一种难溶性药物芽孢复合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种难溶性药物芽孢复合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.据统计，目前市售的各种药物中，约有40％以上是难溶性药物。而处于研发阶段不溶性药物更是达到90％。难溶性药物吸收差、生物利用率低，极大的限制了药物制剂的开发及其临床应用。虽然可以通过微粉化、固体分散体、助溶、共沉淀、使用表面活性剂、超声结晶、减小粒径、微乳、纳米混悬液、低温技术等方法提高水难溶性药物的溶解性。但口服给药作为最优选择的、广泛的给药途径。开发口服给药制剂，不仅需要增加药物的溶解性，还需要保护其不受胃酸环境的破坏，增加其吸收，从而多方面提高难溶性药物的口服生物利用度。利用现在制剂学手段提高难溶性药物的溶解度和口服生物利用度，进一步开发其临床应用价值，是药学工作者面临的主要挑战之一。
3.芽孢作为益生菌的休眠生命形式，是生物学中最持久的静态结构之一，可耐受较强的酸碱环境、有毒化学成分、电离辐射、蛋白酶、溶菌酶及表面活性剂等，能够有效抵抗恶劣环境的损伤。芽孢表面被一层厚厚的疏水性蛋白外壳包裹，可通过物理或化学手段负载药物，并保护负载的药物不受恶劣胃环境影响。进入肠道后，芽孢可迅速摄取水分及营养物质萌发，重新生成营养细胞，同时伴随大量载药疏水性蛋白的脱落。芽孢疏水性蛋白可以药物通过疏水作用形成纳米药物，并促进药物转运进入基底层，提高药物的生物利用度。芽孢成长为营养细胞以后，可通过多种途径调节肠道菌群稳态。
4.肠道作为人体最大的免疫器官，已被证实与其他重要器官的健康紧密关联。肠道菌群与近80％的慢性病有关，而且通过“脑-肠轴”、“肠-肝轴”、“肠-心轴”、“肠-皮肤轴”和“肠-肺轴”等影响远端器官的功能。芽孢萌发生长成益生菌以后，可对肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌产生促进作用；对葡萄球菌、白色念珠菌等致病菌产生拮抗作用。此外，益生菌代谢产物也具有调节肠道菌群，维持肠道微生态平衡的作用，从而增加各种药物的治疗效果。例如，丁酸梭菌产生的丁酸盐作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，在大鼠缺血性脑卒中模型中表现出抗炎和神经保护作用，并且可以减少脑梗死体积以改善短期和长期的神经功能。此外，丁酸盐还通过激活g蛋白偶联受体gpr41，增加磷脂酰肌醇-3-激酶(pi3k)的表达并促进蛋白激酶b(akt)的磷酸化，从而减弱大脑中动脉闭塞后小鼠的神经元凋亡，以改善预后。


技术实现要素：

5.为解决难溶性药物分散性差、生物利用度低的问题，本发明提供一种难溶性药物芽孢复合物及其制备方法。本发明所述复合物以益生菌芽孢作为难溶性药物的保护剂、增溶剂，能够有效降低胃酸对药物的破坏作用，提高难溶性药物口服生物利用度，为难溶性药物口服制剂开发提供了新的技术支持。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明提供一种难溶性药物芽孢复合物，其包括难溶性药物和益生菌芽孢；难溶性药物与芽孢的质量比为1:1-10。
8.作为优选，所述益生菌芽孢包括但不仅限于丁酸梭菌芽孢、凝结杆菌芽孢、地衣杆菌芽孢、酪酸梭菌芽孢和枯草杆菌芽孢。
9.作为优选，所述难溶性药物包括但不仅限于丁苯酞和柳氮磺吡啶。抗炎药、抗肿瘤药、降糖药、心脑血管疾病治疗药、呼吸系统疾病治疗药、神经系统疾病治疗药中难溶性药物均可。
10.作为优选，所述的难溶性药物芽孢复合物中难溶性药物的包封率为2％-80％。
11.本发明还提供所述难溶性药物芽孢复合物的制备方法，其包括以下步骤：
12.益生菌芽孢的提取：将对数生长期的产芽孢益生菌接种于产孢培养基进行芽孢培养，培养结束后收集菌液于70-80℃条件下加热30-45min，冷却至室温后离心，收集沉淀，将所得沉淀用氯化钠溶液洗涤后，再用超纯水分散、冻干，得冻干粉；
13.将难溶性药物溶于乙醇或甲醇中，得溶液a；准确称取以上所得冻干粉，用乙醇或甲醇分散后，加入溶液a，搅拌6-12h；搅拌结束后进行离心，收集沉淀；将沉淀用乙醇洗涤，离心后收集沉淀即得。
