一种协同稳定的透明质酸钠复合溶液组合物及其制剂的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及透明质酸钠及其水解酶抑制剂，具体涉及一种含有透明质酸酶抑制剂的协同稳定的透明质酸钠复合溶液组合物及其制剂。


背景技术：

2.水光针美容是一种注射类的护肤疗法，注射时要借助专门的仪器“水光枪”，将需要的美容针剂注射到紧贴表皮下的真皮层，注射后能让皮肤变得水润，光亮而得名。水光注射不止可以改善皮肤干燥和皮肤弹力下降而引起的眼角皱纹、嘴角皱纹、颈纹等皮肤问题，还能让皮肤变得日渐滋润富含水分。水光注射的主要目的是补充透明质酸，透明质酸本身是一种构成人体的天然物质，所以对人体没有副作用和排斥反应。随着年龄的增长，人体内的透明质酸的含量会流失，有研究资料显示，同20～30岁的肌肤相比，30～40岁时人体透明质酸的含量是75%，40岁以上只有60%。透明质酸流失会使皮肤老化，皮肤弹力下降，产生细纹，而注入透明质酸可以提升水分保持能力，使皮肤滋润透亮，对皮肤保湿有重要作用。
3.水光注射的透明质酸进入真皮层后，与细胞发生水合作用，促进血液微循环以及皮肤对营养物质的吸收，但是其自身也会不断地被稀释和吸收，因此，水光注射所能维持的时间是有限的。一般来说，第一次注射后维持的时间较短，约维持1～2个月左右，连续进行三次水光注射后，效果可以维持1年左右；但根据个人体质、肤质、生活习惯的不同其维持时间也会有所差异，肤质干燥、疏于保养的人，水光直注射的效果维持的时间较短，约3个月左右。
4.现如今，市面上的水光产品主要成分多为透明质酸钠，其化学式为(c
14h20
no
11
na)n，化学结构如图1所示。透明质酸钠是人体内一种固有的成分，是一种葡聚糖醛酸，且没有种属特异性；它广泛存在于胎盘、羊水、晶状体、关节软骨、皮肤真皮层等组织，器官中它分布在细胞质、细胞间质中，对其中所含的细胞和细胞器官起润滑与滋养作用。透明质酸钠属于高分子聚合物，具有很强的润滑感和成膜性，因此含有透明质酸钠的护肤品涂抹时润滑感明显，手感良好。大分子的透明质酸钠在皮肤表面形成一层透气的薄膜，使皮肤光滑湿润，阻隔外来细菌、粉尘等侵入；而分子量较小的透明质酸钠能渗入真皮层，具有轻微扩张毛细血管、增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤营养吸收和废物的排泄，从而防止皮肤老化，起到美容和养颜作用。然而，透明质酸钠在体内透明质酸酶的作用下，被快速降解成小分子片段进入体液循环被吸收代谢，失去了在肌肤局部补水保湿的功能；在皮肤中，透明质酸钠的半衰期小于1天（laurent等，expphysiol 1991,76:695-703）。因此，水光注射虽然可在肌肤局部快速补充透明质酸钠，但只能在短时间内起到补水保湿，难以实现改善肤质、延缓衰老及恢复年轻态等较长期效果。
5.交联透明质酸钠是透明质酸钠经交联剂交联修饰得到的高分子凝胶，其可以弥补透明质酸钠在体内存留时间短等缺点。目前，交联透明质酸钠所用交联剂主要包括两大类，即二乙烯基砜（dvs）和1,4-二丁醇二缩水甘油醚（bdde）。然而，这两种交联剂均具有很高的生物毒性和潜在致癌性，交联透明质酸钠是水光针的主要成分，其注射入人体皮肤后，会有
潜在的安全风险。此外，当前皮下注射填充类产品中的交联透明质酸钠凝胶含量很高（通常不小于20mg/ml），其含水量通常不大于98%。因此，交联改性虽然可以延缓透明质酸钠在体内的降解吸收速率，但其补水保湿性能较差。并且，这些交联透明质酸钠凝胶产品还具有较大的凝胶强度，需粉碎为颗粒状后才能使用；同时，由于产品本身较大的凝胶强度及颗粒状外观，增加了产品的推挤力，使产品本身很难通过水光针极细针头进行浅表层注射；而且交联透明质酸钠凝胶产品的流动性差，无法在水光注射的浅表层均匀分布，容易形成鼓包且在短期内无法降解消除。因此，当前交联透明质酸钠凝胶产品用于水光注射用途还存在诸多局限性。


技术实现要素：

