使用由减毒细菌递送的回忆抗原治疗癌症

使用由减毒细菌递送的回忆抗原治疗癌症
1.本技术是申请日为2016年4月26日、申请号为2016800325481、发明名称为“使用由减毒细菌递送的回忆抗原治疗癌症”的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求于2015年4月28日提交的美国临时专利申请号62/153,728的权益，其内容通过引用并入本文。
技术领域
4.本技术涉及癌症治疗领域，更具体地涉及使用减毒细菌递送的回忆抗原治疗癌症。


背景技术：

5.在整个本技术中，各种出版物在括号或上标中提及。这些参考文献的完整引用可以在说明书的末尾找到。这些出版物的公开内容通过引用整体并入本技术中，以更全面地描述本发明所涉及的领域。
6.癌症仍然是美国和美国以外的主要健康问题。2011年，估计美国有13,397,159个患有癌症的人活着。根据2007-2011年年龄调整数据，每年新发癌症病例数为每10万个男性和女性中460.4个。每年死亡人数为每10万个男性和女性中173.8个。根据2009-2011年的数据，预计约有40.4％的男性和女性在一生中的某个时候会被诊断患有癌症。预计每年癌症病例将在未来二十年内从2012年的1400万增加2200万(world cancer report 2014)。
7.两个主要问题阻碍了癌症免疫治疗的成功。一个问题是癌症疫苗中使用的肿瘤相关抗原(taa)通常是与正常细胞相比在肿瘤细胞中过表达或突变的自身抗原。已经教导，胸腺中的t细胞在生命中的较早期不与自身抗原反应，因此难以诱导对taa的强t细胞应答。另一个问题是大多数癌症患者都是老年人，老年人比年轻人的疫苗反应效率低。这通常是由于缺乏初始t细胞(仅在年龄较小时产生，并且在生命过程中被使用)，其第一次与新抗原反应并且在重复暴露于相同抗原时负责记忆t细胞的产生。本发明解决了这两个问题，并满足了改善癌症治疗的需要、特别是用于改善转移治疗。


技术实现要素：

8.本发明提供了治疗受试者中的肿瘤和/或减少或预防受试者中的肿瘤转移的方法，包括向受试者施用有效治疗肿瘤和/或减少或预防肿瘤转移的量的表达回忆抗原的减毒细菌。
9.还提供了包含表达回忆抗原的减毒细菌的药物组合物和癌症疫苗。
附图说明
10.图1.listeria-回忆抗原模型的示意图。
11.图2a.listeria
at-tt
856-1313
疫苗的开发。破伤风类毒素(tt)cdna的c-末端的无毒
片段(氨基酸位置856-1313)作为llo启动子(p)的控制下的listeria
at
质粒pgg34中与截短的非细胞溶解性李斯特菌溶血素o(llo)的融合蛋白(a)进行克隆。已经包括myc标签用于检测tt蛋白。
12.图2b.listeria
at-tt
856-1313
疫苗的开发并测试感染的4t1肿瘤细胞的tt表达。使用抗myc抗体通过蛋白质印迹确认lm-llo-tt分泌llo-tt
856-1313
蛋白(listeria
at-tt)。泳道1：阴性对照(培养基)；泳道2：listeria
at-tt培养物的上清；泳道3：listeria
at-tt培养物的沉淀。
13.图2c.listeria
at-tt
856-1313
疫苗的开发并测试感染的4t1肿瘤细胞的tt表达。如这里用抗myc抗体所示，listeria
at-tt感染导致4t1肿瘤细胞中tt抗原的表达。泳道1：4t1肿瘤细胞；泳道2：用listeria
at
感染的4t1肿瘤细胞；泳道3：用listeria
at-tt感染的4t1肿瘤细胞。
14.图3.针对tt
856-1313
蛋白中免疫显性表位的cd8 t细胞应答的产生。balb/cbyj小鼠以1周时间间隔3次免疫接种5μg纯化的tt
856-1313
