红景天苷在制备干预缺血再灌注心律失常的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及红景天苷在制备干预缺血再灌注心律失常的药物中的应用。


背景技术：

2.缺血性心脏病的发生主要由冠状动脉的急性或慢性闭塞引起，导致血流 急剧减少或中断，引起供血区域的心肌细胞缺血、缺氧、坏死。
3.冠状动脉闭塞后的早期再灌注治疗，已被证实为减少梗死面积和改善心 脏功能的最有效治疗方法，且再灌注时间越早，患者的获益越好。但是再灌 注后导致的心脏损伤却不容忽视，再灌注导致微循环障碍、心肌内出血、心 肌顿抑以及恶性心律失常等不良心血管事件发生，严重时可导致心血管急危 重症事件，多数情况下再灌注心律失常(reperfusion arrhythmia ra)表现为 一过性，包括室性期前收缩(pvb)、室性心动过速(vt)或心室颤动(vf)， 严重时可发生恶性心律失常导致猝死。尽管临床上ra是心脏再灌注成功的 重要标志，但同时也是导致患者突发死亡的重要原因，预防和治疗缺血再灌 注心律失常的发生是目前心血管疾病领域的一项重要挑战。
4.ra的发生受冠脉再通时间、梗死范围、侧支循环血流、电解质紊乱及再灌注前有无缺血性心律失常等多种因素的影响，机制可能与心肌电生理特性的改变，而导致传导性与不应期的不均一性有关，涉及到氧自由基堆积、细胞内钙超载、儿茶酚胺过多分泌、内皮细胞受损等等因素，现代研究显示 ca2+/钙调蛋白依赖性激酶ii(camkii)、连接蛋白43(cx43)和生长分化因子 11(gdf11)等基因参与其中。目前防治缺血再灌注心律失常的方法主要有以下几类：心脏缺血预处理和后处理、钙通道阻滞剂、抗氧自由基制剂、儿茶酚胺受体调控剂、atp敏感性钾离子通道开放剂等药物干预。目前中医药抗缺血再灌注心律失常的治疗策略越来越多的被用于临床，如复方制剂如稳心颗粒、参松养心胶囊；单味药物如红景天、丹参、黄连、苦参等，中医药使再灌注性心律失常发生率得到降低，还能够使患者死亡率得到明显控制，但药物成份复杂机制不明确限制其使用。因此，临床上迫切需要作用明确靶点清晰的抗心律失常药物。
5.红景天为景天科植物大花红景天rhodiolacrenulata(hook.f.et thoms.) h.oh ba的干燥根和根茎
″
，是中医药和藏医药的常用药材，在《神农本草经》、《四部医典》及《本草纲目》中均有记载，具有益气活血、通脉平喘的功效，用于治疗气虚血瘀、胸痹心痛、倦怠气喘等病证。红景天作为传统药物长期以来在欧洲和亚洲一直用于治疗多种常见病证和疾病，包括心血管疾病、阿尔茨海默病、认知功能障碍、癌症和中风等。红景天所含化学成分高达282 种，代表性有效成分为红景天苷(salidroside sal)、酪醇、洛塞维以及没食子酸。红景天苷具有显著抑制as(动脉粥样硬化)作用，本课题组前期对 sal干预as进行系列研究，结果明确sal具有多靶点多通路抗as作用，但红景天苷是否干预缺血再灌注心律失常尚不是十分清晰。据报道红景天能显著降低氯化钙浓度的机理可能是通过稳定细胞膜离子泵及钙通道，稳定细胞膜反应性，使异常增快钙离子内流减慢，抑制或消除异位节律，但深入机
制不清晰。为此，本发明深入探析红景天苷抗离体心脏缺血再灌注恶性心律失常的作用和机制。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供红景天苷在制备干预缺血再灌注心律失常的药物中的应用，为缺血再灌注心律失常的干预药物的研发提供新的参考方案。
7.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：红景天苷在制备干预缺血再灌注心律失常的药物中的应用。
8.优选地，所述红景天苷用于降低缺血再灌注心律失常的发生概率。