6.针对上述存在的问题，本发明提供一种协同稳定的透明质酸钠复合溶液组合物及其制剂，该组合物包括非交联的透明质酸钠、透明质酸酶抑制剂以及其他辅料，具有良好的稳定性，实现在体内长时间内起到补水保湿作用，并保证了使用的安全性。具有技术方案如下：首先，本发明提供一种协同稳定性作用的透明质酸钠复合溶液组合物，该透明质酸钠复合溶液组合物包含非交联的透明质酸钠、透明质酸酶抑制剂、溶液稳定剂、抗氧剂和ph调节剂；其中，所述透明质酸酶抑制剂为氨基酸。
7.作为优选的技术方案的，该透明质酸钠复合溶液组合物中，所述非交联的透明质酸钠的含量为1～10mg/ml，其分子量为120万～180万道尔顿；所述透明质酸酶的抑制剂的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.0001:1～1:1；所述溶液稳定剂的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.5:1～2:1；所述抗氧剂的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.00025:1～0.1:1；所述ph调节剂将该透明质酸复合溶液组合物的ph调节为5.5～7.5。
8.作为优选的技术方案的，所述透明质酸酶抑制剂为精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、l-半胱氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐或甲硫氨酸中的一种或几种的组合。
9.进一步优选地，所述透明质酸酶抑制剂为精氨酸和/或l-半胱氨酸与甘氨酸，丙氨酸的组合。
10.作为优选的技术方案的，所述精氨酸、l-半胱氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.05～0.5:1；所述甘氨酸、丙氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.0001～0.5:1。
11.进一步优选地，所述精氨酸、l-半胱氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.08～0.4:1；所述甘氨酸、丙氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.0005～0.4:1。
12.更优选地，所述精氨酸、l-半胱氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.1～0.3:1；所述甘氨酸、丙氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.0006～0.3:1。
13.前述的协同稳定性作用的透明质酸钠复合溶液组合物，所述溶液稳定剂为硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、偏重硫酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠或氯化钠中的一种或任意几种的组合。
14.优选地，所述溶液稳定剂为氯化钠。
15.作为优选的技术方案的，前述的协同稳定性作用的透明质酸钠复合溶液组合物，所述溶液稳定剂的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.8～1.5:1。
16.进一步优选地，所述溶液稳定剂的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.9～1.3:1。
17.作为优选的技术方案的，前述的协同稳定性作用的透明质酸钠复合溶液组合物，所述抗氧剂为烟酰胺、维生素b12、维生素c或维生素e中的一种或任意几种的组合。
18.进一步优选地，所述抗氧剂为烟酰胺和维生素b12的组合。
19.作为优选的技术方案的，所述烟酰胺的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.01～0.1:1，所述维生素b12的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.00025～0.0025:1。
