一种纳米金刚石负载吲哚菁绿的方法及光热剂应用

1.本发明属于纳米金刚石加工技术领域，尤其涉及一种纳米金刚石负载吲哚菁绿的方法及光热剂应用。


背景技术：

2.吲哚菁绿(icg)是通过美国食品药品监督管理局(fda)认证的一种光热剂，吲哚菁绿(icg)是一种少有的能同时用于光热治疗和光动力治疗的光热剂，吲哚菁绿在吸收nir后，不仅可以促进局部升温进行光热治疗，还能释放活性氧以进行有效的光动力治疗；但吲哚菁绿也具有一定局限性,如浓度依赖性、稳定性差、易与蛋白质非特异性结合、缺乏靶向性等，其应用受到限制。为了克服此类问题,通常将吲哚菁绿搭载在载体上,以提高其稳定性,延长血液循环半衰期,提高肿瘤蓄积率,进一步增加光热疗法的疗效。纳米金刚石作为一种生物相容性良好的碳材料，具有可调谐的表面化学，并可与生物分子产生强烈的吸附或共轭作用，将生物分子负载于表面。因此可以改变纳米金刚石表面基团使其富含正电荷，通过静电相互作用将吲哚菁绿负载在纳米金刚石上，减少吲哚菁绿的生物毒性并增强其光热稳定性。
3.现今国内外研究情况来看，纳米金刚石与吲哚菁绿复合粒子的合成主要为将纳米金刚石提纯后，再用富含正电荷的聚合物对纳米金刚石进行涂覆，最后再吸附吲哚菁绿，从而搭建光热治疗的纳米平台。使用聚多巴胺涂覆纳米金刚石后再搭载吲哚菁绿后制备了复合纳米粒子用于胶质母细胞瘤癌症的光热治疗(maziukiewicz d,b f,coy e,et al.nds@pda@icg conjugates for photothermal therapy of glioblastoma multiforme[j].biomimetics,2019,4(1):3.)。发现该复合纳米粒子具有40％以上的高光热转换效率，光热治疗结果良好且能更快根除胶质母细胞瘤细胞。harvey等人(harvey s,raabe m,ermakova a,et al.transferrin-coated nanodiamond
–
drug conjugates for milliwatt photothermal applications[j].advanced therapeutics,2019,2(11):1900067)采用l-3,4-二羟基苯丙氨酸在荧光纳米金刚石上聚合后再与转铁蛋白结合，最后搭载吲哚菁绿得到一种复合光热材料，提高了其胶体稳定性和细胞摄取率，并且在非常低的能量摄入下(≈90mw/cm2)便能表现出强烈的光热效应。以上对于纳米金刚石光热效应的应用研究还局限于细胞阶段，没有植入小鼠体内进行肿瘤细胞消融实验。cui等人(cui x y,liang z y,lu j q,et al.a multifunctional nanodiamond-based nanoplatform for the enhanced mild-temperature photothermal/chemo combination therapy of triple negative breast cancer via an autophagy regulation strategy[j].nanoscale,2021,13(31):13375-89.)近期报道了纳米金刚石与吲哚菁绿的复合物更多的生物用途，他们先用硫酸鱼精蛋白修饰纳米金刚石。同时将吲哚菁绿和小分子抑制剂与纳米金刚石结合，然后将带负电荷的透明质酸组装到外表面，最后将阿霉素通过静电相互作用搭载构成复合纳米粒子。发现该复合纳米粒子不仅具有强烈的光热效应，能被细胞摄取，还能进行体内的荧光和光声成像；并具有良好的靶向性，实现了小鼠的体内肿瘤治疗；但对
于吲哚菁绿在光动力治疗方面的应用没有进行深入探究。
[0004]
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0005]
(1)现有技术不能有效改善吲哚菁绿光热稳定性差以及纳米金刚石本身的光热效应微弱的问题。
[0006]
(2)现有技术获得的复合纳米颗粒光热升温效果易改变，并且在细胞中的细胞摄取率低。


技术实现要素：

