一种抗幽门螺旋杆菌的沉香提取物的制备方法及应用与流程

1.本发明涉及天然产物化学和医药领域，特别涉及一种抗幽门螺旋杆菌的沉香提取物的制备方法及应用。


背景技术：

2.沉香是瑞香科沉香属(aquilaria)植物带有树脂的木材。是名贵的香料，也是名贵的药材，具有行气止痛，温中止呕，纳气平喘之功效。常用于胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆，肾虚气逆喘急，沉香是治疗胃病的特效药。沉香中主要成分是倍半萜类和色酮类化合物，色酮类化合物具有很好的抑制幽门螺旋杆菌的活性，而奇楠沉香中单体化合物2-(2-苯乙基)色酮和单体化合物2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮的含量很大。
[0003]
幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori，以下简称hp)感染是全世界最常见的慢性感染性疾病，影响着全世界大约44亿人口，但流行率有很大的差异。hp可引起多种疾病，包括胃溃疡、十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(malt)和胃癌，国际癌症研究机构将hp列为第一类致癌因子。胃癌是全世界最常见的五大恶性肿瘤之一，也是全球第三位的致死原因。根除幽门螺旋杆菌已被证实可降低胃癌的发生率。
[0004]
近年来，随着对幽门螺旋杆菌的治疗中，出现了难以避免的耐药性。沉香中富含的2-(2-苯乙基)色酮类化合物，对幽门螺旋杆菌具有很好的治疗作用，且不产生耐药性。


技术实现要素：

[0005]
鉴于此，本发明提出一种抗幽门螺旋杆菌的沉香提取物的制备方法，解决上述问题。
[0006]
本发明的技术方案是这样实现的：一种抗幽门螺旋杆菌的沉香提取物的制备方法：包括以下步骤：
[0007]
s1、预处理：选取沉香，将沉香粉碎至20-40目的细粉，得到沉香粉末；
[0008]
s2、加热回流提取：将上述沉香粉末加入体积浓度90-95％的乙醇溶液，加热60-70℃，加热1.5-3h，冷却，过滤，滤液浓缩至无醇，重复提取2-3次，合并混匀再浓缩至无醇，得到浓缩液，
[0009]
s3、分子蒸馏法分离：将上述浓缩液进行分子蒸馏分离，分子蒸馏的真空度为200～250mtorr，分子蒸馏的温度为75～90℃，分子蒸馏的进样速度为1-2ml/s，得到油状物和膏状物。
[0010]
s4、萃取分离：将上述膏状物用正己烷进行超声溶解，得到溶解物，再加入水进行萃取30～50min，静置20-30h，取上层正己烷溶液，过滤减压浓缩，得到提取物浸膏，即为2-(2-苯乙基)色酮类成分。
[0011]
优选地，所述s2中沉香粉末与乙醇溶液溶液的质量体积比g/ml为1:1～3。
[0012]
优选地，所述s4中沉香粉末和正己烷的质量体积比g/l为150:0.3-1。
[0013]
优选地，所述s4中超声溶解的温度为20～40℃，搅拌15～24min。
[0014]
优选地，所述s4中正己烷和水的体积比为1:0.8～1.5。
[0015]
优选地，所述s4萃取压力30～34mpa。
[0016]
优选地，所述s4萃取温度10～20℃。
[0017]
进一步的，一种沉香提取物，由沉香提取物的制备方法制备而成。
[0018]
优选地，所述沉香提取物在抗幽门螺旋杆菌中的应用。
[0019]
优选地，所述沉香提取物在治疗和预防由幽门螺旋杆菌引起的胃部疾病中的应用，包括制成由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃癌及胃溃疡的食品、药品、消字号产品。
[0020]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0021]