20.进一步优选地，所述烟酰胺的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.01～0.05:1，所述维生素b12的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.00025～0.00125:1。
21.更优选地，所述烟酰胺的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.01～0.03:1，所述维生素b12的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.00025～0.00075:1。
22.作为优选的技术方案的，该透明质酸复合溶液组合物的ph为6.8～7.5。
23.前述的协同稳定性作用的透明质酸钠复合溶液组合物，该透明质酸钠复合溶液组合物还包含稀释剂，所述稀释剂选自由注射用水、0.9%氯化钠、0.45%氯化钠、2.5%葡萄糖、5%葡萄糖中的一种或几种组合。
24.其次，本发明还提供一种协同稳定性作用的透明质酸钠复合溶液组合物制剂，该制剂为注射液剂或冻干剂，其成分包括前述的协同稳定性作用的透明质酸钠复合溶液组合物。
25.作为优选的技术方案的，所述注射液剂为通过终端湿热灭菌或除菌过滤获得，其内毒素小于0.5eu/ml；所述冻干剂水分含量为0～1.0%。
26.本发明的有益效果：1）本发明将透明质酸钠和抑制透明质酸酶的辅料结合，解决实现了透明质酸钠体内水解快，半衰期短的问题；实现通过非交联手段延长透明质酸钠在体内存留时间；并且本发明的透明质酸酶抑制剂为氨基酸，相比于腺苷七肽，茶多酚，松果菊苷等透明质酸酶物质，其且不仅可以抑制透明质酸酶的活性，且效果显著；此外，采用氨基酸抑制透明质酸酶不存在药理活性的问题，安全可靠，并能在抑制透明质酸酶的活性的同时可以有效促进胶原蛋白的生成，达到事半功倍的效果。
27.2）本发明作为透明质酸酶抑制剂的氨基酸优选为精氨酸和/或l-半胱氨酸与甘氨酸和丙氨酸的组合物；其中，精氨酸和l-半胱氨酸通过其自身的分子结构特性与透明质酸酶n末端之间特异性结合，起到了抑制透明质酸酶活性的作用；甘氨酸和丙氨酸通过氢键作用与大分子的透明质酸钠结合，形成了透明质酸酶与透明质酸钠结合的空间位阻，进而抑制了透明质酸酶酶切透明质酸钠的活性；同时，所选氨基酸中丙氨酸ph值为6.96，精氨酸ph值为9.67，l-半胱氨酸ph值为5.24，甘氨酸为6.21 使透明质酸酶无法获得酶切最佳ph环境（透明质酸酶可按其最适ph值分为两种：一种是酸性溶酶体透明质酸酶，最适ph为3.0，在中性情况下无活性；第二类透明质酸酶的最适ph值呈中性，最适ph值为7.0）也可一定程度上达到抑制酶活的效果。
28.3）本发明发现将非交联的透明质酸钠和作为透明质酸钠抑制的不同氨基酸按照特定比例混合，超越了单独加入任何一种氨基酸抑制剂对于透明质酸酶的抑制作用，这表明多种氨基酸混合，两类作用机理不同的氨基酸协同作用以后，起到1+1》2的透明质酸酶抑
制功效。并且在述精氨酸、l-半胱氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.05～0.5:1；甘氨酸、丙氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.0001～0.5:1的配比情况下，透明质酸酶抑制效果更加显著。
29.4）本发明首次验证了透明质酸钠大分子结构可以对组合物中的透明质酸酶抑制剂、溶液稳定剂、抗氧剂和ph调节剂等小分子物质进行包裹，使小分子的理化性质稳定；而被包裹的透明质酸酶抑制剂可以保护透明质酸钠免受透明质酸酶水解，延长其存留时间；溶液稳定剂和抗氧剂增加了复合溶液组合物稳定性，实现了协同稳定的作用。