蛋白和10μg的cpg，并用免疫显性cd8 tt肽(gynapgipl)(seq id no：1)重新刺激处理和对照小鼠的白细胞72小时，然后通过流式细胞术分析。代表2个实验。每组n＝5只小鼠。
15.图4.listeria
at-tt
856-1313
对乳腺癌模型4t1中的转移是高度有效的。用如图3所述的tt
856-1313
蛋白和cpg免疫balb/cbyj小鼠。一周后，将4t1肿瘤细胞(0.5x105个)注射到乳腺脂肪垫中，并在肿瘤直径达到5mm后施用listeria
at-tt的免疫(每隔一天)。这持续了两个星期。最后一次免疫后两天，将所有小鼠安乐死并分析转移数。平均每组5只小鼠的两个实验。mann-withney检验*p《0.05是显著的。
16.图5.listeria-tt和吉西他滨(gem)对临床前模型胰腺癌(panc-02)中的转移(左图)和肿瘤(右图)的影响。c57b16小鼠在乳腺脂肪垫中注射了2
×
106个panc-02肿瘤细胞。在整个研究中，肿瘤细胞注射后三天，每3天用吉西他滨腹腔注射(1.2mg/300μl)处理小鼠(共6次处理)。每天腹腔(ip)注射107cfu的listeria-tt，持续4天，然后休息3天，然后每天注射107cfu的listeria-tt共三次。在第21天将所有小鼠安乐死，并分析转移数和肿瘤重量。每组n＝3只小鼠。
17.图6.gem和listeria-tt强烈地消除panc-02和kpc小鼠中的晚期胰腺癌。panc-02模型。c57b1/6小鼠从第0天开始以1周时间间隔用人tt疫苗免疫3次，以产生针对tt的记忆t细胞。随后，将panc-02肿瘤细胞(105/100μl)注射到乳腺脂肪垫中(第21天)。当肿瘤为10毫米时(第31天)，ip注射高剂量的listeria-tt(107cfu)，然后(第36天)每天低剂量的listeria-tt(104cfu)注射2周(共计14次剂量)。从第34天开始，每3天施用gem(1.2mg/只小鼠)(共计5次剂量)。在第52天将所有小鼠安乐死，并分析转移数(未经处理的小鼠主要在肝脏和胰腺中具有转移，并且在间充质淋巴结和隔膜中较少)。每组n＝5只小鼠。两个实验的平均值。mann-whitney*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。误差条代表sem。kpc模型。3.5个月大的kpc小鼠接受与panc-02小鼠相同的处理。当4.5个月大时，将小鼠安乐死。
18.图7a-7b.(a)gem降低panc-02小鼠血液中的mdsc群。用panc-02肿瘤细胞攻击c57b16小鼠，并用如图7a的listeria-tt+gem处理。在最后一次处理后两天，通过流式细胞术测定血液中的mdsc(cd11b+gr1+)的百分数。每组n＝5只小鼠。代表两个实验。(b)gem降低
了panc-02小鼠转移的tam群体。用panc-02肿瘤细胞攻击c57b16小鼠，并用如图7a的listeria-tt+gem处理。在最后一次处理后两天，通过流式细胞术测定原发性肿瘤中tam(cd11b+f4/80+)的百分数。每组n＝5只小鼠。代表两个实验。误差条代表sem。
19.图8.listeria-tt和gem对胰腺癌的协同作用。李斯特菌通过感染将tt递送到肿瘤细胞中，产生高度免疫原性的肿瘤细胞，并通过感染dc重新活化针对tt的记忆t细胞(未显示)。同时，李斯特菌在肿瘤细胞和巨噬细胞中诱导高水平的ros，其通过减少cda来提高gem的敏感性。gem减少mdsc和tam群体，产生改善的t细胞应答。这些协同作用将导致tt特异性t细胞、gem和李斯特菌诱导的ros杀死肿瘤细胞。
20.图9.李斯特菌减少cda。将hela细胞(人宫颈癌细胞系)或panc-1(人胰腺癌细胞系)与不同数量cfu的李斯特菌(lm)(108、106、104cfu/ml)培养2小时，然后与庆大霉素培养过夜杀死所有细胞外细菌。使用兔抗人cda抗体通过蛋白质印迹分析cda表达。