[0007]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种纳米金刚石负载吲哚菁绿的方法及光热剂应用。具体涉及一种纳米金刚石负载吲哚菁绿icg的方法及作为光热剂在生物医药领域中的应用。
[0008]
本发明是这样实现的，一种纳米金刚石负载吲哚菁绿的方法包括以下步骤：
[0009]
通过化学法用乙二胺、丙二胺和氨水直接对氧化纳米金刚石进行胺化改性；
[0010]
并将三种胺化改性后的纳米金刚石分别通过静电相互作用搭载吲哚菁绿，制备nd-etnh2@icg、nd-prnh2@icg和nd-nh2@icg复合纳米粒子并测试所述复合纳米粒子的负载率和分散性。
[0011]
进一步，在室温条件下将纯化纳米金刚石粉体与乙二胺、丙二胺、氨水，置于研磨釜中进行研磨，研磨后的混合物离心分离、抽滤，并在离心力为8000g下离心10min，获得澄清透明的黑色胶体溶液，选择出合适粒径的纯化纳米金刚石粉体。
[0012]
进一步，将均匀分散在二甲亚砜的纯化纳米金刚石溶液，加入胺化试剂，通过油浴加热将其缓慢加热至105-250℃并在此温度下保温一定时间；反应结束后，将溶液冷却至室温，并在离心力为8000g的条件下离心获得胺化nds粗产品；向粗产品中加入100ml n,n-二甲基甲酰胺溶液超声洗涤15min，之后在离心力为8000g的条件下再次离心重复三次，最终获得胺化nds。
[0013]
进一步，称一定量吲哚菁绿溶入去离子水中，配置一定浓度的吲哚菁绿溶液；将胺化纳米金刚石胶体溶液与吲哚菁绿溶液混合中；之后将溶液的ph调至小于6，加入磁子后在黑暗条件及室温环境下搅拌反应24h；反应完成后将溶液离心后再用去离子水洗涤离心三次，收集每次离心的上清液；获得胺化纳米金刚石负载吲哚菁绿复合纳米粒子的溶液，在避光条件下保存用于后续的负载率和分散性测试。
[0014]
进一步，在通过化学法用乙二胺、丙二胺和氨水直接对氧化纳米金刚石进行胺化改性中，胺化纳米金刚石胶体溶液为nd-etnh2、nd-prnh2和nd-nh2三种复合纳米粒子当中的一种或几种混合物，溶液浓度为0.01％～10％。
[0015]
进一步，所述吲哚菁绿溶液浓度为0.01％～10％。
[0016]
进一步，所述溶液的ph调至小于6。
[0017]
本发明的另一目的在于提供一种所述纳米金刚石负载吲哚菁绿的方法制备的负载icg胺化纳米金刚石。
[0018]
本发明的另一目的在于提供一种所述负载icg胺化纳米金刚石在制备用于对癌细胞进行抑制的诊疗制剂上的应用。
[0019]
进一步，在对癌细胞进行凋亡实验中，负载icg胺化纳米金刚石浓度为0.001～
2mg/ml。
[0020]
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0021]
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
[0022]
本发明针对吲哚菁绿光热稳定性差以及纳米金刚石本身的光热效应微弱的问题，先对氧化爆轰纳米金刚石使用乙二胺、丙二胺和氨水三种胺化试剂进行胺化，并通过静电相互作用让胺化纳米金刚石直接负载吲哚菁绿，获得了具有良好光热稳定性的复合纳米颗粒；三次循环后其光热升温效果基本保持不变，并且在hepg2细胞中的细胞摄取率最高。
[0023]
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
[0024]
本发明涉及将吲哚菁绿搭载在胺化改性的纳米金刚石的制备方法和在细胞标记中的应用具有如下有益效果：通过化学改性法，使用乙二胺、丙二胺和氨水对氧化纳米金刚石进行胺化表面改性，并直接将吲哚菁绿搭载在胺化改性的纳米金刚石上，得到nd-etnh2@icg、nd-prnh2@icg和nd-nh2@icg三种复合纳米粒子以提升吲哚菁绿的光热稳定性和细胞摄取率。并测试了上述粒子的荧光性能、光热性能以及细胞摄取率，实验证明它们的荧光强度和光热效应均得到了较为明显的提升，并且提高了细胞摄取率。为纳米金刚石在荧光标记、光热治疗、药物递送等方面的研究提供了新的策略。
[0025]