30.5）本发明的组合物，由于稳定性方面的突出的优异性能，可以经由终端的湿热灭菌或者除菌过滤获得注射液，也可以通过冷冻干燥获得冻干剂，且获得的注射液剂内毒素小于0.5eu/ml，冻干制剂成品水分仅为0～1.0%，进一步增加了该组合物的安全性。而获得的注射液及冻干剂存储条件为室温，放置在西林瓶中后顶空氧低于1.0%，溶解氧小于1ppm，具有良好的工业生产价值及经济价值。
附图说明
31.图1为本发明协同稳定性作用的透明质酸钠复合溶液组合物中透明质酸钠化学结构式；图2为本发明含有不同的氨基酸的复合溶液组合物的平板扩散酶活检测结果；图3为本发明含有不同的氨基酸的复合溶液组合物的玻璃酸酶测定法吸光度-酶含量标准曲线。
具体实施方式
32.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
33.实施例1本实施例为一种协同稳定性作用的透明质酸钠复合溶液组合物，该复合溶液组合物包含非交联的透明质酸钠、透明质酸酶抑制剂、溶液稳定剂、抗氧剂和ph调节剂；其中，所述透明质酸酶抑制剂为氨基酸。我们在研究过程中发现透明质酸钠在体内透明质酸酶的作用下，被快速降解成小分子片段进入体液循环被吸收代谢，失去了在肌肤局部补水保湿的功能。所以找到可以抑制透明质酸酶活性的安全辅料，尤为重要。实验发现，氨基酸，腺苷七肽，茶多酚，松果菊苷，均可以抑制透明质酸酶活性的活性，但是聚谷氨酸，腺苷七肽，茶多酚，松果菊苷与氨基酸相比，抑制酶活的效果远不如氨基酸，且它们均有一定的药理活性，从安全角度考量，氨基酸类为较优的选择。
34.本实施例，将氨基酸作为透明质酸酶抑制剂，作为辅料与非交联的透明质酸钠结合，解决了透明质酸钠体内水解快，半衰期短的问题；实现将非交联的透明质酸钠在体内存留时间延长的目的，并且采用的氨基酸作为透明质酸酶抑制剂，其不仅具有良好的抑制透明质酸酶活性的活性，安全可靠，而且在抑制透明质酸酶的活性的同时，亦可以有效促进胶原蛋白的生成，具有事半功倍的效果。此外，本实施例中透明质酸钠大分子结构可以对组合物中的透明质酸酶抑制剂、溶液稳定剂、抗氧剂和ph调节剂等小分子物质进行包裹，使小分子的理化性质稳定；而被包裹的透明质酸酶抑制剂可以保护透明质酸钠免受透明质酸酶水
解，延长其存留时间；溶液稳定剂和抗氧剂增加了复合溶液组合物稳定性，实现了协同稳定的作用。
35.本实施例中，所述非交联的透明质酸钠的含量为1～10mg/ml，其分子量为120万～180万道尔顿；所述透明质酸酶的抑制剂的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.0001:1～1:1；所述溶液稳定剂的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.5:1～2:1；所述抗氧剂的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.00025:1～0.1:1；所述ph调节剂将该透明质酸复合溶液组合物的ph调节为5.5～7.5，优选为6.8～7.5。
36.本实施例中，所述透明质酸酶抑制剂为精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、l-半胱氨酸、l-半胱氨酸氨酸盐或甲硫氨酸中的一种或几种的组合。优选为精氨酸和或l-半胱氨酸与甘氨酸，丙氨酸的组合。其中，精氨酸和l-半胱氨酸通过其自身的分子结构特性与透明质酸酶的n末端特异性结合，起到了抑制透明质酸酶活性的作用；甘氨酸和丙氨酸通过氢键作用与大分子的透明质酸钠结合，形成了透明质酸酶与透明质酸钠结合的空间位阻，进而抑制了透明质酸酶酶切透明质酸钠的活性；同时，所选氨基酸中丙氨酸ph值为6.96，精氨酸ph值为9.67，l-半胱氨酸ph值为5.24，甘氨酸为6.21 使透明质酸酶无法获得酶切最佳ph环境（透明质酸酶可按其最适ph值分为两种：一种是酸性溶酶体透明质酸酶，最适ph为3.0，在中性情况下无活性；第二类透明质酸酶的最适ph值呈中性，最适ph值为7.0）也可一定程度上达到抑制酶活的效果。并且甘氨酸和丙氨酸是胶原蛋白中含量最高的两类氨基酸，精氨酸在胶原蛋白中含量仅次于甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸，而精氨酸为营养必需氨基酸，人体只能合成部分，长期摄入不足或需求增加时需要食物提供。因此，在注射用透明质酸钠复合溶液中加入甘氨酸、丙氨酸和精氨酸，不但可以抑制透明质酸酶的活性，亦可以有效促进胶原蛋白的生成。
