一种Hmga2基因在修复受损视网膜中的应用

一种hmga2基因在修复受损视网膜中的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，涉及一种hmga2基因在修复受损视网膜中的应用。
技术背景
2.随着老龄化社会的到来，包括年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎在内的不可逆和难治性致盲性疾病的患病率不断增加。这些失明患者视网膜的典型病理变化是光感受器和视网膜色素上皮细胞(rpe)的丧失。与中枢神经系统的其他部分一样，成年哺乳动物的视网膜在受伤或退化时没有自我再生的能力。对于rpe、光感受器和其他神经元的丧失，目前没有有效的治疗方法。在实验研究中，通过移植外源性干细胞修复受损神经元已经取得了一定进展，然而，供体细胞的来源、安全性和有效性一直是不可避免的瓶颈问题，为了突破这些瓶颈，可以通过激活内源性干细胞使其原位重编程为光感受器或其他神经元，来修复或再生受损视网膜。
3.在低等脊椎动物，如斑马鱼中，当视网膜受到损伤后，m
ü
ller胶质(mg)细胞可作为视网膜中的内源性干细胞，被激活、去分化、增殖，产生的后代可分化为功能性神经元，恢复受损视力。相比之下，哺乳动物的mg失去了向多能干细胞重编程的能力，损伤或变性通常会导致视网膜应激，从而导致mg肥大和硬度增加，最终过度激活，形成胶质疤痕，很难进展到神经发生。
4.关于小鼠mg重编程的研究显示，通过激活一系列特定信号通路，例如，联合去乙酰化酶抑制剂tsa和ascl1基因过表达，可激活成年小鼠的mg重编程，并生成新的视网膜神经元；联合wnt/β-连环蛋白和otx2、crx和nrl三个转录子可生成新的光感受器细胞。尽管20％-40％的mg改变了细胞从胶质增生到重编程的命运，少数mg衍生的前体细胞还可分化为结构和功能成熟的视网膜神经元，但大多数mg未能重编程。由此可见，寻找并调控影响小鼠mg重编程的靶分子和基因，增强mg重编程能力，促进视网膜再生，是亟待解决的课题，具有光明的临床应用前景。
5.hmga2作为最丰富的非组蛋白染色质相关蛋白，在基因转录调节中发挥关键作用，决定干细胞在发育过程中的命运和神经发生。hmga2在胚胎干细胞中高度表达，而在发育后期和成年期其表达极为有限。过度表达hmga2可将人类体细胞重新编程为神经干细胞，同时可提高小鼠神经干细胞的自我更新能力。
6.结合上述hmga2的相关作用，推测hmga2可能是影响mg重编程的关键分子，故假设在视网膜损伤后，hmga2可促进mg重编程能力，进而挽救视网膜功能。
7.目前hmga2的研究多集中在发育和肿瘤方面，尚未见hmga2基因在治疗受损视网膜或神经系统疾病的相关研究，也未见有文献报道通过构建携带hmga2基因的腺相关病毒载体来治疗受损视网膜。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种携带hmga2基因的腺相关病毒载体，其构建
方法，及其在治疗修复受损视网膜中的应用。
9.本发明在成年小鼠腹腔注射碘酸钠溶液，以制作视网膜损伤模型。
10.在小鼠视网膜的rna测序及real-time pcr的检测中发现在损伤后1天的视网膜中，hmga2 mrna表达水平显著高于正常成年小鼠，约为3.07倍；损伤后3天，视网膜内的hmga2mrna表达为正常成年鼠的2.04倍，到第5天降至正常水平。免疫组化染色结果表明，视网膜损伤后的3天到5天，视网膜mg核内hmga2的表达明显增加，之后逐渐下降。western blot结果显示，损伤后3天的小鼠视网膜中，hmga2蛋白表达水平明显高于正常成年小鼠，约为正常成年大鼠的1.20倍，到损伤后第14天就降至正常水平。
11.结合hmga2的相关作用，特别是其与发育，癌症的密切关系以及该基因在视网膜损伤后表达的变化特征，提示在视网膜损伤前行hmga2腺相关病毒过表达治疗可能会促进mg重编程和受损视网膜细胞的存活。
12.本发明的技术方案，主要是构建hmga2的腺相关病毒载体，并在成年小鼠视网膜损伤模型中，通过玻璃体腔注射hmga2的腺相关病毒载体，特异性转染小鼠视网膜mg细胞，体内观察并探讨通过hmga2基因过表达来激活mg重编程，以修复受损视网膜。
13.为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供一种携带hmga2基因的腺相关病毒载体，所述的腺相关病毒载体是携带如下所示的hmga2基因的dna序列。
14.atgagcgcac gcggtgaggg cgccgggcag ccgtccacat cagcccaggg acaacctgcc
15.gccccggtgc cacagaagcg aggacgcggc cgacccagga agcagcagca agagccaacc
