一种柠檬烯乳剂及其制备方法和医药用途与流程

：本发明涉及一种柠檬烯乳剂及其制备方法和医药用途，属于医药领域。

背景技术

0、
背景技术：

1、近年来，呼吸系统疾病的发病率及病死率均居高不下。气管、支气管、肺等是呼吸系统疾病的主要病灶，症状较轻的患者可能会有出咳嗽、胸痛等表现，而症状较重的患者则会出现呼吸困难、缺氧，更有严重者甚至会出现急性呼吸衰竭进而导致死亡。

2、因此，治疗呼吸系统疾病药物的开发也成为药物研究的一个重要部分。在呼吸道感染(如慢性支气管炎等呼吸道疾病)的情况下，往往会产生大量的痰液。痰多不是一种疾病，而是呼吸道疾病的一种症状，在呼吸道感染如感冒等，慢性阻塞性肺病(copd)、肺气肿以及全麻等情况下，呼吸道往往产生大量的痰，可以说，100％的人都经历过痰多这个症状。

3、痰的存在堵塞呼吸道，容易引起咳嗽、喘息，甚至造成呼吸困难，尤其是小儿和老人经常出现咳痰困难.痰液清除不彻底往往继发肺部感染，病程的慢性迁延将最终损害肺功能，严重者危及生命，所以使用祛痰药缓解症状非常必要。在呼吸系统用药终端市场中，镇咳祛痰类药物占据39％的市场份额。

4、国内外应用的祛痰药主要指可特异性改变粘液的粘弹性，并促进其清除的促粘液活性药物，祛痰药按其作用机制可分为以下三大类：

5、1、恶心性祛痰药

6、主要是通过刺激胃粘膜来使患者产生轻微的恶心感，反射性地增加呼吸道腺体分泌，稀释痰液使其更易排出，适用于呼吸道炎症痰液粘稠又难以咳出的患者，如氯化铵、愈创木酚甘油醚等。在呼吸道炎症的发病初期可选用此类药物进行治疗，能够有效地减轻症状。但此类药物刺激性较大，以氯化铵为例，对胃粘膜有刺激性，可引起胃痛、恶心、呕吐，用量不宜太大，对患有溃疡病、肝、肾功能不良者慎用。

7、2、粘痰溶解药

8、主要使痰液中的粘性成分(主要是粘多糖和dna)分解，降低其粘度，使痰液易于咳出。属于这一类药物的有羧甲司坦、福多司坦、氨溴索、溴己新、乙酰半胱氨酸、桃金娘油、桉柠蒎肠溶软胶囊等，最常用的药物是氨溴索，是溴己新的体内活性代谢物，祛痰作用强于溴已新，能增加呼吸道粘膜浆液腺的分泌，减少粘液腺分泌，从而降低痰液粘度，促进肺表面活性物质的分泌，增加支气管纤毛运动，使痰液易于咳出。

9、根据说明书，氨溴索的口服制剂虽然是otc药物，但给药后仍偶见皮疹、恶心、胃部不适、食欲缺乏、腹痛、腹泻。过敏反应包括过敏性休克、血管性水肿、荨麻疹和瘙痒。胃肠道反应，如：胃肠道功能紊乱，包括呕吐和消化不良。神经系统反应包括头痛、头晕。罕见严重的皮肤反应，包括多形性红斑、史蒂文斯-约翰逊综合征(sjs)/中毒性表皮坏死松解症(ten)和急性全身性发疹性脓疱病。吸入给药后常见味觉紊乱、恶心、口腔麻木、咽喉麻木等。

10、桉柠蒎肠溶软胶囊也是国内祛痰药的主流产品之一，口服桉柠蒎诱发的不良反应包括胃肠道不适及过敏反应，如皮疹、面部浮肿、呼吸困难和循环障碍，患者用药的耐受性较差。进口的桃金娘油肠溶胶囊由于成分类似，也有类似问题。

11、3、刺激性祛痰药

12、一些挥发性物质，如桉叶油、复方安息香酊等，1～4ml/次，加入于500ml沸水中，利用蒸汽刺激患者呼吸道，起到稀释痰液，加速痰液排出的效果。此方法既可减少痰量，又能矫正痰的恶臭，并有抗菌消炎的作用。这类药适合急性呼吸道炎症初期，痰少而粘滞且不易咯出的情况。但因给药不方便，此类祛痰药目前已很少应用。

