米载体的tem图，载体较为均匀，但自身未形成纳米粒结构；图3提供了本实施例步骤二获得的基因药物或基因疫苗纳米递送系统的tem图，显示为清晰的核壳结构。
83.实施例2
84.本实施例提供一种多糖修饰的核壳式基因疫苗纳米递送系统，按照以下步骤制备的：
85.步骤一：二茂铁乙酸与丁二胺反应制备二茂铁衍生胺：将1.0g二茂铁乙酸置于烘箱中50℃加热氧化5h，后混悬于60ml二氯甲烷与甲醇的混悬溶液中，其中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1，加入0.5mldmf催化后，加入0.2mol/l的草酰氯的二氯甲烷溶液10ml，在20℃搅拌4h，使其酰氯化，将所得溶液加入1,4-丁二胺(3ml)的二氯甲烷溶液(30ml)中反应12h，后采用5％氢氧化钠的水溶液进行萃取，取有机层，旋干后采用v
甲醇
:v
二氯甲烷
:v
乙酸乙酯
＝1:2:1进行柱层析分离，取第一个物质。干燥即为二茂铁乙酰丁二胺。
86.步骤二：二茂铁衍生物修饰的寡聚精氨酸纳米载体的制备：将158mg(0.1mmol)寡聚精氨酸(n＝10)溶于tris溶液中，加入20.6mg(0.1mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)、11.5mg(0.1mmol)n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)作为羧基活化剂活化，与步骤一所得的二茂铁衍生胺(0.032g)反应，采用纯水进行透析(透析袋为1kda)纯化，得到二茂铁衍生物修饰的寡聚精氨酸纳米载体；
87.上述，羧基活化时间为2h，反应时间为24h，反应温度为25℃，羧基活化剂的加入量为1n，二茂铁衍生胺与寡聚精氨酸的反应摩尔比为1:1，反应ph值为7.4。预冻时间为8h，温度为-40℃，冷冻干燥时间为34h。得到二茂铁衍生胺修饰的寡聚精氨酸。
88.步骤三：透明质酸修饰的寡聚精氨酸/二茂铁衍生物核壳式基因疫苗纳米递送系统：将透明质酸(分子量为50k)200mg溶于20mlph7.4的pbs溶液中，加入少量4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)40mg，为溶液a，反应20min。将步骤二制备的寡聚
精氨酸/二茂铁衍生物冻干粉均匀分散在10ml的ph为7.4的pbs(0.1mol/l)溶液，得到溶液b；再向b溶液中加入mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')，寡聚精氨酸/二茂铁衍生物与基因药物的质量比为10:3，涡旋2min，室温孵化1h，为溶液c，即为载有基因的内核纳米粒，将溶液a加入溶液c，寡聚精氨酸/二茂铁衍生物与透明质酸的质量比为1:1，涡旋2min并室温孵化1h，获得一种基因药物或基因疫苗纳米递送系统。
89.其中透明质酸大分子通过酰胺键与氢键等作用将内核包裹。采用无酶超纯水透析28h(透析袋大小为8k-14kda)除去未包裹的基因药物与杂质等，所得纳米粒的粒径为130nm左右。
90.实施例3
91.本实施例提供一种多糖修饰的核壳式基因疫苗纳米递送系统，按照以下步骤制备的：
92.步骤一：二茂铁甲酸与丁二胺反应制备二茂铁衍生胺：将1.0g二茂铁甲酸置于烘箱中80℃，10h，后混悬于60ml二氯甲烷与甲醇的混悬溶液中，其中二氯甲烷与甲醇的体积比为5:1，加入0.5mldmf催化后，加入1mol/l的草酰氯的二氯甲烷溶液5ml，在4℃搅拌4h，使其酰氯化，将所得溶液加入丁二胺(3ml)的二氯甲烷溶液(30ml)中反应30h，后采用10％氢氧化钠的水溶液进行萃取，取有机层，旋干后采用v
甲醇
:v
二氯甲烷
＝2:1进行柱层析分离，取第一个物质。干燥即为二茂铁甲酰丁二胺。
93.步骤二：二茂铁衍生物修饰的寡聚精氨酸纳米载体的制备：将127mg(0.1mmol)寡聚精氨酸(n＝8)溶于tris溶液中，加入16.5mg(0.08mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)、9.2mg(0.08mmol)n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)作为羧基活化剂活化，与步骤一所得的二茂铁衍生胺(0.030g)反应，经过制备液相进行纯化，得到二茂铁衍生物修饰的寡聚精氨酸纳米载体；