37.作为优选的实施例的，本实施例中所述精氨酸、l-半胱氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.05～0.5:1；所述甘氨酸、丙氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.0001～0.5:1；进一步优选的，所述精氨酸、l-半胱氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.08～0.4:1；所述甘氨酸、丙氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.0005～0.4:1。更优选的，所述精氨酸、l-半胱氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.1～0.3:1；所述甘氨酸、丙氨酸与非交联的透明质酸钠的质量比均为0.0006～0.3:1。
38.本实施例中，所述溶液稳定剂为硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、偏重硫酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠或氯化钠中的一种或任意几种的组合；优选为氯化钠。所述溶液稳定剂的含量与非交联的透明质酸钠质量比优选为0.8～1.5:1；进一步优选为0.9～1.3:1。
39.本实施例中，所述抗氧剂为烟酰胺、维生素b12、维生素c或维生素e中的一种或任意几种的组合，优为烟酰胺和维生素b12的组合。且所述烟酰胺的含量与非交联的透明质酸钠质量比优选为0.01～0.1:1，所述维生素b12的含量与非交联的透明质酸钠质量比优选为0.00025～0.0025:1。进一步优选地，所述烟酰胺的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.01～0.05:1，所述维生素b12的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.00025～0.00125:1；更优选地，所述烟酰胺的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.01～0.03:1，所述维生素b12的含量与非交联的透明质酸钠质量比为0.00025～0.00075:1。
40.本实施例中，所述ph调节剂选自盐酸、硫酸、乙酸、甲磺酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸
及其盐、磷酸及其盐、乳酸及其盐、酒石酸及其盐、琥珀酸及其盐之一，或以上任意两种，或两种以上的组合，优选盐酸。另外，本实施例所述的透明质酸钠复合溶液组合物还可以包含稀释剂，所述稀释剂选自由注射用水、0.9%氯化钠、0.45%氯化钠、2.5%葡萄糖、5%葡萄糖中的一种或几种组合。本实施例的协同稳定性作用的透明质酸钠复合溶液组合物，可以制备成注射液剂或冻干剂，所述注射液剂为通过终端湿热灭菌或除菌过滤获得，其内毒素小于0.5eu/ml；所述冻干剂水分含量为0～1.0%。
41.本实施例中，所述冻干剂，在用注射用水，生理盐水进行重构后，重构时间小于45秒；冻干剂重构后的溶液和制备的注射液剂放置高温（45～60℃）和自然光照下可保持至少9小时的稳定性（api降解度不高于0.5wt%）；并且所述注射液剂和冻干剂均可存储在室温条件下，加速放样6个月（40℃
±
2℃/75%
±
5%rh）其有关物质含量不超过1.0%，放置在西林瓶中后顶空氧低于1.0%，溶解氧小于1ppm。
42.实施例2本实施例为考察实施例中所述的透明质酸钠复合溶液组合物中加入的不同透明质酸酶抑制剂（即不同氨基酸及浓度）对透明质酸酶活性的抑制作用以及对组合物溶液稳定性的影响实验配方见表1中的配方1～6。
