一种小叶苦丁茶口服液及其在降血糖方面的应用

1.本发明涉及食品加工技术领域，尤其涉及小叶苦丁茶口服液及其在降血糖方面的应用。


背景技术：

2.小叶苦丁茶系木樨科粗壮女贞，主要生长在乌江流域喀斯特地貌中。小叶苦丁茶产品外形呈条状紧结、色泽嫩绿、香气清纯，冲泡出的茶水，汤色绿亮、滋味醇爽、入口微苦、回味甘甜、口感独特，叶片在水中展开后，嫩芽叶底翠绿、叶片鲜活，因而余庆苦丁茶具有干茶绿、汤色绿、叶底绿的“三绿”特征。据古典医籍《医药纂要》、《本草纲目拾遗》等记载，苦丁茶具有清热解毒、除烦止渴、消食化痰、散肝风、清头目等功效。《中华医学大辞典》记载，苦丁茶具有“活血脉、凉子宫”之功效。
3.现代医学研究证明，苦丁茶除含有丰富的硒、铷、锗、锌、镁等成分外，还含有熊果酸、熊果醇、苦丁皂苷、茶多酚、葡萄糖醛酸、单宁、蛋白质、氨基酸和维生素等250多种药用物质和70种挥发油，具有降血压、降血脂、降低胆固醇和清热解毒、健胃消积、提神醒脑、明目益思、抗衰老、防治痧气、头痛、牙痛、赤目、肝炎、痢疾、感冒、腹痛、急性肠胃炎等功效，还有防癌抑癌、美容及调节身体机能等作用。苦丁茶的独特功效还主要在于其有较高的营养价值和极佳的药理保健作用。因此，如何充分实现苦丁茶的综合利用，建立一种最佳的小叶苦丁茶深加工工艺，赋予其独特的生理保健功能是本发明所要解决的技术问题。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明通过参数的优化，建立了一种最佳的小叶苦丁茶产品制备工艺，利用小叶苦丁茶老叶片制备了一种口服液。所述口服液含中富含苦丁皂苷、氨基酸、维生素c、多酚类、多糖类、黄酮类、咖啡碱、蛋白质、熊果酸、β-香树脂醇、羽扇醇、蒲公英萜醇等多种功能成分，氨基酸组成成分齐全，含有丰富的药效氨基酸，对加链脲佐菌素诱导的小鼠高血糖具有显著的降低功效，能够降低高血糖小鼠血液中的tg、cho和gsp含量并增加hdl-c、glp-1含量。所述小叶苦丁茶口服液的制备工艺包括以下步骤：
5.(1)选茶：
6.将成品小叶苦丁茶老叶片颗粒进行筛选，将不成型茶叶去除，保留个型饱满，色泽红润的优质小叶苦丁茶老叶片待用；
7.(2)浸泡：
8.将筛选后的小叶苦丁茶老叶片、甜菊叶放入纯净水中，50℃恒温浸泡50min并超声20min，超声期间每10min搅拌一次，得到小叶苦丁茶老叶片固液混合体；
9.本发明通过浸泡步骤保障了小叶苦丁茶老叶片的有效成分不被破坏，同时保持水温的恒定可以促进茶叶中有效成分最大程度地溶于水中；
10.(3)沉淀分离：
11.将浸泡后的小叶苦丁茶老叶片固液混合体在室温下静置沉淀20min后进行过滤，
保留滤液备用；
12.(4)高分子过滤：
13.将滤液采用高分子过滤去掉其中的悬浮物及细小颗粒杂质；
14.(5)杀菌：先将产品采用紫外线杀菌5min，再升温至75℃并保温15～16s，保温结束后迅速降温至10℃以下；
15.为避免高温杀菌造成小叶苦丁茶老叶片口服液有效成分破坏，本发明采用先紫外线杀菌后巴氏灭菌的工艺对产品进行了灭菌处理；
16.(6)装瓶：
17.将高分子过滤后得到的溶液进行装瓶，得到小叶苦丁茶老叶片口服液。
18.进一步地，所述步骤(2)中小叶苦丁茶老叶片与甜菊叶的重量比为6：1。
19.进一步地，所述步骤(2)中小叶苦丁茶老叶片和甜菊叶与水的料液比为1g：20l。
20.进一步地，所述步骤(2)中纯净水的温度为75～85℃。
21.进一步地，所述步骤(2)中的浸泡时间为15min。
22.本发明还提供了一种通过上述方法制备而成的小叶苦丁茶口服液。
23.本发明所述小叶苦丁茶口服液能够降低高血糖小鼠血液中的tg、cho和gsp含量并增加hdl-c、glp-1含量。
24.与现有技术相比，本发明的有益技术效果：