21.图10.小鼠中李斯特菌回忆抗原和吉西他滨免疫操作方案的示意图。
具体实施方案
22.本发明提供了治疗受试者中的肿瘤和/或降低受试者中肿瘤转移的发生率或可能性的方法，包括向受试者施用有效治疗肿瘤和/或降低受试者中肿瘤转移的发生率或可能性的量的表达回忆抗原的减毒细菌。
23.细菌可以是例如其中之一：单核细胞性李斯特菌(listeria monocytogenes)、鼠伤寒沙门菌(salmonella thyphimurium)、霍乱弧菌(vibrio cholera)、梭菌(clostridium)和短双歧杆菌(bifidobacterium breve)中的多种。在优选的实施方案中，细菌是单核细胞性李斯特菌。细菌减毒以降低或消除毒力。如本文所使用的，例如，减毒的李斯特菌被表示为listeria
at
。
24.如本文所用，回忆抗原是受试者以前在生命中早期暴露于其的抗原。回忆抗原可以包括例如用于儿童接种的抗原，例如破伤风类毒素、麻疹病毒和脊髓灰质炎病毒抗原。大多数个体在儿童期已经用这些抗原接种并加强，产生了在血液中循环生存的记忆t细胞。这些记忆t细胞也可以在任何年龄中被重新活化，即使在肿瘤微环境。
25.可以使用的回忆抗原的实例包括但不限于，含有破伤风类毒素、麻疹病毒和脊髓灰质炎病毒的一种或多种中的一种或多种免疫显性表位的表位或片段。在优选的实施方案中，抗原是含有一种或多种免疫显性表位的破伤风类毒素片段。
26.该原理不仅适用于儿童抗原，而且适用于患者早期在生命中看到的几乎任何免疫原性抗原。例如，所有女性中至多70％在生命早期或后期获得白念珠菌(candida albicans)感染(1)，其表达高度免疫原性的蛋白质，包括热休克蛋白(hsp)70(2)。另一方面，流感病毒由于其持续的抗原漂移而不太合适。基本上，用于这种方法的免疫原性抗原的数量是无限的。
27.作为示例，如下所示的是克隆到李斯特菌中的破伤风类毒素(tt)(aa位置856-1313)氨基酸(大写)(seq id no：5)和dna(小写)(seq id no：6)序列(见详细实验)。dna序列的加下划线和粗体部分表示用于将tt克隆至李斯特菌中的引物序列。氨基酸序列的加下划线和粗体部分表示panc-02模型(c57b16小鼠)中tt免疫显性的cd8表位。氨基酸序列的斜体和粗体部分表示4t1模型(balb/c小鼠)中tt免疫显性中的cd8表位。
28.29.[0030][0031]
另外作为例子，下面示出了克隆到李斯特菌中的脊髓灰质炎病毒(pv)(vp1中aa位置：49-273)氨基酸(seq id no：7)和dna(seq id no：8)序列。dna序列的加下划线和粗体部分表示用于将pv vp1克隆至李斯特菌中的引物序列。氨基酸序列的斜体和粗体部分表示4t1模型(balb/c小鼠/h2-d单倍体)中pv vp1免疫显性中的cd8表位。
[0032][0033]
作为另一个实例，如下所示是克隆到李斯特菌中的麻疹病毒(mv)氨基酸(核衣壳aa位置：38-351)氨基酸(seq id no：9)和dna(seq id no：10)序列。dna序列的加下划线和粗体部分表示用于将mv序列克隆至李斯特菌中的引物序列。氨基酸序列的斜体和粗体部分表示4t1模型(akr小鼠/h2-k单元型)中mv免疫显性的cd8表位。
[0034][0035]
肿瘤可以是例如胰腺、卵巢、子宫、颈部、头部、乳腺、前列腺、肝、肺、肾、神经元、神经胶质、结肠、睾丸或膀胱中的一种或多种的肿瘤。肿瘤可以是不能手术的肿瘤。
[0036]
优选地，在向受试者施用细菌之前，在酵母培养基中培养细菌。
[0037]
该方法可以进一步包括向受试者施用作为佐剂的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)。