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
[0026]
(1)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
[0027]
直接将吲哚菁绿搭载在胺化改性的纳米金刚石上，得到高达80％的负载率的nd-etnh2@icg、nd-prnh2@icg和nd-nh2@icg三种复合纳米粒子以提升吲哚菁绿的光热稳定性和细胞摄取率。
[0028]
(2)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
[0029]
未见高达80％的icg负载率的复合纳米粒子。
[0030]
附图说明
[0031]
图1是本发明实施例提供的纳米金刚石负载吲哚菁绿的方法流程图；
[0032]
图2是本发明实施例提供的吲哚菁绿在去离子水中的标准曲线图；
[0033]
图3是本发明实施例提供的吲哚菁绿在磷酸盐缓冲液中的标准曲线图；
[0034]
图4是本发明实施例提供的纳米金刚石ftir谱图；
[0035]
图5是本发明实施例提供的纳米金刚石的粒径分布图；
[0036]
图6是本发明实施例提供的复合纳米粒子的粒径分布图；
[0037]
图7是本发明实施例提供的吲哚菁绿与复合纳米粒子的光热升温曲线图；
[0038]
图8是本发明实施例提供的吲哚菁绿和复合纳米粒子的光热稳定性曲线图；
[0039]
图9是本发明实施例提供的吲哚菁绿和复合纳米粒子的光热稳定性图；
[0040]
图10是本发明实施例提供的未经光照作用的细胞系其细胞核被染为均匀的蓝色荧光图；
[0041]
图11是本发明实施例提供的而经光照作用后，细胞核发生明显的固缩现象。
具体实施方式
[0042]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0043]
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
[0044]
如1所示，本发明实施例提供的纳米金刚石负载吲哚菁绿的方法包括：
[0045]
s101，通过化学法用乙二胺、丙二胺和氨水直接对氧化纳米金刚石进行胺化改性。
[0046]
s102，并将三种胺化改性后的纳米金刚石分别通过静电相互作用搭载吲哚菁绿，制备nd-etnh2@icg、nd-prnh2@icg和nd-nh2@icg三种复合纳米粒子并测试它们的负载率和分散性。
[0047]
光热测试结果表明低浓度的胺化纳米金刚石的光热效应较弱；三种复合纳米粒子以及单纯的吲哚菁绿在相同时间的近红外光照射下的升温曲线较为接近，表明吲哚菁绿搭载到纳米金刚石上并未被掩蔽；通过三个循环光照的光热稳定性曲线表明三种复合纳米粒子的光热稳定性均优于单纯的吲哚菁绿；通过hepg2的细胞摄取测试发现三种复合纳米粒子在4h后的细胞摄取率均高于单纯的吲哚菁绿，得到了有效的提升。
[0048]
在一个优选的实施方案中，选择合适粒径的纯化纳米金刚石粉体，在室温条件下将所述纯化纳米金刚石粉体与乙二胺、丙二胺、氨水，置于研磨釜中进行研磨，研磨后的混合物离心分离、抽滤，并在离心力为8000g下离心10min，获得澄清透明的黑色胶体溶液。
[0049]
在一个优选的实施方案中，将均匀分散在二甲亚砜的纯化纳米金刚石溶液，加入胺化试剂，通过油浴加热将其缓慢加热至105-250℃并在此温度下保温一定时间。反应结束后，将溶液冷却至室温，并在离心力为8000g的条件下离心获得胺化nds粗产品。向粗产品中加入100ml n,n-二甲基甲酰胺溶液超声洗涤15min，之后在离心力为8000g的条件下再次离心重复三次，最终获得胺化nds。
[0050]
在一个优选的实施方案中，称一定量吲哚菁绿溶入去离子水中，配置一定浓度的吲哚菁绿溶液。将胺化纳米金刚石胶体溶液与吲哚菁绿溶液混合中。之后将溶液的ph调至小于6，加入磁子后在黑暗条件及室温环境下搅拌反应24h。反应完成后将溶液离心后再用去离子水洗涤离心三次，收集每次离心的上清液。获得胺化纳米金刚石负载吲哚菁绿复合纳米粒子的溶液，在避光条件下保存用于后续的性能测试。
[0051]