13、综上，在呼吸道疾病的祛痰治疗中发挥着越来越重要的作用。但不容忽视的是，这些祛痰药存在的上述不足之处，使得临床使用受限，开发新的祛痰药已势在必行。

技术实现思路

1、我公司针对解决“有痰不易咳出、导致呼吸困难”为主要命题，对其现存市售且对症的桃金娘油进行了深入研究。桃金娘油主要成分包含桉叶油、柠檬烯、α-蒎烯等的蒸馏提取物，剂型为肠溶软胶囊，在德国、俄罗斯等国家有销售，且应用较广。国内也有桉柠蒎肠溶软胶囊作为桃金娘油软胶囊的同类产品在售，均表现出了良好的疗效。但是，现存市售的品种的剂型(肠溶软胶囊)只适用于成人，不适于咳痰困难的儿童、老人服用。我们对桃金娘油的多种成分进行了分析，最终分别以各个组分的单方以及复方的多种形式做成制剂，进行了药效学实验对比，发现其组分中的柠檬烯表现出了良好药效，且较优于复方。

2、柠檬烯是一种天然产物，它在商业上是作为d-柠檬烯形式上市销售，化学上，它是一种单环单萜，具有特有的柠檬状气味。柠檬烯为单帖类化合物，为无色油状液体，有类似柠檬烯香味，沸点175～177℃，密度约为0.8g/m3，可与乙醇混溶，几乎不溶于水。柠檬烯是从柠檬、橘子、柚子和柚子等柑橘类水果的果皮(果皮)中获得的精油的主要成分，已发现这些精油被用于芳香疗法治疗各种疾病，如胃灼热、压力缓解、胃食管反流病(gerd)和哮喘。

3、目前已报道上市的柠檬烯制剂为胶囊剂，具有理气开胃、消炎、止痛、利胆、溶石的功效，是用于治疗胆囊炎、胆结石、胆管炎、胆道炎、胆道术后综合征的药物。药理学研究显示，它的有效成分柠檬烯具有松弛oddi氏括约肌和降低胆压的作用，还能够增加胰脏分泌脂肪酶、淀粉酶和弹性蛋白酶。

4、综上，我们针对柠檬烯的特性，开发了柠檬烯的乳剂，主要包括口服乳液、雾化吸入剂、注射液，可针对不同人群的疾病缓急程度进行给药。口服乳液很大程度上解决了吞咽困难的问题，雾化吸入剂能更好的靶向于肺部快速起效，注射液适用于急性发作或慢性病症状急性恶化。

5、本发明提供了一种柠檬烯乳剂的处方及制备方法。所述柠檬烯乳剂活性成分为柠檬烯，优选为d-柠檬烯，其浓度为0.1％～5.0％，较优范围0.1％～2.0％，更优范围0.2％～1.0％；辅料包括：磷脂占比为0.5～8.0％，较优范围0.5％～5.0％，更优范围1.0％～2.0％，磷脂可选用蛋黄磷脂、大豆磷脂、合成磷脂等的一种或几种混合，优选大豆磷脂，进一步优选大豆磷脂sc95 或s100；甘油占比为2.0～3.0％，其余为水，例如水占比可以为90.0～95.0％；所述百分比均为质量百分比。

6、该乳液的制备方法包括以下步骤：

7、(1)按照所述质量比称取大豆磷脂、甘油、水，经过高速搅拌使磷脂均匀分散于水相中，在1000～1500bar压力条件下经高压均质循环2～4次，得到半透明溶液。

8、(2)控制水浴循环温度为4～20℃，将处方量柠檬烯泵入(1)中，在压力1500～2000bar 条件下均质循环5～10次，即得柠檬烯乳剂。

9、上述第(2)步制得的柠檬烯乳剂可以口服给药，例如可以制成口服液；

10、或者，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，可以雾化吸入或注射给药，例如，制成雾化吸入液或注射液。