本发明通过预处理、加热回流提取、分子蒸馏法分离、萃取分离方法得到沉香提取物，调整沉香粉末和各提取剂之间的配比，经加热回流提取，将沉香中有益成分提取出来，采用分子蒸馏的方式分离，限定分子蒸馏的真空度、温度和进样速度，将沉香浓缩液中特性各异的生物油馏分，膏状物活性成分不易分解、破坏，也能合理收集油状物，将膏状物先超声溶解后进行萃取，在特定的萃取条件下，控制压力，减少溶解物分子间的传质距离，增加溶剂和溶质碱的传质效率，在特定的温度下，促进溶解物分子扩散，提高溶解度，提高萃取率；
[0022]
本发明提取的2-(2-苯乙基)色酮类成分可高效治疗幽门螺旋杆菌，不产生耐药性，且有利于胃液ph值恢复正常，在治疗和预防由幽门螺旋杆菌引起的胃部疾病中的应用，包括制成由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃癌及胃溃疡的食品、药品、消字号产品。
具体实施方式
[0023]
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
[0024]
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025]
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026]
实施例1
[0027]
取海南野生沉香，粉碎至20目细粉，称量500g，加入体积浓度95％乙醇溶液进行回流提取，沉香粉末与乙醇溶液溶液的质量体积比g/ml为1:1，加热温度为60℃，加热时间3h，待冷却后过滤，滤渣重新加入乙醇溶液进行提取，重复2次，合并滤液，减压浓缩至无醇味，得到浓缩液，经分子蒸馏，真空度为200mtorr，温度为75℃，进样速度为1-2ml/s，得到流动性差的膏状物，加入1l正己烷超声溶解，超声溶解的温度为20℃，搅拌15min，得到溶解物，再加入1l的水进行萃取，萃取压力30mpa，温度10℃，萃取时间30min，静置24h，取上层正己烷溶液，过滤后减压浓缩，得到2-(2-苯乙基)色酮类成分浸膏53.8g。
[0028]
实施例2
[0029]
取广东种植奇楠沉香，粉碎至40目细粉，称量300g，加入体积浓度90％乙醇溶液提取，沉香粉末与乙醇溶液溶液的质量体积比g/ml为1:3，加热温度为70℃，加热时间1.5h，待冷却后过滤，重复提取3次，合并滤液再浓缩至无醇味，得到浓缩液，进行分子蒸馏分离，真空度200mtorr，温度为90℃，进样速度为1-2ml/s，得到流动性差的膏状物，加入2l正己烷超声溶解，超声溶解的温度为30℃，搅拌20min，得到溶解物，再加入2l的水进行萃取，萃取压力34mpa，温度15℃，萃取时间50min，静置24h，取上层正己烷溶液，过滤后减压浓缩，得到2-(2-苯乙基)色酮类成分浸膏62.5g。
[0030]
实施例3
[0031]
取越南沉香粉碎至30目细粉，称量500g，加入体积浓度90％乙醇溶液进行回流提取，沉香粉末与乙醇溶液溶液的质量体积比g/ml为1:2，加热65℃，保持2h，冷却过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩至无醇味，得到浓缩液，进行分子蒸馏分离，真空度220mtorr，温度为80℃，进样速度为1-2ml/s，得到流动性差的膏状物，加入2l正己烷超声溶解，超声溶解的温度为40℃，搅拌24min，得到溶解物，再加入2l的水进行萃取，萃取压力32mpa，温度15℃，萃取时间40min，静置24h，取上层正己烷溶液，过滤后减压浓缩，得到2-(2-苯乙基)色酮类成分浸膏75.2g。
[0032]
实施例4
[0033]
