紫檀茋在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用的制作方法

1.本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及紫檀茋在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用。


背景技术：

2.嗜水气单胞菌是严重威胁淡水水产养殖业健康发展的主要致病菌之一，是池塘养殖的恶性病害，常导致养殖鱼类细菌性败血症等疾病，在水产养殖环境中分布广泛。嗜水气单胞菌是一种人-兽-鱼共患病原菌，能导致陆生动物和人的各种感染。此外，嗜水气单胞菌还可通过受污染的水、未煮熟的水产品等途径感染人类，因此也被认为是一种食源性病原菌。水产养殖中嗜水气单胞菌病主要依靠抗生素进行治疗，如恩诺沙星、氟苯尼考等。但由于药物的不合理使用导致的细菌耐药性的出现，导致了治疗效果下降甚至治疗失败。此外，抗生素的使用在鱼体内蓄积，对水产品质量安全和人类健康有潜在威胁。因此，从天然化合物中筛选直接抑制嗜水气单胞菌致病力的药物成为近年来的研究热点，所筛选到的药物又称为抗毒力药物。抗毒力药物主要针对于病原菌的毒力因子，不会对病原菌的生存产生选择性压力，因此不易产生耐药性。气溶素是嗜水气单胞菌的主要毒力因子，与其致病力密切相关，因此气溶素成为研究抗嗜水气单胞菌感染药物的靶标。
3.紫檀为豆科植物紫檀的心材，分布于我国福建、广东等地。紫檀味咸、性平，归肝经，具有祛瘀和营，止血定痛，解毒消肿的功效，主要用于治疗头痛，心腹痛，恶露不尽，小便淋痛，风毒痈肿，金疮出血等疾病。紫檀茋是紫檀的主要化学成分之一，又被称为紫檀芪，具有抗氧化、抗癌、抗炎和抗真菌等生物学活性。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供了紫檀茋在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用，紫檀茋通过直接抑制气溶素活性、生物被膜形成和群体感应抑制嗜水气单胞菌的体内外致病力，但对嗜水气单胞菌的生长没有任何影响。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.紫檀茋在制备抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染的药物或添加剂中的应用：经试验证明，发现紫檀茋在0～16μg/ml之间对嗜水气单胞菌的生长无抑制作用；但当紫檀茋浓度达到2μg/ml及以上时，可显著抑制气溶素的表达和生物被膜的形成；紫檀茋浓度在2μg/ml及以上时，可显著抑制纯化气溶素的活性；通过荧光定量pcr试验，发现紫檀茋浓度在16μg/ml时可显著抑制群体感应相关基因ahyi和ahyr以及气溶素编码基因aera的转录；寡聚化试验发现，紫檀茋可抑制气溶素七聚体的形成，进而抑制其活性；通过建立斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌模型发现，口灌25mg/kg的紫檀茋可显著提高斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型的存活率。
7.紫檀茋是主要提取自中药紫檀或水果中的蓝莓、葡萄等，对动物和人的安全性较高，可作为药物或饲料添加剂用于预防和治疗水产养殖动物的嗜水气单胞菌感染。
8.与现有技术相比，本发明具有以下优点及效果：紫檀茋是一种来源于植物的天然化合物，无毒副作用，环境友好，可减少化学抗菌药物在水产养殖中的使用，有利于降低水产品中化学抗菌药物的残留及其对环境微生物的影响。此外，紫檀茋仅降低嗜水气单胞菌的毒力，但对其生长无显著抑制作用，因此由紫檀茋造成的选择性压力较低，不易产生耐药性。
附图说明
9.图1为紫檀茋对嗜水气单胞菌生长的影响。
10.图2a为紫檀茋对嗜水气单胞菌培养物上清液溶血活性的影响。
11.图2b为紫檀茋对纯化气溶素溶血活性的抑制作用。
12.图3为紫檀茋对嗜水气单胞菌生物被膜形成的影响。
13.图4为紫檀茋对嗜水气单胞菌培养物上清液中气溶素含量的影响。
14.图5为紫檀茋对相关基因表达的影响。
15.图6为紫檀茋对气溶素七聚体形成的抑制作用。
具体实施方式
16.实施例1：紫檀茋对嗜水气单胞菌生长的影响。
17.本发明所涉及的嗜水气单胞菌168菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。将168菌株在lb液体培养基中培养至对数生长前期(od