43.表1. 不同氨基酸及浓度透明质酸酶抑剂配方制备工艺：按照上述配方，将各组分称量加部分水加热至60℃搅拌溶解后，盐酸调节ph至6.5，将注射用水补足至10000mg，0.22unpvdf滤膜过滤，分装后湿热灭菌；每个配方制备两份复合溶液组合物，备用。
44.透明质酸酶抑制实验：将牛睾丸透明质酸酶溶于生理盐水，配成每1ml含0.1mg的溶液，加入到上述配方一份复合溶液组合物中，另一份作为对照，不加酶。然后将实验组和对照组一同放置37℃摇床放置12小时，然后观察样品现象，并测试样品黏度。实验结果见表2。
45.表2. 配方1～6透明质酸酶抑制实验结果
实验结果显示：一、单独加入甘氨酸和丙氨酸的样品，在加入透明质酸酶以后，样品性状和黏度与没有加酶的对照样品相比变化较大，和只加入酶的配方样品相比黏度变化稍大，说明单独的甘氨酸或者丙氨酸抑制透明质酸酶的活性没有精氨酸和l-半胱氨酸效果明显。
46.二、甘氨酸和丙氨酸均加入的样品，在加入透明质酸酶以后，样品性状和黏度与没有加酶的对照样品相比几乎无变化，说明甘氨酸和丙氨酸混合比单独加入后能更好的抑透明质酸酶的活性。
47.三、单独加入l-半胱氨酸，l-精氨酸的样品，样品性状和黏度与没有加酶的对照样品相比几乎无变化，说明l-半胱氨酸，l-精氨酸均能制透明质酸酶的活性。
48.实施例3本实施例包括三个实验，目的为进一步考察不同氨基酸组合对透明质酸酶活性的抑制作用。实验配方见表3。
49.表3. 不同的氨基酸配方制备工艺：将各组分混合制备后，待用。
50.本实施例采用两种方法检测不同氨基酸组合对透明质酸酶活性的抑制作用。
51.实验1：平板扩散检测酶活过程：配制含有高分子透明质酸的琼脂糖平板；在该琼脂糖平板上用无菌打孔器打若干个直径为6mm的加样孔；在加样孔内分别加入等量的配方7～10，以及空白酶溶液和注射用水，加样量均为50μl。加样后将平板置于37℃培养箱内水平
放置约20h，再覆盖10%（w/v）氯化十六烷基吡啶水溶液10ml，约10分钟后显色，实验结果：见图1。
52.结果显示：空白酶溶液的样品在平板上出现明显的透明圈，不同浓度酶浓度的空白溶液出现的透明圈根据酶的增加而增大，其他配方样品均未出现，说明氨基酸可以抑制透明质酸酶活性。
53.实验2：采用2020版药典四部通则1207玻璃酸酶测定法，进行氨基酸对于透明质酸酶活性抑制作用的考察：标准曲线的制备取大小相同的试管12支，按顺序加入标准品溶液0.00ml、0.10ml、0.20ml、0.30ml、0.40ml与0.50ml，各2支；再依次相应加入水解明胶稀释液0.50ml、0.40ml、0.30ml、0.20ml、0.10ml与0.00ml，每隔30秒顺序加入玻璃酸钾溶液0.50ml，使每一管的总体积为1.00ml，摇匀，置37℃
±
0.5℃水浴中；每管准确保温30分钟后，每间隔30秒钟顺序取出，立即顺序加入血清溶液4.0ml，摇匀，在室温放置30分钟，摇匀，在640nm的波长处测定吸光度；同时以磷酸盐缓冲液0.50ml代替玻璃酸钾溶液，加水解明胶稀释液0.50ml，摇匀，按上述方法自“置37℃
±
0.5℃的水浴中”起同法操作，作为空白。以吸光度为纵坐标，标准品溶液的效价（单位）为横坐标绘制标准曲线。
54.测定法取大小相同的试管6支，依次加供试品溶液0.20ml、0.30ml与0.40ml，各2支；再依次相应加入水解明胶稀释液0.30ml、0.20ml与0.10ml，照标准曲线的制备项下，自“每隔30秒顺序加入玻璃酸钾溶液0.50ml”起，依法测定，自标准曲线上查得效价（单位）后，分别除以供试品的重量（mg），算出6份供试品的平均数，即为玻璃酸酶的效价（单位）。
55.标准曲线和实验结果见图2和表4。
56.表4. 不同的配方吸光度值及对应的酶效价值结果显示：氨基酸的加入使得酶由原始效价120 nfu/mg降低至百分之十以下，配方8，l-精氨酸，l-半胱氨酸，甘氨酸，丙氨酸混合加入抑制透明质酸酶活性最为明显；配方9和配方10中l-精氨酸，l-半胱氨酸分别单独与甘氨酸，丙氨酸混合加入其抑制透明质酸酶解效果也比较显著，说明根据不同机理抑制透明质酸酶活性的氨基酸混合加入，可以更好地抑制透明质酸酶活性。