14.作为优选，所用氯化钠溶液的质量浓度为0.85％-0.90％。
15.本发明还提供所述难溶性药物芽孢复合物，所述方法制备得到的难溶性药物芽孢复合物在制备口服药中的应用。
16.作为优选，所述口服药剂型包括以下任意一种：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂和丸剂。
17.与现有技术相比，本发明具有以下优势：
18.本发明所述复合物以益生菌芽孢作为难溶性药物的保护剂、增溶剂，能够有效降低胃酸对药物的破坏作用，提高难溶性药物口服生物利用度，并通过肠—x轴增强其疗效。首先，芽孢表面通过物理或化学手段负载药物，并保护负载的药物不受恶劣胃环境影响。其次，进入肠道后，芽孢可迅速摄取水分及营养物质萌发，重新生成营养细胞，同时伴随大量载药疏水性蛋白的脱落。再次，芽孢疏水性蛋白可以药物通过疏水作用形成纳米药物，并促进药物转运进入基底层，提高药物的生物利用度。最后，芽孢成长为营养细胞以后，可通过多种途径调节肠道菌群稳态。
19.本发明所述的难溶性药物芽孢复合物制备方法简单、生产费用低，性质稳定，为提高难溶性药物分散性和生物利用率提供了新的技术支持，有巨大的经济和社会效益。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
21.图1是本发明提取所得丁酸梭菌芽孢的tem图；
22.图2是本发明提取所得凝结杆菌芽孢的tem图；
23.图3是本发明实施例1中nbp,bc spore，bc spore@nbp紫外可见吸收光谱图；
24.图4是本发明实施例2中ssz，bc spore，bc spore@ssz紫外可见吸收光谱图；
25.图5是本发明实施例3中nbp，cb spore@nbp紫外可见吸收光谱图；
26.图6为本发明实施例4中所述柳氮磺吡啶凝结杆菌芽孢复合物在水溶液中的溶解状态：a图为柳氮磺吡啶在水溶液中的状态；图b为柳氮磺吡啶凝结杆菌芽孢复合物在水溶液中的溶解状态。
具体实施方式
27.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
28.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”、“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作以及它们的组合。
29.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
30.实施例1
31.丁苯酞凝结杆菌芽孢复合物的制备，包括如下步骤：
32.(1)凝结杆菌芽孢的提取：对数生长期的凝结芽孢杆菌以1％的比例接种于产孢培养基(牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，nacl 0.5％，0.005％mnso4·
h2o)中，置于37℃的恒温震荡培养箱中培养72h，收集菌液置于80℃环境中加热30min，然后静止至室温。12000r/min条件下离心10min，所得沉淀用0.85％的氯化钠溶液洗涤3次，所得芽孢使用超纯水分散，冻干备用。
33.(2)丁苯酞凝结杆菌芽孢复合物的制备：精密称取凝结芽孢冻干粉4mg，加4ml无水乙醇，适当超声并涡旋使其分散均匀。精密称取丁苯酞(nbp)4mg，加无水乙醇溶解，得到浓度为1mg/ml的nbp溶液。吸取上述的芽孢冻干粉溶液4ml于玻璃瓶中，滴加上述nbp溶液4ml，室温下搅拌6h。搅拌完毕后，10000rpm离心5min，保留沉淀，再加入适量的无水乙醇洗两遍，10000rpm离心5min，沉淀即为丁苯酞凝结杆菌芽孢复合物，命名为：bc spore@nbp。nbp,bc spore，bc spore@nbp紫外可见吸收光谱图如图3所示。
34.该复合物中丁苯酞包封率为30.7％。
35.实施例2
36.柳氮磺吡啶凝结杆菌芽孢复合物的制备，包括如下步骤：
37.(1)凝结杆菌芽孢的提取：对数生长期的凝结芽孢杆菌以1％的比例接种于产孢培养基(牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，nacl 0.5％，0.005％mnso4·
