一种仿生可注射多肽水凝胶的制备及应用

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种腔内可注射多肽水凝胶制备方法及其在术后肿瘤中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.恶性肿瘤已成为严重威胁人民健康的重要社会问题之一，其病程进展快，死亡率高，五年生存率低。目前针对脑肿瘤以及其他肿瘤的脑转移；骨肿瘤以及其他肿瘤的骨转移；黑色素瘤等恶性肿瘤临床上常采用手术切除的方式，通过对原发病灶或转移病灶做部分或大部分切除，从而减少肿瘤负荷，缓解患者临床症状，为进一步放化疗创造条件。
4.脑胶质瘤是中枢神经系统最常见肿瘤，因其病灶部位的特殊性及复杂性至今仍是诸多肿瘤治疗中最为棘手且最具挑战性的课题之一。其中星形细胞瘤(astrocytoma)占胶质瘤的70-80％。而多型性神经胶母细胞瘤(glioblastoma multiform；gbm)属恶性程度最高的星形细胞瘤。多形性神经胶质母细胞瘤五年存活率不超过10％。由于gbm呈恶性浸润性生长，与正常组织无明显分界，肿瘤组织周围正常脑组织中均可检测到gbm星形侵袭灶，且多生长在大脑组织中重要结构，如基底节，中央沟区，丘脑，脑干等部位，不仅手术难以全切，而且术后易复发。术后辅助放化疗无论从理论还是实践上，均被证实对恶性脑胶质瘤效果不佳，并且副作用较大，往往导致病人的生存质量大为下降。
5.脑转移是恶性肿瘤治疗失败的常见原因之一，通常临床处理比较困难，实体瘤脑转移患者的数量是原发性脑肿瘤的10倍，发生脑转移瘤患者的中位生存期时间约为5个月。对于脑转移治疗，对于占位效应明显的脑转移灶，首选手术治疗，术后辅以全身化疗、靶向、免疫、放射治疗等综合治疗；对于难以手术根治性切除的患者，可以先行神经导航下立体定向活检取得病理结果，后续根据病理结果给予全身化疗、靶向、免疫、放射治疗等综合治疗。
6.骨肿瘤是一类多样化的疾病，根据其形成的方式主要分为原发性骨肿瘤和转移性骨肿瘤。原发性骨肿瘤是肿瘤细胞不可控生长直接形成的一种肿瘤性骨组织或类骨组织的恶性骨肿瘤。大约20-34％的原发恶性骨肿瘤为骨肉瘤，其在儿童和青少年常见的恶性肿瘤种类中发病率高居第三位。虽然从上世纪七十年代起通过辅助化学治疗已经使患者十年生存率从30％提高到了50％，但是预后仍然不够理想。并且自从九十年代开始，患者十年生存率止步不前，没有得到进一步的提升。转移性骨肿瘤在临床上则更为常见。癌症骨转移是一种癌症并发症，在65-80％的乳腺癌和前列腺癌晚期患者身上都会出现。虽然甲状腺癌、肺癌和肾癌晚期患者骨转移的发生几率稍低，但也高达35-42％。而且随着癌者患者的生存期延长，骨转移的发生几率稳步上升。癌症骨转移后形成的转移性骨肿瘤通常很难治愈，并且随着病情的发展会引起病理性骨折、高血钙及神经压迫等并发症，给患者带来巨大的痛苦。
7.皮肤黑色素瘤是一种具有高度侵袭性的癌症，其发病率在全球范围内不断增加，
病程早期伴随转移且预后不佳，中位生存期仅8-9月,三年生存率仅10％-15％。对黑色素瘤患者常规治疗方案首选病灶切除术，辅助放化疗,但黑色素瘤对放化疗敏感性极低且存在较高复发率及转移率。
8.临床常见抗肿瘤药物经过口服或者静脉注射等全身给药后，仅有少部分可通过体内循环达到肿瘤部位，达到杀伤术后残存肿瘤细胞的目的，大部分药物在到达肿瘤组织之前会被正常组织摄取吸收。全身给药方式使抗肿瘤药物利用率很低，同时对正常组织产生毒副作用，且术后化疗需要不断频繁给药，这也会促使肿瘤细胞产生耐药性从而导致预后不佳。相比较术后全身给药方式，局部递送药物可实现精准给药，增加肿瘤部位的药物浓度，并显著降低全身毒性。其中水凝胶是一类最为常见的用于局部给药的递送载体，水凝胶是高分子单体交联后形成的一种强吸水材料，通过在手术后形成的空腔内植入载药水凝胶具有以下几点优势：(1)可实现术后空腔局部给药并具有较低的全身系统毒性；(2)可装载多种药物达到联合治疗的目的；(3)使药物分子以稳定可控的速率、合适的浓度在术后空腔内持续缓慢地释放。近年来仿生多肽自组装水凝胶得到广泛关注和研究，