9.优选地，所述红景天苷的浓度为5-75μg/ml。
10.优选地，红景天苷通过加快心肌缺血区传导速度，减小传导离散度，干预缺血心肌再灌注心律失常。
11.优选地，所述红景天苷的浓度为5μg/ml。
12.优选地，所述缺血再灌注心律失常为大鼠离体心脏缺血再灌注过程中发生的心律失常。
13.有益效果：
14.本发明为干预缺血再灌注心律失常的药品研发提供了新的思路：将红景天苷应用于干预缺血再灌注心律失常，为临床急性心肌梗死患者行再灌注治疗后避免发生恶性心律失常提供可参数据。
15.本发明的研究表明红景天苷可以加快心肌缺血区传导速度，减小传导离散度，起到保护心肌作用，对于心肌缺血再灌注心律失常发生率也有显著的降低。
附图说明
16.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。其中：
17.图1为本发明实施例提供的ecg电极、刺激电极及矩阵式多通道电生理标测系统电极预实验时贴附部位图；图中，“ecg electtrode”代表心电图电极；“ra”代表右心房，“la”代表左心房，“rv”代表右心室，“lv”代表左心室，“stimulator”代表刺激器；
18.图2为本实验各电极贴附部位实物图；
19.图3为红景天苷干预缺血再灌注心律失常量效关系实验流程图；图中，“experimental protocol”代表实验方案，“baseline”代表基线，“sal”代表红景天苷，“sinus stimulation”代表窦刺激，“drug circulation infusion”代表循环给药，“verp”代表心室有效不应期；
20.图4为ecg电极、刺激电极及矩阵式多通道电生理标测系统各电极贴附部位示意图；
21.图5为ecg电极、刺激电极及矩阵式多通道电生理标测系统各电极贴附部位及结扎线所在部位实物图；
22.图6为ecg电极、刺激电极及矩阵式多通道电生理标测系统去除结扎线后实物图；
23.图7为红景天苷不同浓度下6hz刺激大鼠左心室传导时间对比图；
24.图8为6hz频率刺激时，不同浓度的红景天苷对左心室传导速度的影响结果图；
25.图9为复灌后模型组(miri)和红景天苷组(drug，5μg/ml红景天苷) 的ecg代表图；
26.图10为缺血再灌注后，模型组与红景天苷组vf发生概率统计图；模型组(model)，红景天苷组(drug)
27.图11为模型组与红景天苷组结扎前后心电图对比；其中，“mi”代表心梗；
28.图12为心梗前后模型组与红景天苷组各通道离散对比示意图；
29.图13中：a图为自发节律下模型组和红景天苷组大鼠左心室心梗前后传导时间代表图；b图为6hz刺激下模型组和红景天苷组大鼠左心室心梗前后传导速度统计图；c图为6hz刺激下模型组和红景天苷组大鼠右心室心梗前后传导速度统计图；d图为自发节律下模型组和红景天苷组大鼠左心室心梗前后传导速度统计图；e图为自发节律下模型组和红景天苷组大鼠右心室心梗前后传导速度统计图(*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001)；
30.图14中：a图为自发节律下模型组和红景天苷组大鼠左心室心梗前后传导离散代表图；b图为6hz刺激下模型组和红景天苷组大鼠左心室心梗前后传导离散统计图；c图为6hz刺激下模型组和红景天苷组大鼠右心室心梗前后传导离散统计图；d图为自发节律下模型组和红景天苷组大鼠左心室心梗前后传导离散统计图；e图为自发节律下模型组和红景天苷组大鼠右心室心梗前后传导离散统计图(*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001)。
具体实施方式
31.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.下面将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
