雷帕霉素在制备预防或治疗鲫造血器官坏死病药物中的应用

1.本发明属于农业、渔业及病害防控技术领域，具体涉及一种雷帕霉素在制备预防或治疗鲫造血器官坏死病药物中的应用。


背景技术：

2.鲤疱疹病毒ii型(cyprinid herpesvirus2,cyhv-2)是一种可感染鲫或金鱼并引起造血器官坏死病的鱼类疱疹病毒。cyhv-2病毒于1992年首次在日本发现，在2013年首次在我国发现该病毒感染病例(xu j,zeng l,zhang h,et al.cyprinid herpesvirus 2infection emerged in cultured gibel carp,carassius auratus gibelio in china[j].veterinary microbiology,2013,166(1-2):138-144.)。cyhv-2能感染生长在不同阶段的鲫或金鱼，发病后死亡率最高可达100％。cyhv-2病毒感染可造成鱼食欲减退，游动缓慢，体表出血，鳃出血，胸鳍腹鳍基部出血等一系列症状，最终导致死亡。现有研究证实cyhv-2感染宿主可引起急性感染和可持续性感染，可持续性感染在特定条件下可以转化为急性感染(chai w,qi l,zhang y,et al.evaluation of cyprinid herpesvirus 2latency and reactivation in carassius gibel[j].microorganisms,2020,8(3):445.)。这种复杂多变的感染情况使得该病毒易于传播且病毒防控更加困难。
[0003]
在一线养殖过程中主要有以下措施用于防控病毒：首先，注重水体消毒，包括源水、养殖水和养殖尾水的消毒。可引入过滤砂罐，紫外消毒等设备，降低源水带毒。也可使用二氧化氯、戊二醛、三氯异氰尿酸等消毒剂对养殖塘口水体进行消杀。其次，选用健康的苗种并在春秋两季病毒爆发的高峰期做好实时监控，早发现早处理。另外，加强抗病苗种的选育也是一条行之有效的从根源上抵御病毒的方法。再者，可使用微生物制剂进行日常水质管理和预防。
[0004]
目前对cyhv-2感染机制尚不清晰，采用消毒养殖环境，提高鱼体免疫力等方法效果不显著，尚未有商品化的疫苗应用于产业化防控，开发一种针对cyhv-2的靶向药物比较困难。有研究表明改良和复配现有的中药复方可防控cyhv-2病毒，例如何杰等的研究发现饲料中添加胆汁酸能促进鱼体生长，并提高鱼体的抗病毒能力(何杰.饲料添加胆汁酸对异育银鲫生长、氧化损伤修复、内源胆汁酸代谢以及cyhv-2免疫保护作用的影响[d].苏州大学，2018.)；su等的研究发现盐酸小檗碱(bbh)在体内和体外能抑制cyhv-2病毒复制(su m,tang r,wang h,et al.suppression effect of plant-derived berberine on cyprinid herpesvirus 2 proliferation and its pharmacokinetics in crucian carp(carassius auratus gibelio)[j].antiviral research,2021,186:105000.)；沈兆媛等的研究发现1％穿心莲有良好的抗cyhv-2的效果(沈兆媛，鲁建飞，许丹，吕利群.中草药饲料添加剂对异育银鲫感染ii型鲤疱疹病毒的影响[j].水产科学,2018,37(03):289-294.)。但是复方中草药制剂也尚未商品化，且具体抗病毒机制还有待研究。
[0005]
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mtor)作为pi3k/akt下游的一种重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，能调节细胞的血管生成和促进细胞物质代
谢的功能，还参与细胞自噬，凋亡，在多种疾病中扮演着不可或缺的角色。近年来，pi3k/akt/mtor通路备受关注，被称为“明星通路”，mtor抑制剂在针对呼吸道合胞病毒(rsv)(huynh h,levitz r,huang r,et al.mtor kinase is a therapeutic target for respiratory syncytial virus and coronaviruses[j].scientific reports,2021,11(1):24442.)、白斑综合征病毒(wssv)(su m a,huang y t,chen i t,et al.an invertebrate warburg effect:a shrimp virus achieves successful replication by altering the host metabolome via the pi3k-akt-mtor pathway[j].plos pathogens,2014,10(6):e1004196.)等一系列研究中被证实具有可观的治疗前景，其代表药物是雷帕霉素。雷帕霉特异性地抑制mtorc1，化学式为c