胺化纳米金刚石对吲哚菁绿的负载率可达80％，负载吲哚菁绿的复合纳米粒子的光热稳定性改善，三次循环后其光热升温效果基本保持不变，并且在hepg2细胞中的细胞摄取率达到68.54
±
0.03％。
[0052]
本发明上述所述技术方案中的纯化纳米金刚石粉体可以是市售产品，也可以是爆轰合成的纯化后的纳米金刚石。在一个优选的实施方案中，使用的纳米金刚石原粉为爆轰法所得的团聚体，其粒径从几十纳米到十几微米不等，所述纳米金刚石原粉中纳米金刚石
含量为80～99wt％。
[0053]
在一个优选的实施方案中，所述胺化纳米金刚石胶体溶液为nd-etnh2、nd-prnh2和nd-nh2三种复合纳米粒子当中的一种或几种混合物，溶液浓度为0.01％～10％，优选0.05％～5％。
[0054]
在一个优选的实施方案中，所述吲哚菁绿溶液浓度为0.01％～10％，优选0.05％～5％。
[0055]
在一个优选的实施方案中，所述溶液的ph调至小于6；优选ph1-4。
[0056]
在一个优选的实施方案中，负载icg胺化纳米金刚石作为诊疗制剂对癌细胞进行抑制的浓度为0.001～2mg/ml。
[0057]
本发明下述各实施例中纳米金刚石/氧化纳米金刚石的粒径测试是利用马尔文zate电位仪进行测试的，具体是采用动态光散射法(dls)原理，将样品配制成一定浓度的稀溶液测试，前3次时间设置为120s，之后时间设置为30s，在常温下进行粒径测定。
[0058]
实施例1
[0059]
本实施例的一种可在溶液中单分散的表面胺化纳米金刚石的制备方法，步骤如下：
[0060]
取350g直径为0.08～0.12mm的球磨珠放入体积为100ml大小的可密封的球磨罐中，0.5g纳米金刚石(某化工股份有限公司)，加入10ml去离子水超声震荡30min使其分散均匀，将纳米金刚石悬浮液和10ml 25％氨水放入球磨罐中，设置球磨机(型号：qm-1sp2，某大学仪器厂)转速为580r/min，球磨时间为2h，然后移除珠子，滤过溶液，对产物用乙醇冲洗，干燥，获得了黑色粉末，红外图谱如图4。
[0061]
实施例2
[0062]
本实施例的一种可在溶液中单分散的表面胺化纳米金刚石的制备方法，步骤如下：
[0063]
首先称取0.300g的氧化nds，将其分散在30ml二甲亚砜溶剂中并超声分散15min使其均匀分散。在此基础上采用乙二胺、1,3-丙二胺作为胺化试剂对其胺化，具体为：将球磨得到的均匀分散在二甲亚砜的氧化nds溶液取出，加入到50ml烧瓶中。之后向其中加入5ml胺化试剂，通过油浴加热将其缓慢加热至150℃并在此温度下保温5h。反应结束后，将溶液冷却至室温，并在8000rpm的条件下离心获得胺化nds粗产品。向粗产品中加入100ml n,n-二甲基甲酰胺溶液超声洗涤15min，之后在8000rpm的条件下再次离心重复三次，最终获得胺化nds。
[0064]
为了提高胺化纳米金刚石产率，实施例中的纳米金刚石可采用氧化的方法去除石墨相，可以但不局限用下述工艺进行纯化处理，步骤如下：
[0065]
将10g纳米金刚石灰色粉体与30g～50g浓硫酸、10g高锰酸钾在反应釜中反应，控制所述反应釜中的反应温度为220℃，反应时间为8h，使纳米金刚石灰色粉体浓硫酸介质中经高锰酸钾高温下氧化纯化处理，然后用去离子水将产物超声清洗至中性，离心、干燥，获得纯化纳米金刚石粉体；所述纳米金刚石灰色粉体为市售产品，纳米金刚石灰色粉体中金刚石含量大于90％；所述浓硫酸的质量分数为98％。
[0066]
实施例3胺化纳米金刚石负载吲哚菁绿复合纳米粒子。
[0067]
称量2.000mg吲哚菁绿溶入8ml去离子水中，将上述胺化纳米金刚石胶体溶液分别
稀释为1mg/ml，取2ml加入吲哚菁绿溶液中，使反应物质量比为1:1。之后使用0.1mol/ml盐酸将溶液的ph调至2.5，加入磁子后在黑暗条件及室温环境下搅拌反应24h。反应完成后将溶液透析48h除去未吸附的吲哚菁绿，每4h更换一次去离子水。透析完成后将溶液冻干浓缩，获得200μg/ml的胺化纳米金刚石负载吲哚菁绿复合纳米粒子的溶液，在避光条件下保存用于后续的性能测试。
[0068]