94.上述，羧基活化时间为0.5h，反应时间为30h，反应温度为25℃，羧基活化剂的加入量为0.8n，二茂铁衍生胺或二茂铁羧酸与寡聚精氨酸的反应摩尔比为1:1，反应ph值为6.5。预冻时间为8h，温度为-20℃，冷冻干燥时间为40h。得到二茂铁衍生胺修饰的寡聚精氨酸。
95.步骤三：透明质酸修饰的寡聚精氨酸/二茂铁衍生物核壳式基因疫苗纳米递送系统：将透明质酸(分子量为90k)200mg溶于20mlph7.4的pbs溶液中，加入少量4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)80mg，为溶液a，反应20min。将步骤二制备的寡聚精氨酸/二茂铁衍生物粉末均匀分散在10ml的ph为6.5的pbs(0.1mol/l)溶液，得到溶液b；再向b溶液中加入mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')，寡聚精氨酸/二茂铁衍生物与基因药物的质量比为8:1，涡旋3min，室温孵化1h，为溶液c，得到载有基因的纳米递送系统，将溶液a加入溶液c，寡聚精氨酸/二茂铁衍生物与透明质酸的质量比为1:0.8，涡旋3min并室温孵化1h，获得一种基因药物或基因疫苗纳米递送系统。
96.其中透明质酸大分子通过酰胺键与氢键等作用将内核包裹。采用纯水透析28h除去未包裹的基因药物等，所得纳米粒的粒径为165nm左右。
97.实施例4
98.本实施例提供一种多糖修饰的核壳式基因疫苗纳米递送系统，按照以下步骤制备的：
99.步骤一：二茂铁羧酸修饰的寡聚精氨酸纳米载体的制备：将24.4mg(0.1mmol)二茂铁乙酸分散于40mlph为7.4的缓冲溶液及dmf混合溶液中(体积比为1:1)，加入16.5mg
(0.08mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)、9.2mg(0.08mmol)n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化0.5h，将156mg(0.1mmol)寡聚赖氨酸(n＝12)加入其中，反应25h，反应温度为25℃，羧基活化剂的加入量为0.8n，二茂铁羧酸与寡聚赖氨酸的反应摩尔比为1:1，反应ph值为7.4。得到的反应溶液采用纯水进行透析(透析袋为1kda)纯化，后进行冷冻干燥，预冻时间为8h，温度为-80℃，冷冻干燥时间为40h，即得到二茂铁乙酸修饰的寡聚赖氨酸载体。
100.步骤二：羧甲基葡聚糖修饰的寡聚赖氨酸/二茂铁衍生物核壳式基因疫苗纳米递送系统：将羧甲基葡聚糖(分子量为70k，羧基取代度为20％)200mg溶于20mlph7.4的pbs溶液中，加入少量4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)80mg，为溶液a，活化20min。将步骤一制备的寡聚赖氨酸/二茂铁衍生物冻干粉均匀分散在10ml的ph为7.0的pbs(0.1mol/l)溶液，得到溶液b；将mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')加入适量溶液b，载体与基因药物的质量比为8:1，涡旋3min，室温孵化2h，为溶液c，即为载有基因的内核纳米粒，将溶液a加入溶液c，寡聚精氨酸与透明质酸的质量比为1:0.8，获得一种基因药物或基因疫苗纳米递送系统。
101.其中透明质酸大分子通过酰胺键与氢键等作用将内核包裹。采用无酶超纯水透析28h除去未包裹的基因药物及杂志等，所得纳米粒的粒径为180nm左右。
102.实施例5
103.本实施例提供一种多糖修饰的核壳式基因疫苗纳米递送系统，按照以下步骤制备的：
104.步骤一：二茂铁乙酸与1,18-十八二胺反应制备二茂铁衍生胺：将1.0g二茂铁乙酸置于烘箱中50℃加热氧化5h，后混悬于60ml二氯甲烷与甲醇的混悬溶液中，其中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1，加入0.5mldmf催化后，加入0.2mol/l的草酰氯的二氯甲烷溶液10ml，在20℃搅拌4h，使其酰氯化，将所得溶液加入1,18-十八二胺(3ml)的二氯甲烷溶液(30ml)中反应12h，后采用5％氢氧化钠的水溶液进行萃取，取有机层，旋干后采用v
甲醇
:v
二氯甲烷
:v
乙酸乙酯
＝1:2:1进行柱层析分离，取第一个物质。干燥即为二茂铁乙酰十八二胺。