[0038]
在一个实施方案中，在向受试者施用细菌之前，对受试者筛选其主要组织相容性复合物(mhc)1单倍型并向受试者施用受试者对其显示cd8t细胞回忆应答的抗原。
[0039]
在一个实施方案中，在向受试者施用细菌之前，向受试者施用抗原的表位以产生针对抗原的记忆t细胞。相比年轻的受试者，这种方法在具有较少的初始t细胞的老年受试者中的有效性较低。
[0040]
可以通过不同的途径向受试者施用细菌。例如，可以将细菌全身施用于受试者，例如通过静脉内施用。细菌可以通过直接注射施用于受试者的肿瘤部位。骨髓来源的抑制细胞(mdsc)可用于将减毒的细菌递送至原发性和转移性肿瘤性病变的微环境，其中减毒的细菌从mdsc扩散到肿瘤细胞中(参见例如10)。感染的肿瘤细胞然后成为活化的免疫细胞的靶标。
[0041]
优选地，受试者接受重复施用表达回忆抗原的减毒细菌。例如，施用可以是每天或每隔一天、持续几天直到达到令人满意的治疗结果。
[0042]
如本文所用，“治疗”肿瘤意味着该疾病的一种或多种症状，例如肿瘤本身、其转
移、肿瘤的血管形成或表征该疾病的其它参数被减少、减轻、处于缓解状态或维持缓解状态。“治疗”肿瘤也意味着可以通过治疗消除或减少肿瘤的一个或多个标志。这些标志的非限制性实例包括基底膜和近端细胞外基质的不受控制的降解，内皮细胞迁移、分裂和组织成新的功能性毛细血管，以及这种功能性毛细血管的持续性。优选地，该方法有效地减少肿瘤生长和/或尺寸。
[0043]
如本文所用，减少或预防肿瘤的转移意味着该疾病的任何症状，例如转移、其扩散程度、转移物的血管形成或表征该疾病的其它参数被减少、减轻、收到抑制、处于缓解状态、维持在缓解状态或消除。优选地，该方法有效减少转移。该方法可以降低肿瘤转移的发生率或可能性。
[0044]
该方法可以进一步包括向受试者施用减少骨髓来源的抑制细胞(mdsc)的数量的化学治疗剂。这些化学治疗剂包括例如吉西他滨，维生素a衍生物，阿米洛利，cpg寡脱氧核苷酸(cpg odn)，多西紫杉醇，5-氟尿嘧啶，gw2580，西地那非(sildenafi)和西尼替尼(sinitinib)(3,4)。
[0045]
受试者可以是哺乳动物。在不同的实施方案中，哺乳动物是小鼠，大鼠，猫，狗，马，驴，骡，绵羊，山羊，牛，菜牛(steer)，公牛，家畜，灵长类，猴或优选人。人可以有不同的年龄，例如60岁或年龄更大的人。
[0046]
还提供了包含药学上可接受的载体和表达回忆抗原的减毒细菌的药物组合物。细菌可以是例如其中之一：单核细胞性李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、霍乱弧菌、梭菌和短双歧杆菌中的多种。回忆抗原可以是例如破伤风类毒素、麻疹病毒和脊髓灰质炎病毒中的一种或多种的表位。
[0047]
药学上可接受的载体的实例包括但不限于添加剂溶液-3(as-3)，盐水，磷酸盐缓冲盐水，林格氏溶液，乳酸林格氏溶液，洛克林格氏溶液，克雷布林格氏溶液，哈特曼平衡盐溶液和肝素化柠檬酸钠葡萄糖溶液。所用的药学上可接受的载体可以取决于施用途径。药物组合物可以通过本领域已知的任何方法进行配制用于施用，包括但不限于口服施用，肠胃外施用，静脉内施用，透皮施用，肌内施用，鼻内施用，直接注射到肿瘤部位，以及通过渗透性微型泵施用。
[0048]
还提供了包含表达回忆抗原的减毒细菌的癌症疫苗。细菌可以是例如其中之一：单核细胞性李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、霍乱弧菌、梭菌和短双歧杆菌中的多种。回忆抗原可以是例如破伤风类毒素、麻疹病毒和脊髓灰质炎病毒中的一种或多种的表位。
[0049]
从下面的详细实验将更好地理解本发明。然而，本领域技术人员将容易地理解，所讨论的具体方法和结果仅仅是举例说明在随后的权利要求中更全面地描述的发明。