33.本发明针对目前缺血再灌注心律失常存在的治疗方案有限，有待进一步开发的问题，提供一种采用新的策略来干预缺血再灌注心律失常的参考方案：红景天苷在制备干预缺血再灌注心律失常的药物中的应用。
34.本发明优选实施例中，红景天苷用于降低缺血再灌注心律失常的发生概率。
35.本发明优选实施例中，红景天苷的浓度为5-75μg/ml(例如，5μg/ml、 10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml或 75μg/ml)。
36.本发明优选实施例中，红景天苷通过加快心肌缺血区传导速度，减小传导离散度，干预心肌缺血再灌注心律失常。
37.本发明优选实施例中，红景天苷的浓度为5μg/ml(红景天苷用于干预由于缺血再灌注心律失常所造成的传导阻滞和/或传导离散程度增加时，浓度优选为5μg/ml)。
38.本发明优选实施例中，缺血再灌注心律失常为大鼠离体心脏缺血再灌注过程中发生的心律失常。即，红景天苷可用于干预大鼠缺血再灌注心律失常、降低大鼠缺血再灌注心律失常发生的概率、增加缺血再灌注心律失常大鼠的传导速度或减小缺血再灌注心律失常大鼠的传导离散程度等中的任意一项或几项。
39.下面通过具体实施例对本发明的红景天苷在制备干预防缺血再灌注心律失常的药物中的应用进行详细说明。
40.下面实施例中：
41.1.实验动物：
42.健康成年雄性sd大鼠(8周龄，重量为250-300g)共12只，购于北京斯贝福实验动物科技有限公司。
43.2.实验试剂：
44.nacl、kcl、na
2-phosphocreatine(磷酸肌酸钠)、mg-atp、d-glucose (d-葡萄糖)、l-glutamic acid(l-谷氨酸)、nahco3、kh2po4、mgcl2、 cacl2·
2h2o均购自sigma公司；红景天苷来自北京索莱宝科技有限公司；异氟烷来自瑞沃德公司；肝素钠注射液来自成都市海通药业有限公司。
45.3.实验仪器：
46.mappinglab矩阵式电生理标测系统(ems64-usb-1003)、langendorff 灌流系统(河南省斯高电生理研究院)、刺激器(vcs-3001)、ecg记录系统(ecg302)、恒温水浴箱、蠕动泵、multiclamp700a放大器、1550a 数模转换器、拉制仪(p-97，sutter)。以上设备均由河南省斯高电生理研究院提供。
47.4.方法：
48.4.1.矩阵式多通道电生理标测
49.4.1.1.溶液配制：
50.表1：k-h液配置方法
[0051][0052]
注：kcl、kh2po4、mgcl2可配制为10
×
母液；溶液配好后需经0.22μm微孔滤膜过滤；使用前，提前30min充氧(95％o2，5％co2)饱和；取80ml已充氧的kh液于-20℃预冷，使用时为冰水混合物为佳。
[0053]
4.1.2.配制所用药物：
[0054]
红景天苷：20mg sal粉末+400μl超纯水，配成50mg/ml的红景天苷母液，避光保存在-20℃的冰箱内。
[0055]
肝素钠(1000u/ml)：生理盐水稀释为所需浓度(42ml生理盐水+8ml 肝素钠注射液)。
[0056]
4.2.实验步骤：
[0057]
4.2.1.sd大鼠称重，腹腔注射肝素钠(3125u/kg)抗凝，15分钟后，用异氟烷0.5ml密闭空间挥发麻醉，麻醉成功后行脱颈处死；
[0058]
4.2.2.将处死的大鼠置于实验台固定四肢，腹部喷涂酒精消毒。逐层剪开胸部皮肤、筋膜及肌肉组织，使剑突暴露，用镊子夹起剑突，剪破膈膜，并沿左、右肋中部剪开胸腔，暴露心脏。用镊子夹起肺部组织，向上提起，使心脏悬空，沿肺后部快速剪下心脏及周围相关组织，并置于用培养皿盛装的预冷k-h溶液中；