57.实验3：考察不同透明质酸酶抑制剂对于透明质酸酶活性的抑制作用，实验配方见表5。
58.表5. 不同透明质酸酶抑制剂配方制备工艺：将各组分混合制备后，待用。
59.实验3的实验及测定方法同实验2中提及的方法，标准曲线和实验结果见图2和表6。
60.表6. 不同透明质酸酶抑制剂配方吸光度值及对应的酶效价值结果显示：氨基酸，聚谷氨酸，腺苷七肽，茶多酚，松果菊苷，均可以抑制透明质酸酶活性的活性，但是聚谷氨酸，腺苷七肽，茶多酚，松果菊苷与氨基酸相比，抑制酶活的效果远不如氨基酸，且它们均有一定的药理活性，从安全角度考量，氨基酸类为较优的选择。
61.综合以上三个实验，均可以说明氨基酸具有较强的抑制透明质酸酶活性的作用，可以延缓透明质酸钠被酶降解的速度，最大限度保持透明质酸钠的生理作用，对比聚谷氨酸，腺苷七肽，茶多酚，松果菊苷，氨基酸为体内内源物质，不但可以抑制酶活性的，也可以最大限度的保证该组合物的安全性。
62.综合以上三个实验，均可以说明氨基酸具有较强的抑制透明质酸酶活性的作用，可以延缓透明质酸钠被酶降解的速度，最大限度保持透明质酸钠的生理作用，对比聚谷氨酸，腺苷七肽，茶多酚，松果菊苷，氨基酸为体内内源物质，不但可以抑制酶活性的，也可以
最大限度的保证该组合物的安全性。
63.实施例4本实施例两个实验，目的是考察稳定剂对于配方稳定性的影响。
64.1）考察不同稳定剂对于配方稳定性的影响，实验配方见表7。
65.表7. 不同的稳定剂配方制备工艺：同实施例2的制备方法，将上述各组分称量加部分水加热至60℃搅拌溶解后，盐酸调节至7.0，将注射用水补足至10000mg，0.22unpvdf 滤膜过滤，湿热灭菌后分装。
66.将制备的复合溶液于60℃下放置0、5、10天检测透明质酸钠含量和有关物质。实验结果见表8。
67.表8. 不同的稳定剂加入后对于配方稳定性的影响结果实验结果：对比几种稳定剂发现，相同质量稳定剂加入后，氯化钠对于复合溶液组合物的稳定性方面作用比其他几种稳定剂更为明显，溶液的稳定性进一步加强，且氯化钠为生理盐水的主要成分，安全性方面具有着其他稳定剂不可替代的优势。
68.2）考察氯化钠不同加入量后对于配方稳定性的影响。实验配方见表7。
69.表9. 相同的稳定剂不同加入量配方
制备工艺：同实施例2的制备方法，将上述各组分称量加部分水加热至60℃搅拌溶解后，盐酸调节至7.0，将注射用水补足至10000mg，0.22unpvdf 滤膜过滤，湿热灭菌后分装。
70.将制备的复合溶液于60℃下放置0、5、10天检测透明质酸钠含量和有关物质。实验结果见表8。
71.表10. 不同的稳定剂加入后对于配方稳定性的影响结果实验结果：一、对比不加稳定剂的用量配方20，对照配方6，加入稳定剂的配方含量和有关物质的变化幅度较小。不同质量的氯化钠加入到配方中，发现随着氯化钠的增多，复合溶液组合物的稳定性进一步加强。
72.二、配方21中不添加透明质酸钠，只有小分子物质和稳定剂，影响因素实验可以发现有关物质呈上升趋势，表明如没有大分子透明质酸钠包裹屏作用，小分子的稳定性会有一定程度的下降。该实施例证明了稳定剂和大分子透明质酸钠对于溶液组合物的协同稳定作用。
73.实施例5本实施例为考察不同的抗氧剂加入后对于配方瓶中顶空氧，溶液中溶解氧含量和有关物质的影响。实验配方见表11。
74.表11. 不同的抗氧剂配方
制备工艺：配制前将注射用水充氮，配制过程充氮，各组分称量加部分注射用水加热至60℃搅拌溶解后，盐酸调节至7.0，将注射用水补足至10000mg，溶液中的溶解氧控制含量低于1ppm，0.22unpvdf滤膜过滤充氮灌装，湿热灭菌，瓶中顶空氧控制含量低于1.0%。将该中间体溶液60℃放置影响因素实验，0，10天检测配方瓶中顶空氧、溶液中溶解氧含量和有关物质。实验结果见表12。