600nm
＝0.3，28℃)，将培养好的菌分装至6个50ml的锥形瓶中，每瓶20ml，分别加入不同浓度(0、2、4、8、16和32μg/ml)的紫檀茋(四川省维克奇生物科技有限公司，wkq-0039373)，28℃条件下继续培养5h，每30min取菌液测定一次od
600nm
的吸收值。图1所示为不同浓度紫檀茋与嗜水气单胞菌168菌株共培养的生长曲线，从图中可以看出紫檀茋在2-16μg/ml浓度下对嗜水气单胞菌的生长没有影响，但32μg/ml可抑制嗜水气单胞菌的生长。
18.实施例2：紫檀茋对嗜水气单胞菌上清液溶血活性的影响
19.本发明所涉及的嗜水气单胞菌168菌株为长江水产研究所保存。将嗜水气单胞菌168在lb液体培养基中培养过夜。次日按1：100的体积比转接至200ml新鲜的lb液体培养基中，继续培养至od
600nm
约为0.3时分装为5瓶，加入紫檀茋使其浓度达到0、2、4、8、16μg/ml。继续培养至od
600nm
为1.5时收集菌液，12000rpm离心1min取上清测定上清液的溶血活性。如图2a所示，随着紫檀茋浓度的增加上清液的溶血作用逐渐减弱，呈剂量依赖性。当紫檀茋浓度在2μg/ml及以上浓度时可显著抑制嗜水气单胞菌培养物上清液的溶血活性。
20.实施例3：紫檀茋对纯化气溶素溶血活性的抑制作用
21.本发明所涉及的气溶素由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室制备并保存。向1.5ml的离心管中加入975μl的溶血缓冲液，2μl纯化的气溶素，再加入不同量的紫檀茋母液使其终浓度为2、4、8、16μg/ml，设置不加药物的阴性对照，放与37℃恒温培养箱中反应15min，每管再加入25μl(5
×
106个/ml)的脱纤维绵羊红细胞，放入37℃恒温培养箱中反应15min。反应结束后，12000
×
g离心1min，取上清在od
543nm
处测定吸收值。以加0.1％triton x-100组为阳性对照(100％溶血组)。如图2b所示，紫檀茋能剂量依赖性的降低纯化气溶素的溶血活性，当紫檀茋浓度在2μg/ml及以上浓度时可显著抑制气溶素的溶血
活性。
22.实施例4：紫檀茋对嗜水气单胞菌生物被膜形成的抑制作用
23.挑取嗜水气单胞菌168单菌落接种于bhi液体培养基中，在28℃，180rpm条件下震荡培养至od600nm＝1.0后，用含2％葡萄糖的bhi(青岛海博生物技术有限公司，hb8297-5)液体培养基将菌液稀释10倍，加入至96孔板中，每孔反应体系200μl，紫檀茋终浓度为2、4、8、16μg/ml，设置只含培养基的阴性对照组以及含培养基和菌液的阳性对照组。在28℃培养箱恒温培养24h后取出，弃去液体，pbs洗3次放入烘箱，烘干后每孔加入200μl的0.5％结晶紫，37℃反应0.5h，弃去液体洗掉多余的结晶紫，烘干后加入30％的冰醋酸，每孔200μl，待底部固体溶解后，用酶标仪在570nm处测得吸光值，每组试验重复3次。如图3所示，紫檀茋可剂量依赖性地降低嗜水气单胞菌生物被膜的形成。
24.实施例5：紫檀茋对嗜水气单胞菌培养物上清液中气溶素含量的影响
25.取20μl实施例2中的上清液加入适量的制样缓冲液后在沸水中煮8min制样，取出后高速离心1min。取10μl样品加入sds-page胶中，进行电泳检测。电泳结束后取出蛋白胶，通过半干转印仪将蛋白转印至pvdf膜上。采用5％脱脂奶粉将未结合的膜位点进行封闭，然后加入抗气溶素多克隆抗体(本实验室保存)孵育1h，pbs洗涤3遍后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(武汉鼎国生物公司)，继续孵育1h后洗涤3次，加入ecl发光液反应3min后在化学发光仪上检测目的条带。如图4所示，紫檀茋可剂量依赖性地降低上清液中气溶素的含量，结合实施例2、4推测紫檀茋可能通过抑制群体感应降低气溶素表达和生物被膜形成。
26.实施例6：紫檀茋对aera、ahyi和ahyr基因转录的影响
27.本发明所涉及的嗜水气单胞菌168菌株为长江水产研究所保存。将嗜水气单胞菌168菌株在lb液体培养基中培养至对数生长前期(od
600nm
＝0.3，28℃)，将培养菌分别置于2个50ml的锥形瓶中，每瓶20ml菌液，分别加入浓度为16和0μg/ml的紫檀茋，28℃条件下继续培养至od
600nm