11、本发明的优势

12、本发明首次提供了一种柠檬烯乳剂的处方及制备方法。所述柠檬烯乳剂活性成分为柠檬烯，优选为d-柠檬烯，其浓度为0.1％～5.0％，较优范围0.1％～2.0％，更优范围0.2％～1.0％；辅料包括：磷脂占比为0.5～8.0％，较优范围0.5％～5.0％，更优范围1.0％～2.0％，磷脂可选用蛋黄磷脂、大豆磷脂、合成磷脂等的一种或几种混合，优选大豆磷脂；甘油占比为2.0～3.0％，其余为水，通常水占比为90.0～95.0％；采用高压均质制得柠檬烯乳剂，可以口服给药，或者经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，可以雾化吸入或注射给药。与现有类似的技术相比，一方面，本产品制备工艺采用低温条件下(4-20℃，优化条件6℃)进行均质乳化，而目前报道的乳剂制备工艺均需要在70℃左右条件下均质乳化；另一方面，在优化的处方工艺条件下制备的乳剂平均粒径100nm左右，粒径分布结果表明99％以上粒子均小于200nm，见实施例1中样品 1-3，制备的乳剂经0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，可以注射或雾化吸入给药，而现有注射用乳剂产品粒径平均粒径大于200nm，不能经0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，只能采用高压灭菌方式，由于柠檬烯为挥发油，在高温条件下含量明显下降，因此在我们优化的处方工艺条件下才可以制备得到合格样品。

13、与桃金娘油或桉柠蒎[含p1(桉叶油)、p2(d-柠檬烯)和p3(α-蒎烯)的混合物]，或桃金娘油或桉柠蒎中其他活性成分p1(桉叶油)、p3(α-蒎烯)相比，小鼠气管酚红分泌实验表明，柠檬烯乳剂出人意料地具有非常明显的促酚红排泌作用，表明具有优异的祛痰作用，并且具有明显量效关系。然而已上市的桃金娘油或桉柠蒎[含p1(桉叶油)、p2(d-柠檬烯)和p3(α-蒎烯)的混合物]，不仅相同剂量下效果不如本发明的柠檬烯乳剂，而且随剂量增加效果不增加，甚至下降。

14、实施例

15、以下具体实施方式，为本发明的实施举例，用以介绍本发明的实现方式，但是本发明的保护范围并不限于这些方案，其他与本发明具有相同设计思路的技术方案，均在本发明的保护范围内。

16、实施例1：制剂处方及制备工艺研究

17、1、不同药物浓度样品制备及考察(所述百分比为质量百分比)

18、

19、制备工艺：

20、(1)按照所述处方量称取大豆磷脂、甘油、纯化水，经过高速搅拌使磷脂均匀分散于水相中，在1000～1500bar压力条件下经高压均质循环2次，得到半透明溶液。

21、(2)取(1)水相，控制压力至1500bar，控制水浴循环温度为6℃，按照一定速度泵入处方量柠檬烯，经高压均质循环8次，即得乳液。

22、(3)取(2)中乳液经0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，并以透明中硼硅安瓿进行灌封。以上样品进行了粒径检测和对比：

23、

24、小结：由表中数据证明在一定浓度范围内，乳滴粒径能满足纳米乳的要求，且制备工艺可行。

25、2、考察不同的制备工艺参数

26、本品活性成分为柠檬烯，是一种有挥发性的油，目标制剂为吸入用纳米乳，工艺过程中最重要的环节是高压均质，均质的压力、循环次数、温度控制均为关键指标。

27、处方：

28、

29、采用1.0％(所述百分比为质量百分比)为制剂规格，对均质温度、均质压力、循环次数等进行了考察。

30、制备工艺：

31、(1)按照所述处方量称取大豆磷脂、甘油、纯化水，高速搅拌使磷脂均匀分散于水相中，控制压力在1000～1500bar(压力波动的均值约1300bar)，经高压均质循环2～4次(样5循环 4次，样6循环2次)，即得水相。两者水相经0.22μm微孔滤膜均顺畅，且外观无明显差异，根据实验情况，确认了水相制备的合适的参数。

32、(2)取(1)水相，控制压力至在1500～2000bar之间(压力波动均值约1800bar)，样5批控制水浴循环温度为4℃，样6控制水浴循环温度为20℃，按照固定速度泵入处方量柠檬烯，经高压均质循环5～10次，即得乳液。