[0050]
详细实验
[0051]
引言
[0052]
开发李斯特菌构建体，其表达具有儿童回忆抗原破伤风类毒素(tt)、麻疹病毒(mv)和脊髓灰质炎病毒(pv)的免疫显性表位的抗原。在具有针对tt的记忆t细胞的小鼠中用listeria-tt重复免疫接种几乎完全消除了患有转移性乳腺癌的小鼠中的转移，而没有副作用。在患有胰腺癌的小鼠中，listeria-tt联合吉西他滨甚至比单独使用listeria-tt更有效，很可能是因为吉西他滨通过消除骨髓来源的抑制细胞(mdsc)而减少了免疫抑制。
[0053]
listeria-回忆抗原模型的示意图
[0054]
图1提供了listeria-回忆抗原模型的示意图。针对回忆抗原诸如tt的记忆t细胞可以在balb/cbyj小鼠中用人tt疫苗产生。tt蛋白可以被抗原呈递细胞(apc)摄取并呈递给初始t细胞。重复暴露后，初始t细胞将分化成记忆t细胞，其在血液中循环生存。随后，可以将4t1肿瘤细胞注射到乳腺脂肪垫中(这可以在年轻或老年进行)，然后一旦肿瘤可触知就用低剂量的listeria-tt进行频繁免疫。这将激起生命中早期针对tt的记忆t细胞的活化。同时，tt将通过用listeria-tt感染而被递送到肿瘤细胞中，从而导致呈递tt抗原。最后，tt特异性记忆t细胞将迁移到肿瘤细胞，并杀死现在呈现tt表位的4t1肿瘤细胞。
[0055]
方法和结果
[0056]
listeria
at-tt
856-1313
疫苗的开发。如下所述开发listeria-tt疫苗。tt
856-1313
(62kda)以llo启动子(p)的控制下的listeria
at
载体(pgg34)中与截短的李斯特菌溶血素o(llo)(48kda)和用于检测tt蛋白的myc序列的融合蛋白来克隆(图2a)。通过使用抗-myc抗体的蛋白质印迹检测了基于listeria
at
的疫苗分泌的llo-tt
856-1313
蛋白(图2b)。用listeria
at-tt
856-1313
感染4t1肿瘤细胞导致tt蛋白在肿瘤细胞中的表达(图2c)。而且，mv和pv的片段已经克隆到listeria
at
中。小鼠免疫显性的回忆抗原的表位见表1。
[0057]
针对tt
856-1313
蛋白中免疫显性表位产生cd8 t细胞应答。测试tt
856-1313
蛋白是否诱导了针对tt
856-1313
的免疫显性表位的cd8 t细胞应答。为此，balb/cbyj小鼠用tt
856-1313
蛋白和cpg免疫接种三次。在最后一次免疫后两天，将小鼠安乐死，并用tt
856-1313
蛋白内的免疫显性肽gynapgipl
1228-1236
(seq id no：1)再刺激白细胞(7)。cd 8t细胞针对balb/cbyj小鼠血液中的免疫显性t
1228-1236
表位而活化(图3)。
[0058]
listeria
at-tt
856-1313
接种对乳腺癌模型4t1中的转移是高度有效的。测试了listeria
at-tt
856-1313
疫苗针对在4t1模型中转移性乳腺癌的疗效。首先，用tt
856-1313
蛋白和cpg产生了针对免疫显性cd8t细胞表位的记忆t细胞。然后，通过将4t1细胞系注射到乳腺脂肪垫中产生4t1肿瘤和转移，并且在肿瘤大小达到5mm后每隔一天施用listeria
at-tt疫苗接种两周。listeria
at-tt
856-1313
针对转移有很高的疗效(图4)但针对原发性肿瘤并非如此(未示出)。cpg用作佐剂。有趣的是，cpg本身也针对转移有效。发现cpg消除了mdsc(3)。listeria
at
本身也针对转移有效，通过产生ros杀死肿瘤细胞，这证实了早期的研究(12)。然而，cpg+tt/listeria
at-tt
856-1313
的组合是最有效的，即与所有对照组相比，cpg+tt/listeria