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
[0069]
基于上述实施例提供的负载icg胺化纳米金刚石作为诊疗制剂的应用。
[0070]
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
[0071]
(一)红外光谱测试
[0072]
使用tensor 27型傅里叶变换红外光谱仪(ftir)对样品进行测试。各样品与kbr粉末均按质量比为1:100混合均匀，研磨后在压片机上压制成薄膜片，在4000cm-1
～400cm-1
范围内进行扫描测试。
[0073]
(二)粒径测试
[0074]
使用zetasizer advance series-pro型纳米粒度及zeta电位仪对样品进行粒径测试。将样品配置成1mg/ml的分散液并在25℃下进行测试，将测试间隔时间设置为120s。
[0075]
(三)胺化纳米金刚石负载吲哚菁绿复合纳米粒子的负载率检测
[0076]
精密称取10.000mg吲哚菁绿于100ml的棕色容量瓶中，用去离子水溶解，配制成浓度为100μg/ml的母液。然后取一定量母液用去离子水进行稀释至以下浓度：1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0μg/ml，使用美国安捷伦公司生产的cary 60型紫外分光光度计测定吸光度，以吸光度(a)对吲哚菁绿浓度(c)作线性回归，并绘制吲哚菁绿的标准曲线图2。
[0077]
表1吲哚菁绿在去离子水中的紫外吸收值
[0078][0079]
然后，将反应前的吲哚菁绿母液的吸光度与反应后离心得到的上清液吸光度的差值带入到标准直线方程，计算出所对应的吲哚菁绿的浓度并作差得出复合纳米粒子的吲哚菁绿浓度。最后，根据公式(1)计算三种复合纳米粒子的药物负载率：
[0080]
icg loading capacity(％)＝(w
1-w2)/w
nd
×
100
ꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0081]
w1、w2和w
nd
分别代表母液和上清液的吲哚菁绿以及纳米金刚石的质量。其中，w1和w2通过将计算出的吲哚菁绿浓度与其对应体积相乘所得。
[0082]
(四)光热性能测试
[0083]
将样品溶于去离子水制成200μg/ml的分散液用于光热性能的测试，去离子水和
160μg/ml的吲哚菁绿溶液作为对照组。使用移液枪将样品吸取100μl加入96孔板内，再用808nm激光器在1w/cm2的功率密度下照射样品5min，同时每隔10s用近红外热成像仪记录样品的温度变化。
[0084]
(五)光热稳定性测试
[0085]
使用移液枪将200μg/ml的样品分散液吸取100μl加入96孔板内，160μg/ml的吲哚菁绿溶液作为对照组。再用808nm激光器在1w/cm2的功率密度下照射样品5min，冷却5min，循环3次，同时每隔10s用近红外热成像仪记录样品的温度变化。
[0086]
(六)光热稳定性的计算
[0087]
为了定量地评价样品的光热稳定性，现定义表示光热稳定性程度的公式(2)，并计算如下：
[0088]
photothermal stability(％)＝t/t0×
100
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0089]
其中，t0代表初次光热循环过程中样品溶液达到的最高温度；t代表从第二次光热循环开始，每次循环过程中样品溶液达到的最高温度，根据计算结果定量分析样品的光热稳定性。
[0090]
(七)细胞摄取
[0091]
精密称取10.000mg吲哚菁绿于100ml的棕色容量瓶中，用磷酸盐缓冲液溶解，配制成浓度为100μg/ml的母液。然后取一定量母液用磷酸盐缓冲液进行稀释至以下浓度：1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0μg/ml，用美国安捷伦公司生产的cary 60型紫外分光光度计测定吸光度，以吸光度(a)对吲哚菁绿浓度(c)作线性回归，并绘制吲哚菁绿在磷酸盐缓冲液中的标准曲线图3。