16.tgtgagccct ctcctaagag acccagagga agacccaaag gcagcaaaaa caagagcccc
17.tctaaagcag cccagaagaa agcagagacc attggagaaa aacggccaag aggcagacct
18.aggaaatggc cacaacaagt cgttcagaag aagcctgctc aggggggtga gtttggagaa
19.cgcaccaggt gccatgaatc acaaacctca agtctgcccc acaatcctta tgggcaggag
20.ctcatcgctt ccactctcat gggagac
21.(seq id no:1)；
22.本发明的第二方面，提供上述的携带hmga2基因的腺相关病毒载体的构建方法，具体包括以下步骤：
23.1.hmga2基因的腺相关病毒载体的克隆构建
24.根据hmga2基因(genbank id:nm_001347170.1)设计并合成如下pcr引物：
25.hmga2上游引物：
[0026]5’‑
ccgctgctcg cggggtctag agccaccatg agcgcacgcg gtgagggcg-3’[0027]
(seq id no:2)；
[0028]
hmga2下游引物：
[0029]5’‑
agtagctccg cttccggatc cgtctcccat gagagtggaa gcg-3’[0030]
(seq id no:3)；
[0031]
使用pcr方法从含有如seq id no:1所示的hmga2基因的cdna模板进行hmga2目的基因扩增；将腺相关病毒载体进行酶切，酶切完全后进行酶切产物的纯化，将酶切后的腺相关病毒载体和hmga2基因pcr产物进行连接反应，获hmga2表达载体，得到连接产物后，将产物转化到感受态大肠杆菌中，对生长出的转化子进行hmga2基因腺相关病毒质粒的克隆鉴定，电泳结果阳性的为阳性克隆，证明目的基因已经定向连入目的载体；再对pcr鉴定阳性
的克隆进行生物测序和分析比对，若序列与数据库中的genbank id:nm_001347170.1序列相一致，比对正确，说明质粒构建成功；该质粒包含m
ü
ller细胞特异性的启动子，采用m
ü
ller细胞特异性的腺相关病毒血清型，可以有效靶向感染m
ü
ller细胞。
[0032]
2.hmga2基因的腺相关病毒浓缩
[0033]
将构建好的表达质粒通过超纯去内毒素试剂盒抽提，通过转染试剂转染aav-293细胞，确定hmga2基因的腺相关病毒载体转染表达成功；转染前，aav-293细胞融合度需达到80％以上，转染72h后，将细胞离心收集，然后将细胞裂解，4℃，48000转高速离心130min后，收集富含腺相关病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后，用定量pcr测定病毒滴度。将高滴度的腺相关病毒浓缩液中加入甘油，终浓度为5％，分装后，-80℃保存。
[0034]
体内外实验对腺相关病毒滴度的要求不同，生产过程中根据需求可得到不同滴度的腺相关病毒颗粒，用于相应的实验。
[0035]
本发明的第三方面，提供上述的携带hmga2基因的腺相关病毒载体在修复受损视网膜中的应用。
[0036]
用本发明构建的携带hmga2基因的腺相关病毒载体治疗受损视网膜。首先采用hmga2基因的腺相关病毒载体转染小鼠视网膜mg细胞，再应用碘酸钠腹腔注射建立损伤模型，观察在mg中过表达hmga2基因后对受损视网膜修复的作用。
[0037]
携带hmga2基因的腺相关病毒载体在修复受损视网膜中的应用，hmga2基因的腺相关病毒可转染mg，临床上，具体可采用玻璃体腔注射该病毒转染mg以进行视网膜损伤后的基因治疗。
[0038]
腺相关病毒载体aav是一种无被膜的单链线状缺损型dna病毒，aav的dna能以dsdna的形式低频整合入宿主的染色体中，aav载体具有潜伏状态稳定、宿主范围广、转染效率高、表达时间长、免疫反应弱等特点，因此被认为是目前最安全的用于在体实验的病毒载体。现在已经有多种aav血清型，用于不同组织的特定转染，选择在mg中有较强的转染性和特异性的血清型腺相关病毒和mg特异性启动子可实现高效靶向转染mg。
[0039]
本发明基于hmga2在肿瘤、大脑皮质、脑室下区和视网膜等组织中的独特作用，用携带hmga2基因的腺相关病毒载体转染mg，观察其对mg的重编程，以及感光细胞存活和视觉功能恢复的作用。
[0040]
视网膜和视神经是中枢神经系统(cns)的一部分，是作为研究cns损伤和再生的理想部位。研究视网膜损伤后的修复与再生，将为临床治疗视神经损伤提供新的有力手段和理论基础，对cns疾病和损伤的治疗也有着重要借鉴意义。