51h79
no
13
，化学结构式为：
[0006]


技术实现要素：

[0007]
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种雷帕霉素在制备预防或治疗鲫造血器官坏死病药物中的应用。
[0008]
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
[0009]
本发明提供了一种雷帕霉素在制备预防或治疗鲫造血器官坏死病药物中的应用，该雷帕霉素为抑制mtor基因磷酸化的药物(即mtor的抑制剂)，剂量为500nmol/l、10μmol/l或20μmol/l。
[0010]
作为本发明的优选实施例，雷帕霉素能够有效抑制鲫gicf细胞中cyhv-2病毒感染复制，即将雷帕霉素药物用于感染cyhv-2的gicf细胞模型上，能很好地降低cyhv-2病毒的拷贝数，达到阻碍病毒感染复制的效果。
[0011]
作为本发明的优选实施例，雷帕霉素在蛋白水平显著抑制了mtor的磷酸化和orf121蛋白的表达量，来抑制cyhv-2的复制。
[0012]
作为本发明的优选实施例，雷帕霉素通过抑制mtor的磷酸化介导pi3k/akt/mtor信号通路部分基因的表达量，来抑制cyhv-2的复制。其中，部分基因包括akt2、irs1、pdpk1和eif4ebp2。
[0013]
一种用于预防或治疗鲫造血器官坏死病的药物，该药物中的有效成分为上述的雷帕霉素。
[0014]
作为本发明的优选实施例，该药物还包括药学上可接受的载体。
[0015]
作为本发明的优选实施例，该药物的剂型为药物治疗学上可接受的任一一种剂型。
[0016]
作为本发明的优选实施例，该药物的剂型为粉剂。
[0017]
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
[0018]
本发明将雷帕霉素药物用于感染cyhv-2的gicf细胞模型上，有效降低cyhv-2的立即早期基因orf121的表达量，有效降低了pi3k/akt/mtor信号通路的表达量，能很好地降低
cyhv-2病毒的拷贝数，达到阻碍病毒感染复制的效果，从而提供了一种新颖的cyhv-2病毒的治疗方法，有望成为防治鲫造血器官坏死病的候选药物，因此本发明为治疗鲫造血器官坏死病提供了新方法。
附图说明
[0019]
图1为本发明的实施例1中cck-8法检测雷帕霉素处理后的细胞毒性检测图。
[0020]
图2为本发明的实施例1中不同浓度的雷帕霉素处理后的细胞活力检测图。
[0021]
图3为本发明的实施例3中雷帕霉素处理后western blot检测图。
[0022]
图4为本发明的实施例3中雷帕霉素处理后病毒拷贝数检测图。
[0023]
图5为本发明的雷帕霉素处理后各基因表达量的变化图(其中：a.雷帕霉素处理后orf121基因和pi3k/akt/mtor信号通路关键基因表达量变化；b.雷帕霉素处理后pi3k/akt/mtor信号通路部分基因表达量变化；c.雷帕霉素处理后cyhv-2的部分基因表达量变化)。
具体实施方式
[0024]
本发明提供了一种雷帕霉素在制备预防或治疗鲫造血器官坏死病药物中的应用。
[0025]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026]
材料
[0027]
(1)实验毒株和细胞
[0028]
异育银鲫尾鳍细胞系gicf(the caudal fin of carassius auratus gibelio)为本实验室构建，冻存于液氮中。细胞复苏所用培养基为含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的m199培养基，在27℃恒温培养箱培养。cyhv-2分离株yc-01(以下简称cyhv-2)在25℃的条件下感染细胞，待细胞全部死亡后，收集细胞上清液用0.22μm的针头式滤器过滤后即为纯病毒液，在-80℃保存备用。