9.自组装多肽水凝胶主要是由生物体内的天然氨基酸组成，不含有毒化学物质，具有生物可降解性，在体内降解后，氨基酸会被宿主细胞代谢，从而不会对宿主细胞产生副作用。近20年来，由于多肽序列易于合成，优秀的凝胶化能力和良好的生物相容性和生物活性，基于多肽序列的纳米凝胶材料受到了科研工作者的广泛关注，自组装肽系统形成的水凝胶生物相容性好，无免疫原性，无血栓形成，并且可通过注射到特定组织用于局部疗法，使其成为纳米医学的理想生物材料，在组织工程，药物递送、生物传感器、抗菌药物、生物成像等方面具有良好的生物医学应用。


技术实现要素：

10.为了解决上述问题，本发明的目的之一是提供了一种仿生杂合可注射多肽水凝胶制备方法。
11.本发明的目的之二是提供了腔内可注射纳米载体水凝胶超结构在植入术后肿瘤的局部递送药物应用。
12.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
13.本发明的第一个方面，提供了一种仿生杂合可注射多肽水凝胶的制备方法，包括：
14.将fmoc-ddikvav和fmoc-ftkprf多肽溶解在缓冲液中，得到混合溶液i；
15.向所述混合溶液i加入naoh溶液，使固体颗粒完全溶解，得到溶液ii；
16.将溶液ii的ph值调节至中性，触发自组装，即得。
17.本发明使用9-芴甲氧羰基(fmoc)修饰的脑细胞外基质衍生的层粘连蛋白肽ddikvav(fmoc-ddikvav)和具有免疫刺激作用的多肽ftkprf(fmoc-ftkprf)作为水凝胶单体。该单元进一步利用氢键、疏水作用、π-π堆积等非共价键力可在37℃条件下短时间内自组装形成仿生杂合可注射多肽水凝胶。该多肽水凝胶具有可注射性能且可作为药物储库植入肿瘤手术后形成的空腔中，使所载药物以稳定可控的速率、合适的浓度在手术后形成的空腔局部内缓慢释放，从而充分发挥药效杀伤残余肿瘤细胞，避免全身用药引起的毒副作用。
18.本发明的第二个方面，提供了上述的方法制备的仿生杂合可注射多肽水凝胶。
19.本发明的第三个方面，提供了述的仿生杂合可注射多肽水凝胶用于制备手术后肿瘤治疗的药物或术后空腔局部递药系统的应用。
20.本发明的有益效果
21.(1)本发明的自组装多肽水凝胶具有可注射性能且可作为药物储库植入肿瘤手术后形成的空腔中，使所载药物以稳定可控的速率、合适的浓度在手术后形成的空腔局部内缓慢释放，从而充分发挥药效杀伤残余肿瘤细胞，避免全身用药引起的毒副作用。
22.(2)本发明制备方法简单、实用性强，易于推广。
附图说明
23.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
24.图1为本发明实施例1制备仿生杂合多肽水凝胶成胶宏观图。
25.图2为本发明实施例1制备仿生杂合多肽水凝胶可注射性能表征图。
26.图3为本发明实施例1制备仿生杂合多肽水凝胶透射电镜图，标尺：200μm。
27.图4为本发明实施例1制备仿生杂合多肽水凝胶冻干粉扫描电镜图标尺：500μm。
28.图5为本发明实施例1制备仿生杂合多肽水凝胶模量分析。
29.图6为本发明实施例1制备仿生杂合多肽水凝胶粘度分析。
具体实施方式
30.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
31.仿生杂合可注射多肽水凝胶制备方法，包括以下步骤：
32.(1)fmoc-ddikvav和fmoc-ftkprf多肽溶于pbs缓冲液中，得到混合溶液i；
33.(2)在磁力搅拌条件下，naoh溶液逐滴加入混合溶液i中，使未溶解固体颗粒充分溶解，得到溶液ii；
34.(3)向溶液ii中逐滴加入hcl溶液，调整ph值至中性，在室温条件下利用涡旋仪充分搅拌，得仿生杂合多肽水凝胶。