[0041]
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。
附图说明
[0042]
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
[0043]
图1为腺相关病毒(绿色)转染小鼠mg的效果图(左侧)及转染后hmga2蛋白在视网膜中的过表达局部图(右侧)。小鼠玻璃体腔注射病毒后3周，行视网膜切片，从左侧效果图
中可以看到视网膜中，病毒转染的细胞，呈典型的mg乔木形态，转染效率约70％；从右侧局部图中可以看到病毒可正确地表达hmga2蛋白(红色)。
[0044]
图2为hmga2腺相关病毒对mg胶质化的影响。将小鼠玻璃体腔分别注射pbs、aav-hmga2后3周，腹腔注射碘酸钠(si)溶液，进行视网膜损伤模型的制作，损伤后4周，用免疫组化染色检测胶质化相关蛋白gfap在非损伤组(si-pbs和hmga2-si-pbs)、单纯损伤组(si-14d，si-21d，si-28d)和治疗组(hmga-si-14d，hmga-si-21d，hmga-si-28d)中的表达，可以看到aav-hmga2治疗后14-21天，mg胶质化gfap表达量(红色)显著减少(图2左图)。图2右图为gfap蛋白相对表达量的统计结果(n＝3，*p《0.05,**p《0.01)。该结果提示mg胶质化程度减轻。
[0045]
图3为hmga2腺相关病毒对mg增殖的影响。用免疫组化染色检测增殖相关蛋白ccnd1在非损伤组(si-pbs和hmga2-si-pbs)、单纯损伤组(si-14d，si-21d，si-28d)和治疗组(hmga-si-14d，hmga-si-21d，hmga-si-28d)中的表达，可以看到aav-hmga2治疗后14-28天，ccnd1表达量(白色)明显增加(图3左图)。图3右图为增殖的mg占总mg的比例的统计结果(n＝3，**p《0.01,***p《0.001)。该结果提示mg增殖能力增强。
[0046]
图4是hmga2腺相关病毒对视网膜感光细胞层(onl)细胞的存活作用，其中图4左图采用细胞核(dapi)染色，观察非损伤组(si-pbs和hmga2-si-pbs)、单纯损伤组(si-14d，si-21d，si-28d)和治疗组(hmga-si-14d，hmga-si-21d，hmga-si-28d)中视网膜感光细胞层细胞的存活情况；图4右图为感光细胞层数定量统计结果(n＝5，***p《0.001)。可以看到aav-hmga2治疗后14-28天，视网膜感光细胞层的厚度多于单纯损伤组，存活的感光细胞显著增加。
[0047]
图5是hmga2腺相关病毒对视网膜功能的挽救作用。通过视网膜电图技术，检测非损伤组(si-pbs和hmga2-si-pbs)、单纯损伤组(si-14d，si-21d，si-28d)和治疗组(hmga-si-14d，hmga-si-21d，hmga-si-28d)的小鼠在暗适应环境下，光强3.0cd.s.m-2
时，视网膜波形的情况(图5上图)，并统计a波和b波的幅值(n＝4-7，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001)(图5下图)。可以看到aav-hmga2治疗后14-28天，a波和b波的幅值明显增加，即视网膜功能得到很大提升。
具体实施方式
[0048]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0049]
实施例：
[0050]
1、目的基因片段的获得
[0051]
从genbank中查询hmga2基因的序列，用primer5软件设计引物，以小鼠cdna为模板，采用pcr扩增hmga2基因片段。
[0052]
pcr扩增目的基因：使用高保真的primestar酶扩增目的基因，反应体系和条件如
下：
[0053]
表1：以小鼠cdna为模板的hmga2基因扩增体系
[0054][0055]
2、hmga2基因的腺相关病毒载体的克隆构建
[0056]
hmga2目的基因扩增后，将腺相关病毒载体进行酶切，酶切完全后进行酶切产物的纯化，将酶切后的腺相关病毒载体和hmga2基因pcr产物进行无缝连接反应，获hmga2表达载体，得到连接产物后，将产物转化到感受态大肠杆菌中，对生长出的转化子进行hmga2基因腺相关病毒质粒的克隆鉴定，电泳结果阳性的为阳性克隆，证明目的基因已经定向连入目的载体；再对pcr鉴定阳性的克隆进行生物测序和分析比对，若序列与数据库中的genbank id:nm_001347170.1序列相一致，比对正确，说明质粒构建成功；该质粒包含m
ü