[0029]
(2)实验试剂
[0030]
m199培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素100
×
购自gibco公司；cell counting kit购自北京全式金生物技术股份有限公司；count&viability kit购自merck kgaa公司；雷帕霉素购自mce公司；dmso购自sigma公司；trizol购自invitrogen公司；三氯甲烷购自上海柯灵斯试剂有限公司；无水乙醇、甲醇、异丙醇购自国药集团化学试剂有限公司；depc处理水、pbs、吐温-20购自生工生物(上海)股份有限公司；病毒基因组dna/rna提取试剂盒(dp315)购自天根生化科技(北京)有限公司；tb premix ex taq
tm ii(rr820a)、primescript
tm rt master mix(rr036a)购自takara公司；anti-mtor monoclonal antibody、anti-phospho-mtor monoclonal antibody购自cell signaling technology公司；anti-β-actin monoclonal antibody购自proteintech公司；anti-orf121 polyclonal antibody为本实验室制备；goat anti-mouse igg(h+l)-hrp购自bioworld公司；goat anti-rabbit igg h&l(hrp)购自abcam公司；pvdf膜、极超敏ecl化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；trans-blot turbo 5
×
transfer buffer
购自bio-rad公司。
[0031]
实施例1：
[0032]
(1)细胞毒性检测
[0033]
mtor抑制剂雷帕霉素以10mmol/l溶解在dmso中，并在给药前用10％的m199培养基稀释到指定浓度。
[0034]
gicf细胞提前一天铺96孔板，每孔5
×
103个细胞，细胞接种一式四份。雷帕霉素的处理浓度为500nmol/l、10μmol/l和20μmol/l，溶剂组dmso为对照，在27℃下培养细胞。在雷帕霉素处理24h、48h和72h分别检测细胞毒性：更换含有cck试剂的培养基(每孔10μl cck试剂)，在恒温培养箱27℃下继续培养3h，使用多功能酶标仪synergy
tm 2检测450nm处的吸光度。
[0035]
(2)细胞活力检测
[0036]
gicf细胞提前一天铺6孔板，每孔106个细胞，细胞接种一式三份。雷帕霉素处理浓度为500nmol/l、10μmol/l和20μmol/l，溶剂组dmso为对照，在27℃下培养细胞72h。收集孔板中的所有细胞，用pbs重悬。取50μl细胞与450μl的muse count&viability试剂混合，室温避光孵育5min后使用muse全能细胞状态分析仪检测。
[0037]
实施例2：
[0038]
雷帕霉素抑制实验
[0039]
体外抑制实验首先用500nmol/l、10μmol/l和20μmol/l的雷帕霉素(dmso组为对照)预处理gicf细胞2h，然后用cyhv-2(moi＝1)感染。感染病毒72h后，收集细胞，检测pi3k/akt/mtor信号通路的部分基因在mrna水平和蛋白水平的表达量，以及细胞上清液中cyhv-2的拷贝数。
[0040]
(1)rna提取
[0041]
收集药物处理后的细胞，加入1ml trizol吹打混匀。加入200μl三氯甲烷涡旋振荡15s，静置3min，在4℃下12000
×
g离心15min。取上清液加入等量异丙醇，静置10min，在4℃下12000
×
g离心10min。弃上清液，加入75％乙醇(用depc处理水配制)1ml，在4℃下7500
×
g离心5min。加入20μl depc处理水溶解rna。
[0042]
(2)荧光定量pcr检测(rt-qpcr)
[0043]
逆转录反应为每10μl体系加入500ng rna，参照primescript
tm rt master mix kit进行实验，如表1和表2所示。
[0044]
表1逆转录反应体系
[0045][0046]
表2逆转录反应条件
[0047][0048]
rt-qpcr反应体系参照tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)kit。通过2-δδct