h2o)中，置于37℃的恒温震荡培养箱中培养72h，收集菌液置于80℃环境中加热30min，然后静止至室温。12000r/min条件下离心10min，所得沉淀用0.85％的氯化钠溶液洗涤3次，所得芽孢使用超纯水分散，冻干备用。
38.(2)柳氮磺吡啶凝结杆菌芽孢复合物的制备：精密称取凝结芽孢冻干粉5mg，加4ml
无水乙醇，适当超声并涡旋使其分散均匀。精密称取柳氮磺吡啶(ssz)5mg，加无水乙醇溶解，得到浓度为1.25mg/ml的ssz溶液。吸取上述的芽孢冻干粉溶液4ml于玻璃瓶中，滴加上述ssz溶液4ml，室温下搅拌3h。搅拌完毕后，10000rpm离心5min，保留沉淀，再加入适量的无水乙醇洗两遍，10000rpm离心5min，沉淀即为柳氮磺吡啶凝结杆菌芽孢复合物，命名为bc spore@ssz。ssz，bc spore，bc spore@ssz紫外可见吸收光谱图如图4所示。
39.该复合物中柳氮磺吡啶包封率为16.5％。
40.实施例3
41.丁苯酞丁酸梭菌芽孢复合物的制备，包括如下步骤：
42.(1)丁酸梭菌芽孢的提取：丁酸梭菌芽孢的提取：对数生长期的丁酸梭菌以1％的比例接种于产孢培养基(脑浸出液粉3.85％，0.005％mnso4·
h2o)中，放入密封培养袋中，加入厌氧产气袋，置于37℃的恒温震荡培养箱中静置培养72h，收集菌液置于80℃环境中加热30min，然后静止至室温。12000r/min条件下离心10min，所得沉淀用0.85％的氯化钠溶液洗涤3次，所得芽孢使用超纯水分散，冻干备用。
43.(2)丁苯酞丁酸梭菌芽孢复合物的制备：精密称取凝结芽孢冻干粉4mg，加4ml无水乙醇，适当超声并涡旋使其分散均匀。精密称取丁苯酞(nbp)4mg，加无水乙醇溶解，得到浓度为1mg/ml的nbp溶液。吸取上述的芽孢冻干粉溶液4ml于玻璃瓶中，滴加上述nbp溶液4ml，室温下搅拌6h。搅拌完毕后，10000rpm离心5min，保留沉淀，再加入适量的无水乙醇洗两遍，10000rpm离心5min，沉淀即为丁苯酞丁酸梭菌芽孢复合物，命名为cb spore@nbp。nbp，bc spore，cb spore@nbp紫外可见吸收光谱图，如图5所示。
44.该复合物中丁苯酞包封率为29.6％。
45.实施例4
46.柳氮磺吡啶凝结杆菌芽孢复合物的制备，包括如下步骤：
47.(1)凝结杆菌芽孢的提取：对数生长期的凝结芽孢杆菌以1％的比例接种于产孢培养基(牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，nacl 0.5％，0.005％mnso4·
h2o)中，置于37℃的恒温震荡培养箱中培养72h，收集菌液置于80℃环境中加热30min，然后静止至室温。12000r/min条件下离心10min，所得沉淀用0.85％的氯化钠溶液洗涤3次，所得芽孢使用超纯水分散，冻干备用。
48.(2)柳氮磺吡啶凝结杆菌芽孢复合物的制备：精密称取凝结芽孢冻干粉5mg，加4ml无水乙醇，适当超声并涡旋使其分散均匀。精密称取柳氮磺吡啶(ssz)2mg，加无水乙醇溶解，得到浓度为0.5mg/ml的ssz溶液。吸取上述的芽孢冻干粉溶液4ml于玻璃瓶中，滴加上述ssz溶液4ml，室温下搅拌7h。搅拌完毕后，10000rpm离心5min，保留沉淀，再加入适量的无水乙醇洗两遍，10000rpm离心5min，沉淀即为柳氮磺吡啶凝结杆菌芽孢复合物；
49.精密称取柳氮磺吡啶2mg于ep管中，加超纯水2ml，用移液枪吹打均匀后，10000rpm离心5min，有橙色沉淀，取上清测吸光度。a359 nm＝0.249，经计算得上清中柳氮磺吡啶的浓度为6.64μg/ml。将实施例4制备所得凝结杆菌芽孢柳氮磺吡啶复合物分散于2ml水溶液中，测得柳氮磺吡啶浓度为322.7μg/ml，如图6所示。显然，将难溶性药物与益生菌芽孢复合，可显著增加难溶性药物的溶解度。
50.该复合物中柳氮磺吡啶包封率为32.3％。
51.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的
限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。