33、分别取循环5次和10次的样品考察了乳滴粒径和含量，结果如下：

34、

35、

36、小结：在既定的参数波动范围内，乳滴粒径、含量、外观等指标均相近，证明制备工艺稳健性较好，结果可重复，生产工艺控制得当。

37、另外，为了对比工艺参数的重要影响，重复了上述样品5循环10次的处方和制备工艺，命名为样品7，该样品在制备过程中不提供低温控制的环境，在不提供冷却循环控制时，循环过程中样品温度明显升高，其他控制参数与样品5完全一致。对样品7的成品进行了含量检测，并与样品5进行了对比，含量明显降低，结果如下：

38、

39、小结：工艺过程中最重要的环节是高压均质，均质的压力、循环次数、温度控制均为关键指标。我们选择的处方、工艺参数设计合理，具有明显的优越性。

40、3、雾滴分布的研究

41、处方组成：

42、

43、制备工艺：

44、(1)按照所述处方量称取大豆磷脂、甘油、纯化水，高速搅拌使磷脂均匀分散于水相中，控制压力在1200～1500bar，经高压均质循环2～4次，即得水相。

45、(2)取(1)中水相，控制压力至1500～2000bar，控制水浴循环温度为4～20℃，按照固定速度泵入处方量柠檬烯，经高压均质循环8次，即得乳液。

46、(3)取(2)中乳液，经0.22μm微孔滤膜过滤，以透明中硼硅安瓿进行灌封。

47、(4)取(3)中的样8～样10，以激光衍射法，进行乳滴粒度的测定，结果如下：

48、

49、

50、(5)取(3)中的样8～样10进行雾滴粒度分布

51、①稀释介质及体积：

52、样8、样9、样10稀释于2.5％甘油水溶液中，稀释倍数为5倍，

53、平行以样8、样9、样10稀释于0.9％氯化钠水溶液中，稀释倍数为5倍

54、②测定过程

55、安装雾化装置，取样品2ml，置于雾化杯中，连接激光粒度仪，进行雾滴粒度测定。

56、激光粒度仪参数设定：

57、镜头选择：r1：0.1/0.18...35μm

58、触发条件：开始：c.opt≥5％结束：0.1s c.opt≤5％or 300s real time

59、分散方法：5mb relative

60、③测定结果

61、稀释介质为2.5％甘油的雾滴粒度测定结果：

62、   样8 样9 样10 d10/μm 1.98 1.80 2.21 d50/μm 3.91 4.71 5.82 d90/μm 6.74 8.00 10.74 

63、稀释介质为0.9％nacl的雾滴粒度测定结果：

64、   样8 样9 样10 d10/μm 1.69 1.74 1.62 d50/μm 4.27 4.92 4.36 d90/μm 9.66 10.19 7.89 

65、小结：乳滴粒度在一定范围内，经雾化器分散后，其雾滴粒度分布满足吸入制剂的要求，且中值在最佳的2.5～6μm之间。

66、实施例2：制剂体内活性评价

67、摘要：采用小鼠气管酚红分泌实验评价桃金娘油或桉柠蒎混合组分(p4)与各单一组分p1(桉叶油)、p2(d-柠檬烯)、p3(α-蒎烯)的祛痰作用，分别采用腹腔注射及气管雾化吸入两种给药方式，结果表明：

68、1、腹腔注射

69、与生理盐水组(ns)比较，溶剂对照组(p0)、p1组和p3组无明显促酚红排泌作用(p＞0.05)；p2组(p＜0.001)和p4组(p＜0.001)小鼠的酚红排泌作用显著高于p0组，p2组的酚红排泌作用显著高于p4组(p＜0.05)。

70、2、气管内雾化

71、气管内雾化给药后，与p0组相比，p2组(p＜0.001)和p4组(p＜0.01)小鼠酚红排泌量显著增加，p2组的酚红排泌作用显著高于p4组(p＜0.05)。

72、3、p2、p4的量效关系评价

73、(1)p2

74、腹腔注射：与溶剂对照组(p0)比较，p2各剂量给药组后均有显著促酚红排泌作用，酚红浓度分泌量呈剂量依赖性增加(p＜0.01或p＜0.001)，具有明显的量效关系。