75.表12. 不同的抗氧剂配方影响因素实验结果实验结果表明：不加抗氧剂的配方29溶液组合物的顶空氧和溶解氧含量在影响因素放样过程中下降明显，但是有关物质增长明显，推测组合物的有效成分和辅料成分与氧气发生反应，产生一定量的有关物质，添加抗氧剂的组合物顶空氧和溶解氧含量在影响因素放样过程中下降不明显，同时有关物质增长较缓慢，说明抗氧剂的抑制溶液组合物的氧化反应，促成了整个溶液系统的稳定。
76.实施例6本实施例为考察实施例1所提出的透明质酸钠复合溶液组合物对动物皮肤的刺激性。
77.本实施例以兔子为试验对象，进行皮肤刺激试验研究，考察组合物溶液在试验条件下产生刺激反应的潜能。
78.实验样品：本实施例采用实施例5中配方22制备的透明质酸钠样品。
79.实验动物：健康新西兰白兔3只。
80.实验操作：将组合物溶液样品单次直接接触兔脊柱两侧的皮肤24h，将纱布块。于接触后(24
±
2)h、(48
±
2)h、(72
±
2)h，对接触部位红斑、水肿记分， 并计算原发性刺激指数(pⅱ)。
81.评价指标：评分标准按表13进行。
82.表13. 皮肤反应记分标准试验结果如表14所示。
83.表14.皮肤反应记分结果由以上实验结果此可知，在本次试验条件下，该透明质酸钠复合溶液组合物家兔皮肤反应刺激指数为0。说明该复合溶液组合皮肤测试安全合格。
84.实施例7
本实施例为考察实施例1所提出的透明质酸钠复合溶液组合物在动物皮下的降解情况。
85.实验目的：以小鼠为试验对象，进行皮下透明质酸钠降解试验研究，对比组合物溶液与透明质酸钠水溶液动物皮下降解情况。
86.实验样品：按照实施例5中配方22制备透明质酸钠组合物溶液样品，同时按照实施例2中按照配方6制备的透明质酸钠溶液对照样品；并用生理盐水作为空白对照，测定小鼠皮下本身透明质酸含量。
87.实验动物：健康小鼠36只。
88.实验方法：将36只小鼠随机分为3组，每组12只，一组注射组合物配方22溶液样品，第二组注射对照配方6样品，第三组注射等量生理盐水。每一组小鼠再分为注射后2周检测组、注射后3周检测组，注射后4周检测组。每组小鼠在皮下注射后，在实验检测点处死实验小鼠，取注射部位1cm*1cm的皮肤组织，加入胰酶溶液消化，离心后取上清液，参考《yyt 0308-2015 医用透明质酸钠凝胶》中的透质酸钠检测方法，检测上清夜中透明质酸钠含量情况，扣除小鼠皮下本身透明质酸含量，计算出小鼠皮下透明质酸钠残留含量。
89.计算方法：小鼠皮下透明质酸钠残留含量=（上清夜中透明质酸钠含量情况-小鼠皮下本身透明质酸含量）/注射样品的透明质酸量
×
100%。
90.结果见表15。
91.表15.透明质酸钠残留含量结果由以上实验结果此可知，在本次试验条件下，该透明质酸钠复合溶液组合物与透明质酸钠溶液在小鼠皮下降解残留含量差别较大。说明氨基酸的加入可以有效延缓透明质酸钠在体内的降解时间。
92.本发明首次将透明质酸钠和抑制透明质酸酶的辅料结合，解决实现了透明质酸钠体内水解快，半衰期短的问题；实现通过非交联手段延长透明质酸钠在体内存留时间，并且本发明的透明质酸酶抑制剂为氨基酸，其不仅具有良好的抑制透明质酸酶活性的性能，而且安全可靠，在抑制透明质酸酶的活性的同时，亦可以有效促进胶原蛋白的生成，具有事半功倍的效果。本发明中优选的透明质酸酶抑制剂为精氨酸和/或l-半胱氨酸与甘氨酸和丙氨酸的组合物；其中，精氨酸和l-半胱氨酸通过其自身的分子结构特性与透明质酸酶之间特异性结合，起到了抑制透明质酸酶活性的作用；甘氨酸和丙氨酸通过氢键作用与大分子的透明质酸钠结合，形成了透明质酸酶与透明质酸钠结合的空间位阻，进而抑制了透明质酸酶酶切透明质酸钠的活性；同时氨基酸特殊的酸碱性，使透明质酸酶无法获得酶切最佳ph环境，也一定程度上达到抑制酶活的效果。
93.同时，本发明首次验证了透明质酸钠大分子结构可以对组合物中的透明质酸酶抑制剂、溶液稳定剂、抗氧剂和ph调节剂等小分子物质进行包裹，使小分子的活性稳定；而被包裹的透明质酸酶抑制剂可以保护透明质酸钠免受透明质酸酶水解，延长其存留时间；溶液稳定剂和抗氧剂增加了复合溶液组合物稳定性，实现了协同稳定的作用，具有良好的工业生产价值及经济价值。
94.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。