ller细胞特异性的启动子，采用m
ü
ller细胞特异性的腺相关病毒血清型，可以有效靶向感染m
ü
ller细胞。
[0057]
3、hmga2基因的腺相关病毒浓缩
[0058]
将构建好的表达质粒通过超纯去内毒素试剂盒抽提，通过转染试剂将其和辅助质粒一起转染aav-293细胞，确定hmga2基因的腺相关病毒载体转染表达成功；转染前，aav-293细胞融合度需达到80％以上，转染72h后，将细胞离心收集，然后将细胞裂解，4℃,48000转高速离心130min后，收集富含腺相关病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后，用定量pcr测定病毒滴度。将高滴度的腺相关病毒浓缩液中加入甘油，终浓度为5％，分装后，-80℃保存。
[0059]
4、实验动物分组
[0060]
(1)非损伤组：
[0061]
腹腔注射pbs，玻璃体腔注射pbs或aav-hmga2病毒(si-pbs和hmga2-si-pbs)；
[0062]
(2)单纯损伤组：
[0063]
腹腔注射碘酸钠，玻璃体腔注射pbs(si-14d，si-21d，si-28d)；
[0064]
(3)治疗组：
[0065]
腹腔注射碘酸钠，玻璃体腔注射aav-hmga2病毒(hmga-si-14d，hmga-si-21d，hmga-si-28d)；
[0066]
5、hmga2腺相关病毒转染小鼠视网膜以及转染后hmga2的过表达
[0067]
在小鼠玻璃体腔注射aav-hmga2病毒3周后，取出眼球后固定于4％多聚甲醛中2小时，蔗糖过夜脱水后，行冰冻切片，然后观察病毒egfp荧光(绿色)表达的情况，发现病毒转染了大部分的mg，效率约为70％。采用免疫组织化学的方法观察病毒转染小鼠视网膜后，hmga2蛋白过表达情况(如图1所示)。可以看到视网膜中，病毒转染的细胞，呈典型的mg乔木形态，转染效率约70％；且可正确地表达hmga2蛋白(红色)。
[0068]
6、视网膜损伤小鼠模型的建立
[0069]
hmga2腺相关病毒转染小鼠视网膜后，进行视网膜损伤模型制备，每组的实验动物常规消毒后，按照每只小鼠30mg/kg碘酸钠(si)进行腹腔注射，模拟临床造成视网膜色素变性疾病。
[0070]
7、hmga2过表达对mg的影响
[0071]
(1)hmga2过表达对mg的胶质化标记gfap的影响
[0072]
采用免疫组织化学的方法观察hmga2腺相关病毒转染小鼠视网膜后，可以看到aav-hmga2治疗后14-21天，mg胶质化蛋白gfap表达量(红色)显著减少(图2左图)，图2右图为gfap蛋白相对表达量的统计结果(n＝3，*p《0.05,**p《0.01)。该结果提示mg胶质化程度减轻。
[0073]
(2)hmga2过表达对mg的增殖标记ccnd1的影响
[0074]
采用免疫组织化学的方法观察hmga2腺相关病毒转染小鼠视网膜后，可以看到aav-hmga2治疗后14-28天，ccnd1表达量(白色)明显增加(图3左图)。图3右图为增殖的mg占总mg的比例的统计结果(n＝3，**p《0.01,***p《0.001)。该结果提示mg增殖能力增强。
[0075]
8、hmga2过表达对受损视网膜的保护作用
[0076]
(1)hmga2过表达对感光细胞层细胞数的影响
[0077]
dapi染色：对冰冻切片行dapi染色，从层数上观察非损伤组、单纯损伤组和治疗组视网膜感光细胞层细胞的存活情况(图4左图)；图4右图为感光细胞层数定量结果(n＝5，***p《0.001)。可以看到aav-hmga2治疗后14-28天，视网膜感光细胞层的厚度多于单纯损伤组，存活的感光细胞显著增加。
[0078]
(2)hmga2过表达对视网膜电生理的挽救作用
[0079]
1)视网膜电图(erg)检测：各组小鼠通过1％戊巴比妥钠注射麻醉后，双眼进行erg检测
[0080]
2)视网膜损伤4周，检测非损伤组、单纯损伤组和治疗组的小鼠在暗适应环境下，光强3.0cd.s.m-2
时，视网膜波形的情况，如图5上图所示，并统计a波和b波的幅值(n＝4-7，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001)(图5下图)。可以看到aav-hmga2治疗后14-28天，a波和b波的幅值明显增加，即视网膜功能得到很大提升。
[0081]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述
[0082]
实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。
[0083]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。