[0059]
4.2.3.剪去肺脏，撕开胸腺后可见主动脉，仔细剪去主动脉周围多余组织 (为确认血管，可用镊子背部轻压心室，使残留在心室中的血液从主动脉排出)；
[0060]
4.2.4.双手持镊子夹起游离好的主动脉，将主动脉连接到灌流针上，用4 号线结扎住主动脉与灌流针出口处，使用注射器灌流心脏使心脏恢复跳动并泵出残血，关闭通道阀后进行转移，预先开启灌流系统，并迅速将灌流针连接至灌流器上(注：连接到灌流系统之前注意排除灌流针接口处气泡)，心脏用k-h液持续逆行灌注，等待心脏恢复稳定心率及节律(心率需保持在 270次/分以上，节律规整无早搏，心电图波形正常)，期间可继续修剪残余组织。
[0061]
4.3.电标测实验步骤：
[0062]
在心脏稳定灌流15分钟后开始进行循环k-h溶液，容器内及管道中的循环k-h溶液量为70ml，并立即贴附ecg(心电图)电极于窦房结与心尖部，贴附刺激电极于心尖部，显示1-64通道的矩阵式多通道电生理标测电极笔(pa06408080301)贴附于左心房，显示65-128通道的矩阵式多通道电生理标测电极笔(pa06408080301)贴附于左心室(示意图如图1，实物图如图2)。稳定后记录自发和串刺激节律下心脏的ecg和场电位的信号以及给予s1s2刺激得到的心室的有效不应期(verp)。用移液枪吸取一定体积的红景天苷母液加入含70ml k-h液的langendorff灌流系统中分别稀释成终浓度为1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml从低浓度到高浓度依次循环给药，进行量效关系检测，并分别于1、2、3、5、10分钟进行常规数据记录(记录自发节律下心脏ecg和场电位的信号)，10分钟后记录6hz 及erp数据(串刺激节律下心脏的ecg和场电位的信号并且给予s1s2刺激后测得心室的有效不应期(verp))，观察其变化(步骤如图3所示)，给完药后用langendorff灌流系统洗脱10分钟，分别记录自发节律下1、2、3、 5、10分钟时ecg和场电位的信号，串刺激节律下洗脱10分钟时心脏的ecg和场电位的信号并且给予s1s2刺激后测得心室的有效不应期(verp)。
[0063]
正式实验时，1-64通道的矩阵式多通道电生理标测电极笔 (pa06408080303)贴附于左心室，65-128通道的矩阵式多通道电生理标测电极笔(pa06408080303)贴附于右心室(示意图如图4，实物图如图5)。
[0064]
模型组：在左前降支附近用一根2号尼龙线做垫线，6号线进行结扎，缺血时间为15分钟，分别在第1、2、3、5、10、15分钟进行常规记录数据 (记录自发节律下心脏ecg和场电位的信号)，期间出现异常心律随时记录。 15分钟结束后记录6hz及erp数据(串刺激节律下心脏ecg和场电位的信号并且给予s1s2刺激后测得心室的有效不应期(verp))，观察其变化。随后抽出2号线并剪开结扎线进行复灌操作(实物图如图6)，同时连续记录1分钟心电图(ecg)变化，然后再记录2、3、5、10、15分钟时自发节律下ecg和场电位的信号。
[0065]
红景天苷组：结扎前用移液枪吸取一定体积的红景天苷母液加入含 70ml k-h液
的langendorff灌流系统中稀释成终浓度为5μg/ml进行循环，预保护10分钟后进行与上述模型组相同的操作。拆线后继续进行复灌，在拆线的同时记录1分钟的ecg的变化，然后再记录2、3、5、10、15分钟时的数据(自发节律下ecg和场电位的信号)。
[0066]
实验结束后，收拾实验台面，用去离子水冲洗整个灌流系统，红景天苷组结束后需使用50％酒精溶液浸泡灌流系统所用的容器和管道30分钟。
[0067]
4.3.1不同浓度红景天苷对正常大鼠心脏电生理特性的影响：
[0068]