105.步骤二：二茂铁衍生物修饰的寡聚精氨酸纳米载体的制备：将158mg(0.1mmol)寡聚精氨酸(n＝10)溶于tris溶液中，加入20.6mg(0.1mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)、11.5mg(0.1mmol)n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)作为羧基活化剂活化，与步骤一所得的二茂铁衍生胺(0.051g)反应，采用纯水进行透析(透析袋为1kda)纯化，得到二茂铁衍生物修饰的寡聚精氨酸纳米载体；
106.上述，羧基活化时间为2h，反应时间为24h，反应温度为25℃，羧基活化剂的加入量为1n，二茂铁衍生胺与寡聚精氨酸的反应摩尔比为1:1，反应ph值为7.4。预冻时间为8h，温度为-40℃，冷冻干燥时间为34h。得到二茂铁衍生胺修饰的寡聚精氨酸。
107.步骤三：透明质酸修饰的寡聚精氨酸/二茂铁衍生物核壳式基因疫苗纳米递送系统：将透明质酸(分子量为50k)200mg溶于20mlph7.4的pbs溶液中，加入少量4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)40mg，为溶液a，反应20min。将步骤二制备的寡聚精氨酸/二茂铁衍生物冻干粉均匀分散在10ml的ph为7.4的pbs(0.1mol/l)溶液，得到溶液b；再向b溶液中加入mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')，寡聚精氨酸/二茂铁衍生物与基因药物的质量比为10:3，涡旋2min，室温孵化1h，为溶液c，即为载有基因的内核纳米粒，将溶液a加入溶液c，寡聚精氨酸/二茂铁衍生物与透明质酸的质量比为1:1，涡旋2min
并室温孵化1h，获得一种基因药物或基因疫苗纳米递送系统。
108.其中透明质酸大分子通过酰胺键与氢键等作用将内核包裹。采用无酶超纯水透析28h(透析袋大小为8k-14kda)除去未包裹的基因药物与杂质等，所得纳米粒的粒径为130nm左右。
109.此外，本发明具体实施例还可以采用二茂铁丙酸、二茂铁丁酸、二茂铁戊酸，以及其它脂肪链端基二胺制备二茂铁酰基二胺化合物。所获得的二茂铁酰基二胺化合物与活化的寡聚精氨酸或寡聚赖氨酸反应获得结构修饰的寡聚氨基酸中间体，该中间体和其它类型的基因药物混合后，再和透明质酸、葡聚糖、甘露糖或者葡糖氨基葡聚糖混合，即得。具体制备方法和以上4个实施例相同，这里只列举了4个优选案例进行详细说明。
110.实施例6
111.细胞毒性实验
112.按照实施例1的方法制备基因药物或基因疫苗纳米递送系统，但将其中的基因药物换为带负电荷的吲哚菁绿近红外染料。
113.将b16细胞以1
×
104/孔接种到96孔板进行细胞铺板，于37℃二氧化碳培养箱中孵育24h。进行给药，吸走培养基，加入完全培养基溶解的不同浓度的未修饰多糖的寡聚氨基酸/二茂铁载基因纳米粒(fc-arg@icg)(即，按照实施例1中步骤二制备的二茂铁衍生物修饰的寡聚精氨酸纳米载体)以及基因药物或基因疫苗纳米递送系统(hf-arg@icg)(即按照实施例1中步骤三制备的多糖修饰寡聚氨基酸/二茂铁载基因纳米粒)，震荡混匀，培养12h，吸走含有材料的培养基，并用pbs洗涤细胞，快速吸出所有pbs，向每个孔中加入100μl含有0.5mg/ml cck8的无血清培养基，继续培养1-3h，待cck-8由粉色变为橙色即可。酶标仪测试波长450nm处的光密度(od)值。可通过下面公式计算相对细胞活性值：
114.相对细胞活性(％)＝【od
450nm
(实验)/od
450nm
(对照)】
×
100％
115.实验结果表明：在实验浓度范围内，修饰前的内核纳米粒与修饰后的壳核式纳米粒组，相对细胞活性值均高于80％，修饰阴离子多糖后的壳核式纳米粒细胞活性更好，说明该寡聚氨基酸/二茂铁载体生物相容性良好，且阴离子多糖的外部修饰进一步降低了系统毒性，如图4。
116.实施例7
117.zeta电位变化监测弱酸及h2o2诱导递送系统解组装行为的实验结果图
118.取实施例1、2、3中最终样品溶液，用0.1m的盐酸溶液将它们分别调节ph至7.4和5.5，另有采用0.3％的h2o2、以及0.3％h2o2配制ph5.5的溶液，使用马尔文激光粒度仪记录在四种溶液中1h，4h，8h，12h，24h，该系统的zeta电位值，结果见图5。
119.实验结果表明：在ph＝7.4时，三组样品溶液的zeta电位均未发生明显变化。在ph＝5.5的弱酸环境下，三组弱酸敏感型递送系统的zeta电位值随时间逐渐由弱负电位有所增加，在0.3％的h2o2的溶液中，也出现同样趋势，而变化趋势更明显，在0.3％h2o2配制的ph5.5的溶液，该系统电位增加速率更为迅速，证明了该递送系统的双响应性解组装，如图5。