25.本发明所述的一种小叶苦丁茶口服液含有苦丁皂苷、氨基酸、维生素c、多酚类、多糖类、黄酮类、咖啡碱、蛋白质、熊果酸、β-香树脂醇、羽扇醇、蒲公英萜醇等多种功能成分，其氨基酸组成成分齐全，含有丰富的药效氨基酸，可能具备多种功效作用，口感极佳，且无任何毒副作用。
26.所述的一种小叶苦丁茶口服液功效验证利用脂多糖配合链脲佐菌素诱导的高血糖小鼠模型研究发现，其可通过降低血液中的tg、cho和gsp含量并增加hdl-c、glp-1含量进而降低高血糖。
附图说明
27.下面结合附图说明对本发明作进一步说明。
28.图1为灌胃小叶苦丁茶口服液后小鼠血糖值的变化情况；
29.图2为小叶苦丁茶口服液对高血糖小鼠血清生化指标的影响；
30.图3为小叶苦丁茶口服液对高血糖小鼠gsp的影响；
31.图4为小叶苦丁茶口服液对高血糖小鼠fins的影响；
32.图5为小叶苦丁茶口服液对高血糖小鼠glp-1的影响；
33.图6为小叶苦丁茶口服液对高血糖小鼠gc的影响；
34.图7为小叶苦丁茶口服液产品制作流程图；
35.图8为小叶苦丁茶口服液产品展示图；
36.注：与正常组比较，极显著用“**”表示(p《0.01)显著用“*”表示(p《0.05)；与模型组比较，极显著用“##”表示(p《0.01)，显著用“#”表示(p《0.01)。
具体实施方式
37.实施例1
38.一种小叶苦丁茶老叶片口服液的制备方法，步骤如下：
39.(1)选茶：将成品小叶苦丁茶老叶片颗粒进行筛选，将不成型和部分茶叶去除，保留个型饱满，色泽红润的优质小叶苦丁茶老叶片待用；
40.(2)将优选的小叶苦丁茶老叶片茶叶，甜菊叶和水按质量配比3kg：0.5kg：140l的比例放入50℃的纯净水中，在恒温水浴锅进行浸泡30min，50℃超声20min，10min搅拌一次；
41.(3)沉淀分离：将浸泡后的小叶苦丁茶老叶片固液混合体在室温状态下进行沉淀20min，进行固液分离过滤；
42.(4)高分子过滤：将沉淀分离出的液体采用高分子过滤去掉其中悬浮物及细小颗粒部分；
43.(5)杀菌：先将产品采用紫外线杀菌5min，再用75℃加热，保温15～16s，然后迅速降至10℃以下；
44.(6)装瓶：将通过高分子过滤后得到的溶液进行装瓶。
45.测试例1
46.采用质谱法检测实施例1得到的小叶苦丁茶口服液的功效成分，方法如下：
47.取小叶苦丁茶口服液于10ml量瓶中，加入甲醇定容，室温超声处理1h(功率250w，频率50hz)，放冷，用甲醇补足失去的重量，摇匀，0.22μm过滤膜过滤，得滤液。
48.色谱条件：色谱柱为hp-5ms(30mm
×
0.25mm
×
0.25μm)弹性石英毛细管柱；柱温45℃(保持3min)，以4℃/min升温至250℃，运行时间45min；载气为高纯度氦气，汽化室温度为250℃；柱前压7.16psi，载气流量1.0ml
·
min-1
；进样量2μl，分流比为40：1，溶剂延迟时间2min；
49.质谱条件：离子源为esi源，接口温度为280℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70ev，倍增器电压1352v，质量范围29～450amu。
50.经检测，所述小叶苦丁茶口服液主要功能成分包括蛋白、还原糖、茶多酚、黄酮类、阿克苷，含有的营养元素氨基酸组成成分齐全，且药效氨基酸含有丰富。
51.具体功能成分组成如下：
52.序号项目指标(mg/100g)1维生素c—2粗蛋白≥7.273还原糖≥0.0236茶多酚≥17.807可溶性糖—8黄酮≥37.579咖啡碱—10茶黄素—11阿克苷≥10.24
53.具体营养元素组成如下：
54.序号项目单位指标
1钾g/kg≥5.202钠mg/kg≥68.803铁mg/kg≥328.004钙g/kg≥7.035镁g/kg≥1.0406锰mg/kg≥99.307锌mg/kg≥30.208铜mg/kg≥2.079磷g/kg≥1.1310硒mg/kg—