本实验采用矩阵式多通道电标测技术检测在不同浓度红景天苷 (1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml)存在下，正常sd大鼠自发时左心房(la)、左心室(lv)场电位电信号和pseudo ecg ii导联，串刺激和s1s2刺激时lv场电位电信号的变化。
[0069]
图7显示了正常langendorff灌流心脏在不同浓度sal灌流下左心室的传导等时图，矩阵式64通道电极中深红色为最先兴奋点，深蓝色为最后兴奋点，通过颜色变化可以直观的观察在64个通道范围内的传导变化。图7显示，随着sal浓度的增加，传导时间变短，即传导速度加快；
[0070]
6hz频率刺激时，不同浓度的红景天苷对左心室传导速度的影响统计如图8：在给药至5μg/ml时，左心室传导速度相对最快，与模型组相比具有明显差异(*表示p＜0.05)。
[0071]
4.3.2.检测红景天苷对缺血再灌注sd大鼠心脏的保护作用
[0072]
为探究miri(缺血再灌注损伤)大鼠发生早后除极和迟后除极、室性心律失常的概率以及红景天苷干预后是否会改善，我们检测了大鼠离体心脏急性心梗前、后及复灌后电信号变化，自发时lv、rv场电位电信号和ecg ii 导联，串刺激、s1s2刺激时lv、rv场电位电信号。
[0073]
(1)ecg结果显示：缺血再灌后大鼠不同程度发生室性心律失常，给予5μg/ml的红景天苷进行预保护的大鼠未出现心律失常，详见图9。
[0074]
(2)电标测结果提示：模型组大鼠6只在剪断结扎线后均出现室性心动过速，随后出现心室颤动。红景天苷6只大鼠中在剪断结扎线后有2只未出现心室颤动，剩余4只出现室性心动过速后发生心室颤动，红景天苷干预后心律失常发生率比较后可见较模型组有明显下降(如图10，图10中的“model”即为模型组miri)；
[0075]
(3)根据模型组与红景天苷结扎前后心电图对比图(图11)可知：模型组与红景天苷组在结扎前降支后均出现st段升高，提示造模成功，但第15 分钟时红景天苷组st段升高幅度较模型组低；
[0076]
(4)模型组与红景天苷在结扎前降支后均出现st段升高，提示造模成功，但第15分钟时所记录数据经对比后提示红景天苷组st段升高幅度较模型组低(如图12)；
[0077]
(5)各通道所示心电图(左，右)心室在自发节律和6hz节律下传导速度和传导离散)进行对比提示结扎后模型组较红景天苷组传导速度明显减慢，离散度明显增加(如图13、14)。
[0078]
由13图可知：图a为结扎前后模型组与红景天苷的传导等势图，在左心室接受6hz刺激下，结扎前(图13a左)模型组(model)与红景天苷组 (sal)传导时间与传导方向未见明显差异，但结扎后(图13a右)可见无论模型组(mi)还是红景天苷组(sal+mi)传导速度均出现减慢，且模型组(mi) 较红景天苷组(sal+mi)传导时间明显延长，传导先后顺序与方向发生明显改变；图b可见6hz刺激下，无论模型组还是红景天苷组，结扎后传导速度均较结扎前
明显下降(模型组p＜0.01，红景天苷组p＜0.05)，组内比较提示红景天苷组在结扎前较模型组传导速度增快(p＜0.05)，结扎后虽然两组传导速度均下降，但模型组较红景天苷组传导速度下降更明显(p＜0.01)；右心室为未梗死区域，故图c可见正常心肌细胞在结扎前后红景天苷组较模型组传导速度明显加快(p＜0.05)，但两组结扎前后进行对比均无统计学意义(模型组p＝0.84，红景天苷组p＝0.53)；d图为自发节律下传导速度变化统计图，可见模型组与红景天苷组结扎后传导速度均较结扎前明显下降(p ＜0.001)，但结扎前红景天苷组较模型组传导速度增快(p＜0.05)，结扎后两组对比虽无统计学差异，但红景天苷组传导速度仍快于模型组；e图为右心室检测正常心肌细胞时可见无论结扎前后，虽然红景天苷组较模型组在自发节律下传导速度增快，但未见明显差异(p＞0.05)。