取海南种植打洞沉香，粉碎至20目细粉，称量500g，加入体积浓度90％乙醇溶液提取，沉香粉末与乙醇溶液溶液的质量体积比g/ml为1:2，加热65℃，保持2h，冷却过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液再浓缩至无醇味，得到浓缩液，进行分子蒸馏分离，真空度240mtorr，温度为85℃，进样速度为1-2ml/s，得到流动性差的膏状物，加入2l正己烷超声溶解，超声溶解的温度为20℃，搅拌15min，得到溶解物，再加入2l的水进行萃取，萃取压力32mpa，温度20℃，萃取时间40min，静置24h，取上层正己烷溶液，过滤后减压浓缩，得到2-(2-苯乙基)色酮类成分浸膏44.6g。
[0034]
对比例1
[0035]
本对比例与实施例1的区别在于，不进行正己烷萃取分离，其余按照实施例1方法进行处理，具体如下：
[0036]
取实施例1的海南沉香，称量500g，加入体积浓度95％乙醇溶液进行回流提取，沉香粉末与乙醇溶液溶液的质量体积比g/ml为1:1，加热温度为60℃，加热时间3h，待冷却后过滤，滤渣重新加入乙醇溶液进行提取，重复2次，合并滤液，减压浓缩至无醇味，得到浓缩液，经分子蒸馏，真空度为200mtorr，温度为75℃，进样速度为1-2ml/s，得到流动性差的膏状物，即为沉香提取物，得到2-(2-苯乙基)色酮类成分浸膏48.9g。
[0037]
对比例2
[0038]
本对比例与实施例2的区别在于，不进行分子蒸馏分离，其余与实施例2方法一致，具体如下：
[0039]
取与实施例2的广东种植奇楠沉香，称量300g，加入体积浓度90％乙醇溶液提取，沉香粉末与乙醇溶液溶液的质量体积比g/ml为1:3，加热温度为70℃，加热时间1.5h，待冷却后过滤，重复提取3次，合并滤液再浓缩至无醇味，得到浓缩液，加入2l正己烷超声溶解，超声溶解的温度为30℃，搅拌20min，得到溶解物，再加入2l的水进行萃取，萃取压力34mpa，温度15℃，萃取时间50min，静置24h，取上层正己烷溶液，过滤后减压浓缩，得到2-(2-苯乙基)色酮类成分浸膏119.4g。
[0040]
对比例3
[0041]
本对比例与实施例3的区别在于，不进行正己烷萃取分离，其余按照实施例3方法进行处理，具体如下：
[0042]
取越南沉香粉碎至30目细粉，称量500g，加入体积浓度90％乙醇溶液进行回流提取，沉香粉末与乙醇溶液溶液的质量体积比g/ml为1:2，加热65℃，保持2h，冷却过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩至无醇味，得到浓缩液，进行分子蒸馏分离，真空度220mtorr，
温度为80℃，进样速度为1-2ml/s，得到流动性差的膏状物，即得到2-(2-苯乙基)色酮类成分浸膏86.7g。
[0043]
对比例4
[0044]
本对比例与实施例4的区别在于，不进行分子蒸馏分离，其余与实施例4方法一致，具体如下：
[0045]
取实施例4的沉香，粉碎至20目细粉，称量500g，加入体积浓度90％乙醇溶液提取，沉香粉末与乙醇溶液溶液的质量体积比g/ml为1:2，加热65℃，保持2h，冷却过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液再浓缩至无醇味，得到浓缩液，加入2l正己烷超声溶解，超声溶解的温度为20℃，搅拌15min，得到溶解物，再加入2l的水进行萃取，萃取压力32mpa，温度20℃，萃取时间40min，静置24h，取上层正己烷溶液，过滤后减压浓缩，得到2-(2-苯乙基)色酮类成分浸膏65.5g。
[0046]
一、沉香提取物成分检测
[0047]
采用hplc-ms对实施例1-4和对比例1-3的所得的沉香提取物进行测试，具体测试条件如下，测试结果见表1。
[0048]
液质色谱条件：dionex-acclaim 120c
18
色谱柱，流动相a为乙腈，流动相b为0.5％甲酸水溶液，洗脱梯度程序：0～60min，25％～55％a，60～80min，55％～80％a，80～90min，80％～100％a，90～95min，100％a；流速0.4mlmin-1
，检测波长254nm。
[0049]
表1沉香提取物成分检测结果