至1.5时高速离心(8000
×
g，1min)收集菌体。菌体采用天根细菌总rna提取试剂盒提取菌体rna，采用takara rna pcr kit(amv)试剂盒合成cdna，sybr premix ex taq试剂盒进行荧光定量pcr试验，通过δδct法分析aera、ahyi和ahyr基因的表达水平，以16s rrna作为内参。试验中使用的引物由上海生工公司合成，序列见表1。如图5所示，当紫檀茋浓度为16μg/ml时aera、ahyi和ahyr基因分别下调了8.54、10.1、4.98倍。该结果提示，紫檀茋可通过抑制群体感应减少生物被膜形成和气溶素的表达。
28.表1荧光定量pcr的引物序列
[0029][0030][0031]
实施例7：紫檀茋对气溶素七聚体形成的影响
[0032]
将活化后的气溶素与紫檀茋以活性溶血试验中相同的摩尔比混合，体积为20μl，室温反应15min，再加入hepes以诱导寡聚化试验，室温下放置1h，加入上样缓冲液100℃水浴10min，用8％的sds-page进行凝胶电泳试验。加入染色液摇床上摇动2h进行染色，再加入脱色液在摇床上摇动2-3h，洗涤干净后拍照。如图6所示，随着紫檀茋浓度增加，七聚体逐渐减少，表明紫檀茋通过抑制气溶素七聚体的形成降低其溶血活性。
[0033]
实施例8：紫檀茋对斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型的治疗作用
[0034]
本发明所涉及的嗜水气单胞菌168菌株为长江水产研究所保存。斑点叉尾鮰来自长江水产研究所渔药临床试验中心。90尾健康斑点叉尾鮰分别置于3个200l的玻璃缸中，每组20尾，保持水温为28℃，溶氧5.5-5.7mg/l，攻毒前暂养7d。嗜水气单胞菌168菌株在lb培养基中培养至对数生长中期(od
600nm
＝1.0)，将菌液离心，菌体用无菌pbs洗涤2次后用麦氏比浊管重悬至1.5
×
108cfu/ml，阳性对照组和治疗组每条鱼腹腔注射200μl稀释好的菌液，阴性对照组腹腔注射200μl无菌pbs。治疗组于感染后6h后口灌25mg/kg的紫檀茋，每12h一次，连续给药三天，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。如表2所示，斑点叉尾鮰感染嗜水气单胞菌不给予药物治疗在8d内死亡率为90％，给予25mg/kg的紫檀茋治疗后死亡率为43.43％，阴性对照组试验期间未出现死亡。以上结果表明，紫檀茋可用于治疗斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染，其剂量为25mg/kg，每12h给药一次，连用3天。
[0035]
表2紫檀茋治疗斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型后的死亡率
[0036][0037]
通过实施例1发现，紫檀茋在2-16μg/ml浓度下对嗜水气单胞菌的生长没有影响，提示其在应用过程中不会对嗜水气单胞菌产生选择性压力，与传统抗生素不同，不会诱导病原菌产生耐药性。进一步通过实施例2和3发现，紫檀茋对与嗜水气单胞菌共培养物上清液和纯化气溶素的溶血活性有抑制作用且呈剂量依赖性，提示紫檀茋可抑制气溶素的活性或表达。通过实施例5发现，紫檀茋对共培养物上清液中气溶素的含量有抑制作用，结合实施例2和3初步得出结论，紫檀茋既可以抑制气溶素表达又可以直接降低其活性。通过实施例4发现紫檀茋对生物被膜有抑制作用，结合实施例2提示该药物可能作用于群体感应，并通过实施例6进行了确证。此外，通过实施例7发现紫檀茋可通过抑制气溶素形成功能性七聚体导致其失去活性。由于气溶素、生物被膜均与嗜水气单胞菌的致病力密切相关，通过以上实施例提示紫檀茋可通过抑制毒力降低嗜水气单胞菌的体内致病力，实施例8建立了斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型，发现口灌25mg/kg紫檀茋可显著降低斑点叉尾鮰感染嗜水气单胞菌的死亡率，表明紫檀茋可作为预防或治疗嗜水气单胞菌感染的药物或添加剂。
[0038]
嗜水气单胞菌是淡水养殖的常见病原菌，能感染多数淡水养殖动物，如小龙虾、鲫
鱼、黄颡鱼等。现有研究发现，气溶素是嗜水气单胞菌的主要毒力因子，可通过抑制其活性或调控达到控制嗜水气单胞菌致病力的目的，该方法普遍适用于不同来源的嗜水气单胞菌。因此可推断，紫檀茋对水产养殖动物嗜水气单胞菌感染均具有预防或治疗作用。