方法计算每个基因的相对表达量(内参基因为β-actin)。rt-qpcr所用引物序列于表3。
[0049]
表3 rt-qpcr引物
[0050]
[0051][0052]
表4 rt-qpcr反应体系
[0053][0054]
表5 rt-qpcr反应条件
[0055][0056]
实施例3：
[0057]
(1)病毒拷贝数检测
[0058]
重组质粒pdsred-express-n1-orf121由本实验室构建，其质粒浓度用nanodrop 2000测得。拷贝数(copies/μl)＝6.02
×
10
23
(copies/mol)
×
质粒浓度(ng/μl)
×
10-9
/(重组质粒碱基数
×
660g/mol)。以10倍梯度稀释的质粒为模板进行rt-qpcr分析，分别以循环
数ct和拷贝数的对数为横纵坐标建立标准曲线，所用引物在表3列出。用病毒基因组dna/rna提取试剂盒提取200μl病毒上清液中的基因组dna，共洗脱30μl。以病毒基因组dna为模板，使用与标准曲线相同的引物进行rt-qpcr，将ct带入标准曲线换算得到病毒拷贝数。
[0059]
(2)western blot检测
[0060]
对于细胞样品，六孔板每孔加入60μl 2
×
sds-page上样缓冲液，用细胞刮刀收集细胞。将制备好的样品沸水浴15min，12000
×
g离心3min，取上清跑sds-page。跑胶完成后使用半干转膜的方法将蛋白转至pvdf膜上。半干转膜液配置为蒸馏水：无水乙醇：trans-blot turbo 5
×
transfer buffer＝3:1:1。转模条件为恒流2.5a转膜4.5min。将转膜完成的pvdf膜在室温下用5％脱脂牛奶封闭2h后在4℃下与一抗孵育过夜，pbst清洗5次，每次5min。随后在室温下与二抗孵育1.5h，pbst清洗5次，每次5min。用ecl显色液显色，chemidoc
tm imaging system成像系统拍照。
[0061]
结果
[0062]
(1)细胞毒性检测
[0063]
雷帕霉素的处理浓度为500nmol/l、10μmol/l和20μmol/l。以溶剂组dmso为对照，按照上述浓度处理细胞24h、48h和72h后，如图1所示，在所有被测试的浓度下，细胞存活95％以上，表明20μmol/l及以下的浓度对细胞没有毒性。
[0064]
(2)细胞活力检测
[0065]
细胞活力测试结果如图2所示，在不同浓度雷帕霉素(dmso、500nmol/l、10μmol/l和20μmol/l)给药72h后，活细胞的百分比都大于96％以上，即本发明所选择的药物浓度是较为安全的实验浓度。
[0066]
(3)雷帕霉素抑制cyhv-2的复制
[0067]
用雷帕霉素处理gicf细胞2h后感染moi＝1的cyhv-2，感染病毒72h后，收集细胞，用wb检测mtor的磷酸化以及orf121的变化情况，用rt-qpcr检测pi3k/akt/mtor信号通路的部分基因的表达量，以及细胞上清液中cyhv-2的拷贝数。结果如图3所示，与对照组相比，雷帕霉素作用后在蛋白水平显著抑制了mtor的磷酸化和orf121蛋白的表达量。如图4所示，cyhv-2病毒的拷贝数显著下降。如图5所示，orf121基因在转录水平被显著的抑制(图5中a)，cyhv-2基因组中的另外4个立即早期基因(orf54，orf141，orf147，orf155)以及一个早期基因(orf24)和一个晚期基因(orf7)均被抑制(图5中c)，即抑制mtor的磷酸化抑制了cyhv-2的复制。pi3k/akt/mtor信号通路的基因：akt2、irs1、pdpk1、eif4ebp2在mrna水平被抑制(图5中a和b)，表明雷帕霉素通过抑制mtor的磷酸化介导pi3k/akt/mtor信号通路，从而抑制cyhv-2的复制。
[0068]
综上，本发明的雷帕霉素对cyhv-2具有明显的抑制作用，且抑制效果呈剂量依赖关系。雷帕霉素作用后抑制了mtor的磷酸化，抑制了pi3k/akt/mtor信号通路部分基因的表达量，抑制了cyhv-2病毒的拷贝数和病毒部分基因的表达量，表明雷帕霉素通过抑制mtor的磷酸化介导pi3k/akt/mtor信号通路，从而抑制cyhv-2的复制。
[0069]
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本
发明的保护范围之内。
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075]
[0076]
[0077]