[0050][0051]
根据表1检测结果可知，实施例1-4中2-(2-苯乙基)色酮类化合物相对含量均超过80％，对比例提取方法不同，未达到80％的要求。
[0052]
二、抑菌性能
[0053]
1.菌落培养条件：微氧条件：5％o2、10％co2、85％n2，恒温37℃培养。
[0054]
2.抑制样品的制备：
[0055]
设置实验组(实施例1-4和对比例1-4)、空白对照组和阳性对照组。
[0056]
具体地，实验组取1ml沉香提取物与1ml脑心浸液体培养基混合；空白组为1ml去离子水与1ml脑心浸液体培养基混合；阳性对照组为1ml药液(艾司奥美拉唑20mg，阿莫西林1g，枸橼酸铋钾220mg，克拉霉素0.5g溶解于1毫升去离子水中)和1ml脑心浸液体培养基混合。
[0057]
3.实验：
[0058]
从-80℃冰箱中将冻存的幽门螺旋杆菌取出，室温解冻。轻轻吹打均匀后，分别吸取300μl加入预先制备好实验组、空白对照和阳性对照组，每组均设置三个平行试验，置三气培养箱中培养3d。3天后，每瓶取100μl菌液进行梯度稀释(10-4
、10-5
、10-6
稀释度)，每个稀释度取100μl菌液接种于羊血琼脂培养基中央，涂布棒均匀涂布整个平板。置三气培养箱中微需氧条件下培养3d，3d后取10-6
稀释度下，单菌落在30～300之间的平板进行菌落计数，三组平行试验计算平均值，统计结果见下表2。
[0059]
表2样品处理后的幽门螺旋杆菌的生长情况
[0060]
样品菌落数样品菌落数样品菌落数实施例10*，**对比例1170**空白对照260实施例20*，**对比例2230**阳性对照组0实施例310*，**对比例3180**
ꢀꢀ
实施例430*，**对比例4220**
ꢀꢀ
[0061]
*与空白对照比较，有显著性差异(p＜0.05)；
[0062]
**与阳性对照比较，有显著性差异(p＜0.01)。
[0063]
由表3可知，实施例1-4与空白和阳性对照组均具有显著性差异，具有很好的抑制幽门螺旋杆菌的效果，而对比例1-4抑制效果很差，因其提取方法不同，浸膏中2-(2-苯乙基)色酮类化合物含量不达标导致效果不佳。说明2-(2-苯乙基)色酮类化合物含量对其抑制幽门螺旋杆菌的影响非常大。
[0064]
三、临床试验
[0065]
随机将因幽门螺旋杆菌引起的胃炎的28例患者分为治疗组和对照组。治疗组14例，其中男性9例，女性5例，最小年龄22岁，最大年龄78岁，平均年龄44岁。对照组14例，其中男性8例，女性6例，最小年龄23岁，最大年龄80岁，平均年龄43.5岁。
[0066]
1.治疗方法：
[0067]
治疗组：给予实施例2的奇楠沉香提取物，每次3g，每日3次，疗程14d。
[0068]
对照组：按照现有的三联疗法给药：阿莫西林胶囊1g bid，克拉霉素0.5g bid，兰索拉唑肠溶片30mg qd，疗程14d。
[0069]
2.结果评价：检测幽门螺旋杆菌；抽取适量胃液检测ph值，正常胃液ph范围0.9～1.8，本研究将ph＜3.5归为基本正常，3.5～7.0归为低酸，＞7.0归为无酸。
[0070]
3.治疗结果
[0071]
治疗组和对照组在治疗14d后检测幽门螺旋杆菌均呈阴性。治疗后胃液检测ph值结果如下表3。
[0072]
表3两组患者治疗前后胃液ph值情况表
[0073][0074]
治疗结果标明，治疗组和对照组均能治疗因幽门螺旋杆菌导致的胃炎，但经治疗组治疗的患者，治愈后胃液ph值90％((13-3)/(9+2))以上均能恢复正常，而经对照组治疗的患者，82％((8+1)/(8+3))的患者胃液ph值没有得到恢复。慢性萎缩性胃炎患者随着胃黏膜病变程度的加重，胃酸分泌呈现持续性下降的趋势，同时幽门螺旋杆菌感染会影响胃液ph水平。ph值恢复正常，会大大降低复发率，说明治疗组比对照组效果更好。
[0075]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。