[0092]
表2吲哚菁绿在磷酸盐缓冲液中的紫外吸收值
[0093][0094]
将消化好hepg2细胞分别接种于6孔细胞培养板中，在二氧化碳培养箱中培养24h后，每个孔加入1ml的40μg/ml三种复合纳米粒子分散液以及吲哚菁绿溶液，同时以同体积的磷酸盐缓冲液作为对照组，一式三份。然后，在二氧化碳培养箱中培养4h后取出培养板，吸取每个孔中的上清液后再用0.5ml的磷酸盐缓冲液溶液洗涤两次，除去附着在细胞上的样品溶液。用紫外——可见分光光度计测量上清液中的吸光度，计算出经过细胞摄取后上清液中剩余吲哚菁绿的浓度，从而得到hepg2细胞对不同样品的摄取率。
[0095]
(八)胺化纳米金刚石的表面化学组成，如图4纳米金刚石ftir谱图所示，图5中，(a)氧化纳米金刚石，(b)乙二胺胺化纳米金刚石，(c)丙二胺胺化纳米金刚石，(d)氨水胺化纳米金刚石。
[0096]
表3氧化纳米金刚石与胺化纳米金刚石红外谱图分析
[0097][0098]
从图4中可以看出，对氧化纳米金刚石，在3435cm-1
、1797cm-1
、1630cm-1
处出现的红外谱带分别为-oh伸缩振动、c＝o伸缩振动和-oh弯曲振动的红外谱带，说明纳米金刚石在氧化后表面存在羧酸基团。在1099cm-1
处出现的红外谱带为c-o-c伸缩振动，说明其表面含有醚键、内酯或酸酐等基团。对乙二胺胺化纳米金刚石，在1652cm-1
处出现了c＝o伸缩振动，即“酰胺
ⅰ”
带，在1530cm-1
处出现了c-n伸缩振动，即“酰胺
ⅱ”
带，这是由c-n伸缩振动和n-h弯曲振动在平面上耦合而产生的，表明在球磨过程中氧化纳米金刚石和乙二胺发生了酰胺化反应，生成了酰胺基团，乙二胺成功键接到纳米金刚石表面。对丙二胺胺化纳米金刚石和氨水胺化纳米金刚石，它们也在1652cm-1
附近也出现了c＝o伸缩振动(“酰胺
ⅰ”
带)，在1530cm-1
处出现了c-n伸缩振动(“酰胺
ⅱ”
带)，说明氧化后的纳米金刚石同样成功地与丙二胺和氨水发生了酰胺化反应并键接到纳米金刚石表面。
[0099]
(九)胺化纳米金刚石的分散性
[0100]
如图5纳米金刚石的粒径分布所示，图5中，(a)氧化纳米金刚石，(b)乙二胺胺化纳米金刚石，(c)丙二胺胺化纳米金刚石，(d)氨水胺化纳米金刚石。
[0101]
如图6所示，经过乙二胺和氨水胺化改性后的纳米金刚石相比于氧化纳米金刚石分散性更好，平均粒径分别为89nm和97nm，多分散性系数为0.192和0.243，且长期贮存后依旧为澄清透明的黑色分散液。经过丙二胺改性后的纳米金刚石平均粒径为114nm，多分散性系数为0.237。
[0102]
(十)复合纳米粒子的负载率
[0103]
将制得的三种复合纳米粒子分散液稀释后，通过紫外分光光度计测量和回归方程计算得到三种复合纳米粒子的负载率如下表4所示：
[0104]
表4复合纳米粒子的负载率
[0105][0106]
三种样品的负载率分别为80.14
±
0.23％、79.86
±
0.19％和79.98
±
0.11％，三种胺化纳米金刚石对吲哚菁绿的负载率差别不大。由于胺化纳米金刚石对吲哚菁绿的吸附原理是静电相互作用，所以胺化后纳米金刚石的表面氨基含量对吲哚菁绿的负载率有一定的影响。由热重结果可知，乙二胺胺化效果最好，其表面的氨基基团定量值分别为2.60mmol/g，故乙二胺胺化纳米金刚石对吲哚菁绿的负载率最高；氨水胺化纳米金刚石胺化效果其次，其表面的氨基基团定量值为1.83mmol/g，故氨水胺化纳米金刚石对吲哚菁绿的负载量
较乙二胺胺化纳米金刚石的负载量少；丙二胺胺化纳米金刚石的胺化效果最差，其表面的氨基基团定量值为1.34mmol/g，故丙二胺胺化纳米金刚石对吲哚菁绿的负载量最少。
[0107]
(十一)复合纳米粒子的分散性
[0108]
如图6复合纳米粒子的粒径分布所示，图6中，(a)nd-etnh2@icg，(b)nd-prnh2@icg，(c)nd-nh2@icg。
[0109]