[0079]
如图14可知，图a为自发节律下模型组和红景天苷组大鼠左心室心梗前后传导离散代表图，可见模型组离散度较大，而红景天苷组离散度较小； b图可见结扎前在6hz刺激下模型组和红景天苷组大鼠左心室传导离散度未见明显差异(p＝0.92)，结扎后两组离散度随均增加，但红景天苷组离散度较模型组离散度增加低(p＜0.01)，且结扎后模型组离散度与结扎前相比差异明显(p＜0.001)，虽然红景天苷组在结扎后离散度增加，但与结扎前相比无明显统计学意(p＝0.17)；c图为6hz刺激下模型组和红景天苷组大鼠右心室心梗前后传导离散统计图，可见右心室(正常心肌区域)无论在结扎前后，模型组与红景天苷组间相比均无明显统计学差异，但红景天苷组在结扎前后的差异较模型组结扎前后的差异更小(模型组p＝0.54，红景天苷组 p＝0.87)；d图可知在自发节律下，在结扎前模型组与红景天苷组左心室的离散度无明显差异(p＝0.85)，但在结扎后模型组较结扎前离散度明显增加 (p＜0.001)，同时与红景天苷组相比也提示差异显著(p＜0.001)，而红景天苷组在结扎前后的离散度无明显差异(p＝0.11)；从e图可知在自发节律下，模型组和红景天苷组大鼠右心室心梗前后传导离散度均无明显差异。
[0080]
5.研究结论：
[0081]
尽管近些年来导管消融和器械治疗在抗心律失常的治疗上取得了巨大进展，药物仍然是治疗缺血性再灌注心律失常的主要方式。目前传统中医药越来越成为干预措施之一，但由于机制不明其作用受限。
[0082]
红景天是目前治疗心脑血管疾病、神经系统疾病、肿瘤性疾病的重要药物之一，其作用机制目前已被广泛研究。在心血管疾病领域，更是有着举足轻重的作用。本发现首次采用矩阵式多通道电生理标测技术探析红景天苷干预心肌缺血再灌注损伤的作用机制，为中医药治疗心律失常尤其是缺血再灌注后心律失常提供新的治疗策略和可参数据。
[0083]
我们发现红景天苷在正常心肌中有加快心肌细胞间传导速度的作用，尽管在正常心肌中的作用并不十分显著，但是加快传导的药物在过去抗心律失常药物中是极少的。我们探讨了在心梗后传导减慢的心肌中是否有更显著的效果，结果显示，红景天可显著加快传导速度和减少传导离散度，同时对缺血再灌注后的恶性心律失常的发生率也有显著的降低。
[0084]
本次实验采用的是应用矩阵式多通道电生理标测技术研究在缺血再灌注后心脏电生理变化，目前国内尚无对红景天苷在心律失常方面的研究。矩阵式多通道电标测技术是心律失常研究、抗心律失常药物研发、心梗心衰等疾病的机理阐释以及药物心脏安全性评价等应用的重要技术手段。多通道电标测技术在同步记录多点电信号、研究细胞与细胞
以及整体心肌组织中的电传导特性等应用中可以发挥重要功能，弥补了遥测、膜片钳等技术在组织层面应用的不足，这些技术的联合应用可使心脏电生理研究更加深入而全面。
[0085]
在本次实验项目中，我们运用红景天苷来明确心脏缺血再灌注后心律失常的预防机制，在量-效实验中，运用电标测分析结果发现，给予红景天苷溶液后，心脏的传导速度较未给药时加快，至5μg/ml时传导速度最快，超过 5μg/ml后传导速度逐渐降低，并且有效不应期的测量结果显示，给药至 5μg/ml时erp仍未出现明显缩短，故提示该浓度为有效剂量。在进一步的实验中，红景天苷组在结扎前后的传导速度均较模型组的传导速度增快，在正常右心室电标测结果中可见红景天苷较模型组显著加快传导速度。在结扎后，各通道表示的心电信号传导可见在模型组时离散度出现明显的增加，离散度增加容易导致心律失常的发生，但红景天苷组的离散度则出现明显下降。
[0086]
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。