35.在一些实施例中，所述fmoc-ddikvav和fmoc-ftkprf多肽质量比为均为1～1.5：1～1.5。
36.在一些实施例中，所述缓冲液为pbs缓冲液，ph＝7.2～7.4。
37.在一些实施例中，fmoc-ddikvav与缓冲液的质量体积比为1mg：20～25μl。
38.在一些实施例中，naoh溶液的浓度为0.25～0.3m。
39.在一些实施例中，在磁力搅拌下，滴加naoh溶液，磁力搅拌的速度为50～80rpm min-1
。
40.在一些实施例中，采用hcl溶液调节ph值，hcl溶液的浓度为0.1～0.2m。
41.在一些实施例中，所述自组装在涡旋搅拌下进行，涡旋时间为1～2分钟。
42.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
43.以下实施例中，fmoc-ddikvav(5mg)和fmoc-ftkprf(5mg)多肽由商业公司合成，结构式如下：
[0044][0045]
实施例1：仿生杂合多肽水凝胶制备方法
[0046]
(1)取一个洁净干燥的1ml ep管，分别称量fmoc-ddikvav(5mg)和fmoc-ftkprf(5mg)多肽，然后向其加入100μl的0.25m的naoh磷酸缓冲溶液，混溶并加入磁力搅拌子。
[0047]
(2)取一个洁净干燥的10ml小烧杯，精密称量一定量浓盐酸，加入双蒸水用玻璃棒搅拌使终浓度为0.1m。向上述1ml ep管缓慢滴加hcl溶液，用ph计检测混合溶液的ph，调节混合溶液ph至7.2，并将ep管在涡旋仪上涡旋2分钟。多肽单元进一步利用氢键、疏水作用、π-π堆积等非共价键力自组装形成水凝胶。本实施例制备的仿生杂合多肽水凝胶成胶宏观图和空白溶液对照如图1所示。
[0048]
实施例2：仿生杂合多肽水凝胶可注射性能考察
[0049]
将自组装前的混合溶液(包含fmoc-ddikvav、fmoc-ftkprf、naoh及hcl)与罗丹明b溶液在孵育前通过25号注射器注射到含有car-mφ样的模具中，撤去模具后的水凝胶形状。结果显示本发明仿生杂合多肽水凝胶具有可注射性能。如图2所示。
[0050]
实施例3：仿生杂合多肽水凝胶的显微结构考察
[0051]
将制备的fmoc-ddikvav水凝胶、fmoc-ftkprf水凝胶以及fmoc-ddikvav-fmoc-ftkprf杂合水凝胶用超纯水稀释后，取总体积为10μl的样品沉积在新鲜的铜孔上，然后将其取出，风干后，使用透射电子显微镜对其进行成像。结果显示fmoc-ddikvav水凝胶、fmoc-ftkprf水凝胶以及fmoc-ddikvav-fmoc-ftkprf杂合水凝胶具有相互交织的纳米纤维网络结构。如图3所示。
[0052]
本发明以扫描电子显微镜(scanning electron microscope,sem)观察仿生杂合多肽水凝胶内部微观结构。冻干仿生杂合多肽水凝胶喷金后，在5kv的加速电压下，通过场发射扫描电子显微镜成像观察水凝胶的形态，结果显示多肽水凝胶为孔隙均一性的网状结构，如图4所示。
[0053]
实施例4：仿生杂合多肽水凝胶流变学考察
[0054]
在流变仪(anton-paar mcr302)上分析水凝胶的模量。将多肽水凝胶置于平行板上，并在37
±
0.1℃下进行测量。多肽水凝胶频率扫描流变学分析，在频率范围内0.1-100rad s-1
进行扫描，记录不同水凝胶g’和g”随频率变化曲线图，结果显示g’和g”随频率增大而增大，且储能模量大于损耗模量，表明多肽水凝胶可保持高弹性。如图5所示。
[0055]
采用流变仪分析水凝胶粘度和剪切应力。结果显示三种水凝胶的粘度随着剪切速率的增加而降低，表明仿生多肽水凝胶具有剪切稀化能力，进一步证明了其具有可注射特性。
[0056]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。