三种胺化纳米金刚石在负载吲哚菁绿后的粒径都明显增加，分别为277nm、330nm和250nm，多分散性系数分别为0.256、0.187和0.223，且均为澄清深绿色分散液。粒径增加的原因主要有两个方面：一方面，胺化纳米金刚石搭载吲哚菁绿后，吲哚菁绿在纳米金刚石上堆叠使粒径增大；另一方面，搭载吲哚菁绿的复合纳米粒子与未搭载吲哚菁绿的胺化纳米金刚石结合，导致多个纳米复合粒子的团聚，也会导致粒径的增大。氨水胺化纳米金刚石由于表面的碳链最短，对吲哚菁绿的负载率也较低，因此粒径增加的幅度最小；丙二胺胺化纳米金刚石则由于表面碳链最长，初始粒径较大，所以吸附吲哚菁绿后平均粒径最大；乙二胺胺化纳米金刚石初始粒径最小，但其对吲哚菁绿的负载率较高，因此平均粒径增长幅度较氨水胺化纳米金刚石大。
[0110]
(十二)胺化纳米金刚石负载吲哚菁绿复合纳米粒子的光热升温曲线
[0111]
如图7吲哚菁绿与复合纳米粒子的光热升温曲线所示，图7中，a：温度增量曲线，b：温度增量微分曲线。(试样a：nd-etnh2@icg，试样b：nd-prnh2@icg，试样c：nd-nh2@icg，试样d：icg)。
[0112]
表5复合纳米粒子的温度增量
[0113][0114]
如图7中a所示，搭载了吲哚菁绿的三种胺化纳米金刚石在808nm近红外激光照射5min后大幅升温，温度增量分别为53.1℃、52.4℃和52.7℃，其温度变化的大小顺序与负载率的大小顺序相符合。表明胺化纳米金刚石在吸附吲哚菁绿后即使在低浓度下(200μg/ml)也具有强烈的光热效应，表现出优异的光热转换性能。并且比单纯的吲哚菁绿溶液的光热效应更为明显。以往相关的研究文献表明，肿瘤细胞的耐热性要低于正常组织细胞。当肿瘤细胞的温度达到42℃～47℃时便可以被消融。同时，局部高温可以诱导肿瘤细胞膜的性质发生改变，增加细胞膜的通透性和流动性，从而增强肿瘤细胞对载体的摄取，此时若纳米载体同时搭载了抗癌药物，便能进一步提高药物对肿瘤细胞的治疗效果。从图7中b可以看出，nd-etnh2@icg复合纳米粒子在近红外光照射20s时便达到了最快的升温速率，20s后的升温速率便逐渐下降；nd-prnh2@icg和nd-nh2@icg两种复合纳米粒子均在0s时便达到了最快升温速率，随后升温速率便快速下降，30s后升温速率缓慢下降。单纯的吲哚菁绿溶液在受到近红外光照射10s后的升温速率达到最快，随后升温速率便快速下降。说明吲哚菁绿和三种复合纳米粒子受到近红外光照射30s内便能快速升温，此时的温度增量达到15℃左右，达到了肿瘤细胞开始消融的温度(45℃)。说明胺化纳米金刚石负载吲哚菁绿后对吲哚菁绿的光
热升温情况没有明显影响。
[0115]
(十三)胺化纳米金刚石负载吲哚菁绿复合纳米粒子的光热稳定性曲线
[0116]
如图8吲哚菁绿和复合纳米粒子的光热稳定性曲线所示。在图9中观察到吲哚菁绿在第二次循环中的温度变化曲线出现了先上升然后下降的现象，并且在每次循环照射后吲哚菁绿的最高温度均有大幅降低，第一次循环的温度增量为51.9℃，第二次循环的温度增量便降至41.9℃，第三次循环的温度增量仅为32.1℃。该结果证明了单纯的吲哚菁绿具有较差的光热稳定性。在经过808nm近红外激光连续反复照射3次后，在每一次循环照射中，三种复合纳米粒子的最高温度均比游离的吲哚菁绿溶液温度高，每次循环的温度增量损失也均小于单纯吲哚菁绿的温度增量损失，说明当吲哚菁绿被负载到纳米金刚石表面后，其光热稳定性显著提高。对于三种胺化纳米金刚石负载吲哚菁绿的复合纳米粒子，它们的光热稳定性为nd-nh2@icg最优，nd-etnh2@icg其次，nd-prnh2@icg最差。造成这种现象的原因可能是胺化纳米金刚石表面氨基基团的碳链长度不同，导致胺化纳米金刚石和吲哚菁绿的结合紧密程度不同，进而影响了复合纳米粒子的光热稳定性。氨水胺化的纳米金刚石表面碳链最短，负载的吲哚菁绿与纳米金刚石的结合最紧密，因此nd-nh2@icg的光热稳定性最好，三次光热循环的温度增量的最大值分别为52.7℃、53.4℃和49.1℃；乙二胺胺化的纳米金刚石表面碳链长度比前者长一些，负载的吲哚菁绿与纳米金刚石的结合的紧密程度不如前者，因此nd-etnh2@icg的光热稳定性比前者弱一些，三次光热循环的温度增量的最大值分别为53.1℃、51.6℃和45℃；丙二胺由于碳链最长，丙二胺胺化纳米金刚石负载的吲哚菁绿与纳米金刚石结合地更为松散一些，在循环光照的过程中便会逐渐地从丙二胺胺化纳米金刚石上脱落，并发生光解，因此会观察到nd-prnh2@icg在循环光照的过程中的温度增量逐渐减少，三次光热循环的温度增量分别为52.4℃、47.5℃和39.1℃，其光热稳定性在三种复合纳米粒子中表现最差。