55.具体氨基酸组成如下：
56.[0057][0058]
测试例2
[0059]
对小叶苦丁茶口服液的降血糖药理活性检测：
[0060]
1、实验方法：
[0061]
(1)脂多糖溶液制备：
[0062]
将脂多糖(粉剂)试剂从-20℃中取出，用生理盐水溶解，配制浓度为100μg/ml；配制的脂多糖溶液，于-20℃条件下分装储存，使用时取出，避免反复冻融。
[0063]
(2)链脲佐菌素溶液制备：
[0064]
链脲佐菌素试剂从-20℃中取出，用经4℃预冷的生理盐水配制stz溶液，配制好的溶液要置于冰上备用，配置好的溶液必须在30min内注射使用掉，时间超过会导致stz药效下降而致使造模失败。
[0065]
(3)高血糖动物模型的构建：
[0066]
健康雄性c57bl/6j小鼠40只，正常组4只不做任何处理，自由饮食、饮水，其余小鼠脂多糖(500μg/kg/d)腹腔注射，连续注射28d，自由饮食饮水；第30d和第32d给予小鼠腹腔注射stz溶液100mg/kg；第37d、39d采小鼠尾静脉血用血糖仪测小鼠空腹血糖值，若两次检测的血糖值均＞11.1mmol
·
l-1
则可认定建模成功。
[0067]
(4)动物分组：
[0068]
高血糖模型成功后，根据测得的血糖值将造模成功的小鼠随机分为模型组10只、阳性药组(二甲双胍格列本脲胶囊)10只、小叶苦丁茶提取物低剂量组10只、小叶苦丁茶提取物中剂量组10只和苦丁茶提取物高剂量组10只，给药组每天灌胃给药1次，模型组每次给予等容量的无菌水，连续灌胃7周。
[0069]
(5)给药剂量确定：
[0070]
根据《药理实验方法学》计算方法，小鼠的等效剂量相当于人的9.1倍，即相当于成人二甲双胍格列本脲胶囊的剂量为300mg/d，假设成人的体重为60kg，则小鼠的二甲双胍格列本脲胶囊为45.5mg/kg
·
d；小叶苦丁茶口服液经过冷冻干燥后形成粉末，利用冻干粉末
配成低、中、高剂量，分别为227.5mg/kg
·
d、455.0mg/kg
·
d、682.5mg/kg
·
d。
[0071]
(6)实验方法：
[0072]
各组动物分别于每天9:00am给予生理盐水、阳性药(二甲双胍格列本脲胶囊)45.5mg/kg
·
d、小叶苦丁茶提取物227.5mg/kg
·
d、455.0mg/kg
·
d、682.5mg/kg
·
d，给药时间分别为49d，在给药的0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d给小鼠禁食不禁水6h后采集小鼠尾静脉血用血糖仪测定小鼠空腹血糖值；
[0073]
于49天后，小鼠眼眶取血，取血时应避免小鼠皮毛掉入，室温下静置自然凝血，置于离心机中3000rpm离心15min，分离血清，每只小鼠的血清分别做好标记，置于-80℃超低温冰箱保存，用于测定实验小鼠甘油三酯tg、胆固醇cho、高密度脂蛋白胆固醇hdl-c、低密度脂蛋白胆固醇ldl-c、糖化血清蛋白gsp、空腹胰岛素fins、胰高血糖素glucagon、胰高血糖素样肽-1glp-1在血清中的含量水平，同时开腹摘取小鼠胰腺组织，将小鼠的胰腺组织浸泡于装有4％多聚甲醛溶液的冻存管中(4％多聚甲醛溶液体积应能将胰腺组织完全浸泡)，用于组织病理学观察、制作切片检测细胞凋亡。另外将小鼠的心、肝、脾、肺、肾取出称重并记录。
[0074]
高血糖小鼠小叶苦丁茶提取物灌胃量：
[0075]
组别浓度给药天数(周)正常组——7模型组——7二甲双胍格列本脲胶囊45.5mg/kg
·
d7苦丁茶低剂量组227.5mg/kg
·
d7苦丁茶中剂量组455.0mg/kg
·
d7苦丁茶高剂量组682.5mg/kg
·
d7
[0076]
注：与模型组比较，极显著用“##”表示(p《0.01)，显著用“#”表示(p《0.01)。