at-tt
856-1313
组中转移数显著更低。
[0059]
listeria-tt和吉西他滨对胰腺癌小鼠中的转移和肿瘤是高度有效的。在胰腺癌患者中的李斯特菌回忆抗原的临床试验中，预计患者将用吉西他滨治疗。因此，测试吉西他滨是否影响李斯特菌回忆抗原免疫接种。由于已知吉西他滨用于消除作为免疫抑制的主要原因的mdsc，因此预计吉西他滨可以减少免疫抑制，并且回忆抗原可以更好地完成其工作。
[0060]
李斯特菌在盐水中饥饿30分钟，随后在酵母培养基(保持李斯特菌存活但李斯特菌不复制)中培养60分钟。这种处理允许每天注射107cfu李斯特菌，而不是每天注射104cfu。然后，与吉西他滨(gem)组合测试listeria-tt。用吉西他滨ip(每剂量为1.2mg/300μl，从肿瘤细胞注射后第3天开始，每隔三天)处理胰腺癌小鼠，随后在注射肿瘤细胞后第10天开始listeria-tt ip(每天107cfu持续4天，然后休息3天，接着再注射3次107cfu的listeria-tt)。在第21天将所有小鼠安乐死。在这种高度侵袭性的胰腺癌模型中，未经治疗的小鼠肿瘤细胞注射后第21-28天死亡。吉西他滨和listeria-tt的组合完全消除了转移并几乎完全
消除了原发性肿瘤(图5)。这比乳房肿瘤模型(4t1)中的listeria-tt甚至好得多。结果表明，吉西他滨改善了tt对panc-02肿瘤的影响，而更大量的李斯特菌(10e7代替10e4)完全消除了转移。总之，吉西他滨对listeria-tt具有积极的作用。
[0061]
图6示出了listeria-tt和吉西他滨的组合对晚期胰腺癌的功效。更早的数据显示对早期胰腺癌的影响。
[0062]
图7显示吉西他滨降低了骨髓来源的抑制细胞(mdsc)和肿瘤相关巨噬细胞(tam)群体。两者都强烈抑制t细胞。如表2和表3所示，通过减少这些群体，t细胞应答得到了强烈改善。
[0063]
表2显示用listeria-tt和吉西他滨处理的panc-02小鼠中的t细胞应答。listeria-tt和吉西他滨的t细胞应答远优于单独组。
[0064]
表3显示用listeria-tt和吉西他滨处理的kpc小鼠中的t细胞应答。listeria-tt和吉西他滨的t细胞应答远优于单独组。
[0065]
表4显示listeria-tt和吉西他滨的组合减少由mdsc和tam产生的抑制性细胞因子，并改善了参与t细胞刺激的cd80的表达水平。
[0066]
图8显示了将李斯特菌回忆抗原与吉西他滨(gem)组合的新模型。李斯特菌诱导高水平的活性氧(ros)，而ros降低胞苷脱氨酶(cda)的水平。cda是使吉西他滨失活的酶，并且在癌症患者和荷瘤小鼠中的肿瘤细胞和巨噬细胞中以高水平存在。利用李斯特菌，现在，肿瘤细胞通过李斯特菌引起的ros变得对吉西他滨敏感。图9显示李斯特菌降低hela和panc-1肿瘤细胞中的cda。图10显示为组合治疗开发的免疫操作方案。
[0067]
表1.回忆抗原的片段中的免疫显性cd8表位、mhc单倍型和相应的小鼠品系。
[0068][0069]
括号之间的数字表示氨基酸在抗原中的位置。
[0070]
*cd8表位存在于氨基酸序列内。
[0071]
表2.通过gem体内改善panc-02小鼠的针对listeria-tt的cd4和cd8 t细胞应答。
[0072][0073]
如图7a，患有晚期胰腺癌的panc-02小鼠用一个高剂量和多个低剂量的listeria-tt(lm-tt)和gem进行处理。通过流式细胞术在(共3只小鼠合并的)脾脏中分析t细胞。该实验进行一次。
[0074]
表3.通过gem体内改善kpc小鼠的针对listeria-tt的cd4和cd8 t细胞应答
[0075][0076]
如图7a，患有晚期胰腺癌的kpc小鼠用一个高剂量和多个低剂量的listeria-tt(lm-tt)和gem进行处理。通过流式细胞术在脾脏中分析t细胞。该实验进行一次。