75、气管内雾化：与溶剂对照组(p0)比较，p2各给药组气管雾化给药后均具有明显的促酚红排泌作用(p＜0.001)；随p2剂量的增加，酚红浓度分泌量具有明显的量效关系。

76、(2)p4

77、腹腔注射：p4腹腔注射给药后，随剂量增加，酚红排泌量未表现出剂量相关性，提示混合组分中可能存在相互拮抗作用。

78、一、评价方法：

79、采用小鼠气管酚红分泌实验(检验小鼠气管粘液分泌功能的药理学经典实验方法)评价桉柠蒎混合组分(p4)与各单一组分p1(桉叶油)、p2(d-柠檬烯)、p3(α-蒎烯)祛痰作用。

80、二、初步研究结果

81、1、不同组分药物的药效比较

82、实验过程：小鼠气管酚红分泌实验按照经典药理学实验方法操作进行。

83、取健康昆明种小白鼠，雄性，体重20-25g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。分为对照组和给药组，每组10只，实验前1天空腹过夜，只供饮水。

84、在腹腔注射1％酚红溶液前30min分别腹腔注射生理盐水、p0，给药组p1、p2、p3和p4 (剂量100mg/kg)，30min后，处死动物，背位固定，分离气管，剪取环状软骨以下到支气管分支以上气管段，浸泡于1.5ml含0.05g/ml na2co3生理盐水溶液中，涡旋振荡3min，超声25min，离心4000rpm，20min，取上清。使用分光光度计于波长546nm处读取光密度od值，并与酚红标准曲线比较，计算出酚红浓度，比较各组气道排出酚红量。

85、生理盐水组(ns)：注射体积与给药组相同，每只小鼠注射生理盐水0.2ml。

86、溶剂对照组(p0)：按照实施例1中样品2所述处方量，称取除柠檬烯外辅料，经过高速搅拌使磷脂均匀分散于水相中，在1000bar压力条件下经高压均质循环2次，经过0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，作为溶剂。注射体积与给药组相同，每只小鼠0.2ml。

87、p1、p2、p3、p4注射液配制过程：

88、(1)按照实施例1中样品2所述处方量称取大豆磷脂、甘油、纯化水，高速搅拌使磷脂均匀分散于水相中，在1000～1500bar压力条件下经高压均质循环2次，得到半透明溶液。

89、(2)取(1)水相，控制压力至1500bar，控制水浴循环温度为6℃，按照一定速度分别加入p1、p2、p3、p4，其中p4为桉柠蒎混合物(按照p1∶p2∶p3重量比0.44∶0.44∶0.12混合得到)，经高压均质循环8次，经0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌即得乳液p1、p2、p3、p4。

90、p1、p2、p3、p4浓度：p1、p2、p4浓度10mg/ml，p3浓度5mg/ml，腹腔注射体积按照给药剂量(100mg/kg)及动物体重折算，p1、p2、p4每只小鼠约0.2ml，p3每只小鼠约 0.4ml。测定酚红分泌量％(酚红分泌量％＝给药组酚红排泌浓度/对照组酚红排泌浓度*100)。

91、实验结果见表1。

92、表1腹腔注射不同药物小鼠气管酚红分泌量(n＝10)

93、 组别(剂量) 酚红分泌量/％ ns(生理盐水组) 102±33 p0(溶剂对照组) 96±42 p1(100mg/kg) 84±37 p2(100mg/kg) <![cdata[180±36^***&amp;]]> p3(100mg/kg) 110±35 p4(100mg/kg) <![cdata[154±29^***]]>

94、注：与p0组相比，***p＜0.001；p2与p4组相比，&p＜0.05。

95、结果表明：与生理盐水组(ns)比较，溶剂对照组(p0)、p1组和p3组无明显促酚红排泌作用(p＞0.05)；p2组(p＜0.001)和p4组(p＜0.001)的酚红排泌作用显著高于p0组， p2组的酚红排泌作用显著高于p4组(p＜0.05)。

96、2、p2与p4的药效(气管内雾化吸入)比较

97、实验过程：实验操作过程与前述腹腔注射相同，区别在于给药途径采用气管内雾化：小鼠用戊巴比妥钠(i.p，50mg/kg)麻醉后，分别在腹腔注射1％酚红后即刻及10min后气管内雾化给药2次，30min后处死动物，同前述腹腔注射方法分离气管，计算酚红浓度，比较各组气道排出酚红量。