[0117]
(十四)胺化纳米金刚石负载吲哚菁绿复合纳米粒子的光热稳定性
[0118]
如图9吲哚菁绿和复合纳米粒子的光热稳定性所示。由图10可知，经过3次光照循环后，发现nd-nh2@icg的光热稳定性最优，第2、3次光热稳定性值分别为101.33％和93.17％；nd-etnh2@icg其次，第2、3次光热稳定性值分别为97.18％和84.75％；nd-prnh2@icg最差，第2、3次光热稳定性值分别为90.65％和74.62％。单纯的吲哚菁绿的光热稳定性衰减程度较为严重，第2、3次光热稳定性值分别仅为80.73％和61.85％。因此，三种复合纳米粒子的光热稳定性均优于单纯的吲哚菁绿，能够反复多次用于光热治疗。这些复合纳米粒子的光热稳定性提升的原因可能是吲哚菁绿在含氧条件下，通过近红外光照射，会产生活性氧，而活性氧作为电子供体，可以催化光诱导的吲哚菁绿分解
[
；而纳米金刚石对活性氧这一电子供体起到了调节和淬灭的作用，能够减少体系中活性氧的含量，减少光诱导吲哚菁绿分解的现象，进而提高吲哚菁绿的光热稳定性。
[0119]
(十五)复合纳米粒子在细胞中的细胞摄取率
[0120]
表6复合纳米粒子在hepg2细胞中的细胞摄取率
[0121][0122]
如表6所示，单纯的吲哚菁绿在hepg2细胞中的细胞摄取率仍为最低，为46.06
±
0.21％，而nd-nh2@icg的细胞摄取率最高，为68.54
±
0.03％，其次为nd-etnh2@icg，细胞摄取率为63.63
±
0.18％，nd-prnh2@icg因其粒径较大，在hepg2细胞中的摄取率仍低于另外两种复合纳米粒子，为56.53
±
0.05％。以上结果表明复合纳米粒子相比于单纯的吲哚菁绿，其细胞摄取率得到了较大的提升，并且肿瘤细胞对复合纳米粒子的摄取率更高，有望对肿瘤细胞的光热治疗进行进一步分析。
[0123]
(十六)细胞消融实验
[0124]
(1)将样品用pbs溶液稀释至40μg/ml，在12孔板中每个孔加入1ml样品，选用新鲜培养基作为对照组，样品均加入两个孔中，分为光照组和非光照组，在培养基中孵育4h。
[0125]
(2)孵育完成后，弃去含药培养基，用预冷的pbs洗细胞三次后，除去未被摄取的药物，更换为无血无双抗的新鲜培养基，无光照组在37℃下继续孵育。
[0126]
(3)光照组处理：使用808nm近红外激光器对孔板中样品进行照射，并用红外热像仪测温，当溶液温度达到47℃时则暂停照射，待温度降至37℃时继续照射至47℃，循环三次后放回培养箱中。
[0127]
(4)若孔板内样品温度无法升温至47℃，则持续照射5min后停止照射。
[0128]
(5)培养24h后通过荧光显微镜在明场观察细胞的消融情况。
[0129]
(6)加70％乙醇4℃固定10min；弃去乙醇，用pbs漂洗一次；
[0130]
(7)加10μg/ml hoechst 33258染料50μl，4℃避光染色15min；
[0131]
(8)用pbs漂洗三次，最后在培养孔内加入少量pbs；置于倒置荧光显微镜下观察拍照，uv激发。
[0132]
hoechst 33258是一种常用的细胞核染料，可用于活细胞染色及固定后细胞的染色。它与dna的结合是非嵌入式的，主要结合在dna的a-t碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
[0133]
未经光照作用的细胞系其细胞核被染为均匀的蓝色荧光。如图10；而经光照作用后，细胞核发生明显的固缩现象，如图11，并出现较明显的凋亡小体,细胞核边缘化呈月牙形，主核外有少量的弥散dna存在。
[0134]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。