一种胶原支架用于制备自粘组织修复材料的用途的制作方法

1.本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种胶原支架用于制备自粘组织修复材料的用途。


背景技术：

2.关节软骨属于透明软骨，是一种高度分化的组织，主要由大量排列高度有序的软骨细胞和细胞外基质构成，无感觉、运动或者自主神经支配，无滋养血管，其营养供应、代谢产物排出高度依赖关节液，具有自我修复能力的前体细胞难以到达损伤局部，透明软骨一旦受到损伤，其自身的修复能力非常有限。上世纪80年代，微骨折术就应用于小面积软骨缺损治疗，目前该技术手段是治疗软骨缺损的一种常规方法，但微骨折术适用于损伤面积小的缺损，所得新生软骨是纤维软骨的问题，对于较大缺损疗效差。因此，迫切需要修复软骨组织的技术手段及生物材料。
3.随着生物材料、组织工程和再生医学的逐步发展，自体骨软骨移植技术、自己软骨细胞移植术(aci)、自体软骨细胞移植叠加生物支架(maci)，及微骨折术叠加生物支架(amic)等技术手段先后被应用，amic技术在微骨折的基础上，提高疗效，适合中小、中、大面积的软骨缺损，被广泛应用，与此同时，软骨修复材料及产品应运而生，应用于软骨缺损修复。
4.胶原支架具有生物相容性好，毒性小，易降解，且降解产品氨基酸易被人体吸收，炎症反应小等特点，广泛应用于软骨修复产品。植入人体后为了固定胶原支架需要用吸收缝线缝合和生物胶固定。但目前未提及哪种胶原支架可以不经固定即可自粘于创面的。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种胶原支架用于制备自粘组织修复材料的用途，该胶原支架在关节软骨缺损修复手术过程中可以免缝和、免生物胶，可关节镜下。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种胶原支架用于制备自粘组织修复材料的用途，其特征在于，所述胶原支架按照如下方法制备得到：
8.(1)将浓度为5～40mg/ml胶原溶液平铺2～8mm厚，在-20～-80℃下冷冻12～24h成型，然后浸入高渗溶液12～24h中脱水，并挤压成膜；
9.(2)在所述膜表面再平铺一层2～8mm的胶原溶液，在-20～-80℃下冷冻干燥4～48h，得到双层材料；
10.(3)所述双层材料经交联剂交联3～8h，交联后的双层材料水洗后，再在-20～-80℃下冷冻干燥4～96h，得到胶原支架。
11.优选的，所述胶原溶液由来源于猪跟腱、牛跟腱、猪皮肤、牛皮肤或鼠尾的胶原i型、ii型或iii型胶原材料制备得到。
12.优选的，所述高渗溶液为盐浓度为50～340g/l的缓冲液；所述盐为氯化钠或氯化
钾；所述缓冲液为ph为7～8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲溶液、tris-盐酸缓冲溶液、巴比妥钠-盐酸缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液。
13.优选的，所述挤压采用梯度挤压，所述梯度挤压的压力为：50～100kg30～45秒、100～150kg30～45秒、150～200kg30～60秒、200～500kg30～60秒。
14.优选的，所述交联剂为戊二醛、京尼平、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺-n-羟基琥珀酰亚胺或1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
15.优选的，所述胶原支架包括致密层和多孔层，致密层的厚度为5～50μm，多孔层的厚度为1.5～5.5mm，多孔层的孔径为50～500μm，双层之间无缝连接，双层之间的连接力为0.1n～5n。
16.优选的，所述自粘修复材料为修复软骨组织、牙周组织或皮肤慢性创面的修复材料。
17.优选的，所述软骨组织为关节软骨组织；所述关节包括膝关节、踝关节、指关节和髋关节。
18.本发明提供了所述胶原支架的新用途，利用胶原支架的可粘附性，固定在缺损处，直至新生组织生成，材料降解吸收(1～6个月)，同时胶原支架会吸收骨髓基质干细胞，促进组织再生。所述胶原支架能够原位粘附，是由于致密层下的疏松多孔层产生液体虹吸力量，局部基团电荷力量，吸附微骨折术产生的骨髓血，其中凝血酶催化纤维蛋白/血小板等，胶原支架呈现凝胶化，固定10s～30min后，胶原支架可自粘附在缺损处。
19.该用途免除了关节开放式手术，手术全过程可以在关节镜下完成，无需缝合或生物胶粘附。将该性能用于手术具有手术创口小、病人痛苦小、术后反应下、并发症较少等特点，能够极大的减轻病人的痛苦。除此之外，可避免缝合过程导致正常软骨组织损伤，也可避免生物胶使用过程对微骨折孔的封堵，阻碍骨髓血基质干细胞渗出，导致疗效变差。
附图说明
20.图1为实施例1制备的胶原支架，(a)为胶原支架的外观，(b)为胶原支架的sem微观图；
21.图2为实施例1中胶原支架用于猪膝关节侧股骨髁软骨缺损修复的过程，左上图为造膜后髁软骨缺损状态(缺损直径10mm)，右上图为植入胶原支架后的状态，左下图为关节屈伸10次后支架仍在原位的状态，右下图为胶原支架原位粘附7天后的状态；
22.图3为实施例1中胶原支架用于猪膝关节滑车软骨缺损修复的过程，a为造膜后滑车软骨缺损状态(缺损直径10mm)，b为植入胶原支架后的状态，c为胶原支架原位粘附7天后的状态；
23.图4为实施例2中胶原支架用于猪膝关节滑车软骨缺损修复的过程，a为造膜后滑车软骨缺损状态(缺损直径14mm)，b为植入胶原支架后的状态，c为胶原支架原位粘附7天后的状态；