120.实施例8
121.该递送系统的细胞内吞实验。
122.按照实施例1制备载药纳米粒，仅在加入基因药物的同时，加入带负电荷的吲哚菁
绿近红外染料。制备含载有荧光染料的载药系统，记为hf-arg@mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')-icg。
123.将b16细胞以1
×
104/孔接种于48孔板中培养24h，吸走培养基，用pbs洗涤细胞两次，分别加入以上所制备的hf-arg@mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')-icg、icg(icg的浓度为0.25mg/ml)，孵育4h，吸走药物，用pbs洗涤细胞两次，加入4％多聚甲醛固定细胞30min。并设立空白组，使用生物倒置显微镜进行观察，结果如图6所示。
124.实验结果表明：hf-arg@mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')-icg较游离icg显示出更好的细胞内化及溶酶体逃逸能力，载有荧光染料的纳米粒被吞噬后分散于细胞内部各处。
125.实施例9
126.载有荧光染料的纳米粒在小鼠体内的肌肉蓄积及淋巴靶向能力
127.取一只c57小鼠，大腿及腹部剃毛，大腿肌肉注射实施例7制备的hf-arg@mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')-icg，分别于1h、2h、4h、8h、24h、48h采用小动物活体成像仪观察腿部荧光变化情况及1h、48h淋巴结荧光蓄积情况。并于48h摘取小鼠两侧腹股沟浅淋巴结观察荧光。如图7和图8所示。
128.实验结果表明：icg-hf-arg@mirna-8485(5'-cacacacacacacacacguau-3')于肌注后缓慢释放，大腿部位在48h后仍有较强的荧光，注射侧腹股沟浅淋巴结出现较强的荧光蓄积。
129.实施例10
130.实时荧光定量pcr试验(rt-qpcr)
131.将b16细胞接种至小鼠，于尾静脉注射实施例1中的基因药物或基因疫苗纳米递送系统(hf-arg@mirna-8485)，分别在不同时间点取肿瘤部位以及不同组织细胞，进行检测，定量测量slc1a5(asct2)基因的表达量，gapdh基因用作内参序列。q rt-pcr测定混合物包括：2μl(200ng)c dna样品，6.1μl无酶超纯水，7.5μl 2
×
sybr green pcr master mix(bioflux)，0.2μl of each gene specific primer(10μm)。通过rt-pcr技术测定b16细胞在slc1a5(asct2)基因水平的沉默效率；重复测定三次。
132.实验结果如图9显示，slc1a5(asct2)基因水平明显沉默。
133.实施例11
134.elasa测定蛋白表达
135.b16细胞接种于6孔板并在完全培养基中培养24h。然后加入实施例1中的基因药物或基因疫苗纳米递送系统(hf-arg@mirna-8485)。继续培养48h后，细胞消化后用试剂盒定量溶解。蛋白质总量通过试剂在540nm紫外吸收下测定。蛋白质百分率通过如下公式计算:(a450nm处理样/a540nm处理样)/(a450nm对照样/a540nm对照样)，a450nm和a540nm是紫外吸收值，重复三次。通过elisa技术测定b16细胞在mrp1总蛋白质水平的沉默效率；
136.实验结果如图10显示，hf-arg@mirna-8485表现出明显抑制了蛋白质水平的表达。
137.综上所述，本发明采用二茂铁羧酸或二茂铁羧酸衍生物对聚氨基酸进行疏水改性形成纳米粒装载基因，有望解决寡聚氨基酸改性后转染能力下降及内涵体/溶酶体逃逸功能受限的问题。外部的阴离子活性多糖的修饰，可进一步保护基因药物并减少泄露，同时加长体内循环时间，提供靶向细胞的靶头。除此之外，活性多糖因其柔性基团使得纳米载体更
易穿过细胞膜；与此同时在血液循环中，其所含的阴离子基团可有效隐藏其内核所带的正电荷，减少该纳米载体与红细胞或血浆蛋白的结合，降低该系统的细胞毒性。因此，可用于体内外细胞的基因转染以及人或动物体内基因药物或基因疫苗输送。
138.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。