98、溶剂对照组(p0)：与前述腹腔注射溶剂对照组相同

99、给药组p2、p4：p2、p4雾化乳液与前述注射乳液配制相同，浓度10mg/ml。

100、给药量：每只小鼠气管内雾化给药50μl

101、实验结果见表2。

102、表2 p2与p4的药效(气管内雾化吸入)比较(酚红分泌量)(n＝10)

103、 组别(剂量) 酚红分泌量/％ p0(溶剂对照组) 103±27 p2(0.5mg/只) <![cdata[150±23^***&amp;]]> p4(0.5mg/只) <![cdata[129±45^**]]>

104、注：p2组、p4组与p0组相比，**p＜0.01，***p＜0.001；p2与p4组相比，&p＜0.05。

105、结果表明：气管内雾化给药后，与p0组相比，p2组(p＜0.001)和p4组(p＜0.01)小鼠酚红排泌量显著增加；p2组的酚红排泌作用显著高于p4组(p＜0.05)。

106、3、p2的量效研究(腹腔注射及气管雾化给药)

107、3.1腹腔注射

108、实验操作同前，溶剂对照组(p0)：配制方法同前，每只小鼠给药0.2ml。

109、p2腹腔注射的注射液按照实施例1中样品2所述处方工艺配制，浓度10mg/ml。按照给药剂量(50、100和200mg/kg)调整给药体积。

110、实验结果见表3。

111、表3腹腔注射不同剂量的p2后的酚红分泌量(n＝10)

112、 组别(剂量) 酚红分泌量/％ p0(溶剂对照组) 105±24 p2(50mg/kg) <![cdata[135±37^**]]> p2(100mg/kg) <![cdata[176±32^***]]> p2(200mg/kg) <![cdata[220±35^***]]>

113、注：与p0组相比，***p＜0.01，***p＜0.001。

114、结果表明：与溶剂对照组(p0)比较，p2各剂量给药组腹腔注射后均有显著促酚红排泌作用，酚红浓度分泌量呈剂量依赖性增加(p＜0.01或p＜0.001)，具有明显的量效关系。

115、3.2气管雾化给药

116、实验操作同前，其中，溶剂对照组(p0)：配制方法同前，每只小鼠给药50μl。

117、p2按照实施例1中样品2所述处方工艺配制，浓度10mg/ml。按照给药剂量(0.5mg/只、1mg/只、1.5mg/只)调整给药体积。

118、实验结果见表4。

119、表4不同剂量p2气管雾化给药后酚红分泌量(n＝10)

120、 组别(剂量) 酚红分泌量/％ p0(溶剂对照组) 106±28 p2(0.5mg/只) <![cdata[145±26^***]]> p2(1mg/只) <![cdata[175±37^***]]> p2(1.5mg/只) <![cdata[209±32^***]]>

121、注：与p0组相比，***p＜0.001。

122、结果表明，同溶剂对照组(p0)比较，p2各给药组气管雾化给药后均具有明显的促酚红排泌作用(p＜0.001)；随p2剂量的增加，酚红浓度分泌量具有明显的量效关系。

123、4、p4的量效研究(腹腔注射)

124、实验过程：

125、实验操作同前，其中，溶剂对照组(p0)配制方法同前，每只小鼠给药0.2ml。

126、p4注射液配制方法与浓度同前，按照给药剂量(50mg/kg、100mg/kg及200mg/kg)调整给药体积。

127、实验结果见表5。

128、表5不同剂量p4腹腔注射后酚红分泌量(n＝10)

129、 组别(剂量) 酚红分泌量/％ p0(溶剂对照组) 104±38 p4(50mg/kg) <![cdata[125±33^**]]> p4(100mg/kg) <![cdata[158±26^***]]> p4(200mg/kg) <![cdata[141±27^***]]>

130、注：与p0组相比，**p＜0.01，***p＜0.001

131、结果表明：p4腹腔注射给药后，随剂量增加，酚红排泌量未见明显的剂量相关性，提示混合组分中可能存在相互拮抗作用。