[0077]
(7)统计分析：
[0078]
采用统计软件excel及spss 23.0分析，计量资料用均数
±
标准差(x
±
s)表示，多组间数值比较用单因素方差分析，以p《0.05为差异有统计学意义。
[0079]
检测结果如下：
[0080]
(1)高血糖小鼠模型的构建：
[0081]
36只健康雄性c57bl/6j小鼠脂多糖(500μg/kg/d)腹腔注射，连续注射28d，自由饮食饮水。30d开始空腹注射stz溶液(50mg/kg/d)，连续注射五天，血糖值高于11.1mmol
·
l-1
的小鼠动物则视为造模成功。
[0082]
(2)小叶苦丁茶提取物对高血糖小鼠体征情况的影响：
[0083]
在整个实验过程中，正常对照组小鼠精神状态、一般状态良好，活动自如，毛色光泽，正常饮水进食，排尿量正常，无受伤及死亡；各组高血糖模型小鼠进食量、进饮量、排尿量、排便量显著增加，各组小鼠皮毛松散、毛色灰暗无光泽，精神状态较差，活动量减少，“多食、多饮、多尿”等糖尿病症状逐渐明显，且垫料骚臭味显著；精神状态较正常对照组小鼠差，反应稍有迟缓，饥饿或饮水不足时明显；其中以模型对照组最为显著。
[0084]
结果表明，随着药物干预时间增加，苦丁茶提取物各剂量组和阳性药组小鼠较模型对照组小鼠精神稍好，皮毛相对顺滑，垫料相对洁净。
[0085]
(3)小叶苦丁茶对高血糖小鼠血糖的影响：
[0086]
由图1可知，小叶苦丁茶各组在给药7周时，与模型组相比均有一定的降糖效果，图1可见到给药第4周时，小叶苦丁茶口服液三个灌胃组均出现明显的血糖下降趋势，并趋于正常水平，说明模型的稳定性较好，其中高剂量组降糖效果尤为明显。
[0087]
(4)小叶苦丁茶口服液对高血糖小鼠血清生化指标的影响：
[0088]
小鼠血清生化指标检测主要检测甘油三酯tg、胆固醇cho、高密度脂蛋白胆固醇hdl-c、低密度脂蛋白胆固醇ldl-c、糖化血清蛋白gsp、胰高血糖素样肽-1glp-1以及空腹胰岛素fins在血清中的含量水平。小叶苦丁茶灌胃49天后，小鼠眼眶取血，取血时应避免小鼠皮毛掉入；室温下静置自然凝血，置于离心机中3000rpm离心15min，分离血清；每只小鼠的血清分别做好标记，tg、cho、hdl-c、ldl-c、gsp均使用infinitcm200酶标仪按试剂盒要求测定。
[0089]
结果显示随着小叶苦丁茶剂量增加，其降低甘油三酯和胆固醇的效果逐渐增强，与模型组相比均具有显著差异(p《0.05)。与此同时，模型组的高密度脂蛋白含量远低于各个给药组，具有极显著性差异(p《0.01)。结果见图2。
[0090]
(5)小叶苦丁茶口服液对高血糖小鼠糖化血清蛋白的影响：
[0091]
实验结果见图3，数据显示小叶苦丁茶口服液3个灌胃组随着剂量增加，其糖化血清蛋白水平也逐渐降低，高剂量组与模型组相比具有极显著差异(p《0.01)，低、中剂量组与正常组相比较具有极显著差异(p《0.01)。
[0092]
结果表明，高剂量的小叶苦丁茶口服液提取物能够降低高血糖小鼠的糖化血清蛋白水平的作用。
[0093]
(6)小叶苦丁茶口服液对高血糖小鼠gc、glp-1、fins的影响：
[0094]
gc、glp-1、fins的含量按照msd试剂盒要求测定。实验结果显示，小叶苦丁茶提取物高剂量灌胃组的空腹胰岛素(fins)和胰高血糖素样肽1(glp-1)水平均高于低剂量灌胃组。
[0095]
结果表明，高剂量组的空腹胰岛素与模型组相比具有极显著性差异(p《0.01)，低、中剂量组与模型组相比具有显著性差异(p《0.05)。且小叶苦丁茶3个灌胃组的胰高血糖素(gc)值与正常组相比均具有极显著性差异(p《0.01)。结果见图4-6。
[0096]
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。