[0077]
表4.panc-02小鼠中mdsc和tam的分析。
[0078][0079]
如图7a，患有晚期胰腺癌的panc-02小鼠用一个高剂量和多个低剂量的listeria-tt(lm-tt)和gem进行处理。通过流式细胞术分析转移物中的mdsc和tam。合并3只小鼠的转移物。该实验进行一次。
[0080]
讨论
[0081]
两个主要问题已经阻碍了癌症免疫治疗的成功。一个问题是癌症疫苗中使用的肿瘤相关抗原(taa)通常是与正常细胞相比在肿瘤细胞中过表达或突变的自身抗原。已经教导，胸腺中的t细胞在生命中的较早期不与自身抗原反应，因此难以诱导对taa的强t细胞应答。另一个问题是大多数癌症患者都是老年人，老年人比年轻人的疫苗反应效率更低。这通常是由于缺乏初始t细胞(仅在年龄较小时产生，并且在生命过程中被使用)，其第一次与新抗原反应并且在重复暴露于相同抗原时负责记忆t细胞的产生。目前没有一种可用疫苗避免了在较大年龄对初始t细胞的需要，并且没有一种疫苗能够通过活减毒细菌将高度免疫原性的回忆抗原直接递送到肿瘤细胞中。
[0082]
本方法通过使用高度免疫原性的回忆抗原来克服癌症疫苗接种中的低免疫原性抗原的问题，并且同时避免了在较大年龄时对初始t细胞的需要。本方法包括将针对高度免疫原性的外源抗原的记忆t细胞重新活化，大多数个体在出现大量初始t细胞的儿童期期间已经暴露于所述抗原，例如破伤风类毒素(tt)，麻疹病毒(mv)，脊髓灰质炎病毒(pv)，以及通过减毒的无毒和非致病性细菌如单核细胞性李斯特菌将这些抗原选择性递送到肿瘤细胞中。这些记忆性t细胞现在将杀死呈递高免疫原性抗原的感染的肿瘤细胞。在以前的研究中，李斯特菌已经用于选择性递送抗肿瘤剂到肿瘤微环境以及转移物和肿瘤的肿瘤细胞中。李斯特菌在正常组织中被免疫系统有效地清除，但在转移物和原发性肿瘤的重度免疫抑制的微环境中则没有被免疫系统有效地清除(10,11)。
[0083]
然而，这种治疗可能不能完全克服免疫抑制。可以通过将listeria-回忆抗原与化
gen virol 76(pt 3):499-508.
[0095]
9.chandra d,jahangir a,quispe-tintaya w,einstein mh,gravekamp c.2013.myeloid-derived suppressor cells have a central role in attenuated listeria monocytogenes-based immunotherapy against metastatic breast cancer in young and old mice.british journal of cancer 108:2281-2290.epub 2013may 2.
[0096]
10.quispe-tintaya w,chandra d,jahangir a,harris m,casadevall a,dadachova e,gravekamp c.2013.nontoxic radioactive listeria(at)is a highly effective therapy against metastatic pancreatic cancer.proc natl acad sci u s a.21；110(21):8668-73,epub 2013apr 22.
[0097]
11.美国专利申请公开号2014/0147379al,公开于may 29,2014,dadachova et al,radiobacteria for therapy of cancer.
[0098]
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