24.图5为实施例2中胶原支架用于猪膝关节髁软骨缺损修复的过程，a为造膜后髁软骨缺损状态(缺损直径14mm)，b为植入胶原支架后的状态，c为胶原支架原位粘附7天后的状态；
25.图6为实施例2中胶原支架植入7天后，粘附力学测试过程；
26.图7为实施例3中胶原支架用于滑车软骨缺损修复组织块侧切图，左图为胶原支架植入7天的组织，右图为微骨折术后7天的组织(有血凝块)；
27.图8为实施例4中胶原支架用于猪膝关节髁软骨缺损修复的过程，a为造膜后髁软骨缺损状态(缺损直径面积2.16cm2)，b为植入胶原支架后的状态，c为胶原支架原位粘附7天后的状态；
28.图9为实施例4中胶原支架用于猪膝关节滑车软骨缺损修复的过程，a为造膜后滑车软骨缺损状态(缺损直径面积2.72cm2)，b为植入胶原支架后的状态，c为胶原支架原位粘附7天后的状态；
29.图10为实施例4中胶原支架用于猪膝关节髁软骨缺损修复组织he图，a的放大倍数
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3.5倍，b为a中局部放大图，放大倍数
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8.5倍，箭头为胶原支架与组织的连接处；
30.图11为实施例4中胶原支架用于猪膝关节滑车软骨缺损修复组织he图，a的放大倍数
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3.5倍，b为a中局部放大图，放大倍数
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8.5倍，箭头为胶原支架与组织的连接处。
具体实施方式
31.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
32.实施例1
33.取20mg/ml的猪跟腱来源胶原蛋白溶液，平铺至尺寸为100mm
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100mm
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5mm的聚四氟乙烯凹槽模具中，放-20℃下16小时冷冻成型。将冷冻后的胶原浸入含nacl浓度为232g/l的磷酸盐缓冲溶液(磷酸氢二钠(na2hpo4)2.436g/l和磷酸二氢钾(kh2po4)0.8g/l，ph调至7.4)中24小时脱水。将脱水后的胶原整体用梯度压力(70～80kg30秒、100kg30秒、140～150kg30秒、200～210kg60秒)挤压成膜，再在致密膜上平铺浓度为5mg/ml的胶原溶液至5mm厚度。置于在-30℃预冷冻16小时，再在冷冻干燥机中抽干48小时。将冻干后的双层胶原用edc-nhs(edc和nhs浓度分别为20mg/ml和5mg/ml)交联3小时。将交联后的双层支架水洗3天，每天换水4次，再次在-30℃预冷冻16小时，再在冷冻干燥机中抽干60小时。将冻干后的支架剪切成所需的尺寸，密封包装，经20kgy的辐照剂量(γ射线)灭菌，即获得所述的胶原支架，如图1所示，图1(a)为胶原支架的外观，图1(b)为胶原支架的sem微观图。
34.按照以上方法制备的胶原支架，经脱水处理的胶原层会形成致密层，厚度为20μm，未经脱水处理的胶原层会形成多孔层，厚度为3mm，多孔层的孔径在200～300μm之间，多孔层的双层之间无缝连接，双层之间的连接力为0.74n。用该支架进行猪后腿膝关节侧股骨髁和滑车部位的损伤修复。
35.将80kg的猪后腿膝关节侧股骨髁和滑车部位，行全层软骨缺损造膜，缺损直径10mm(面积0.8cm2)。在缺损处进行微骨折打孔，将匹配尺寸的胶原支架多孔层朝向缺损处放入。固定3分钟后(未缝合、未使用生物胶)，关节复位后进行10次屈伸，胶原支架仍在原位。常规缝合创口。术后7天，取猪关节，发现缺损填充平整，胶原支架仍在原位，未脱落，跟缺损边缘粘附良好。猪膝关节侧股骨髁软骨修复过程如图2所示(箭头指向植入的软骨支架)，猪膝关节滑车软骨缺损修复过程如图3所示。
36.实施例2
37.取5mg/ml浓度的猪跟腱来源胶原蛋白溶液，平铺至尺寸为100mm
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100mm
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3mm的聚四氟乙烯凹槽模具中，放-80℃下12小时冷冻成型。将冷冻后的胶原浸入含nacl浓度为50g/l的枸橼酸-磷酸氢钠缓冲溶液(枸橼酸1.92g/l和磷酸氢二钠(na2hpo4)25.8g/l，ph调至8.0)中12小时脱水。将脱水后的胶原整体用梯度压力(50～70kg30秒、100～110kg30秒、150～170kg30秒、200～250kg30秒)挤压成膜，再在致密膜上平铺浓度为5mg/ml的胶原溶液至3mm厚度。置于在-20℃预冷冻8小时，再在冷冻干燥机中抽干12小时。将冻干后的双层胶原用浓度为0.05％(w/v)的戊二醛交联8小时。将交联后的双层支架水洗2天，每天换水3次，再次在-20℃预冷冻12小时，再在冷冻干燥机中抽干24小时。将冻干后的支架剪切成所需的尺寸，密封包装，经10kgy的辐照剂量(γ射线)灭菌，即获得所述的胶原支架。
38.按照以上方法制备的胶原支架，致密层厚度为20μm，多孔层厚度为2.5mm，多孔层的孔径在150～300μm之间，多孔层的双层之间无缝连接，双层之间的连接力为0.49n。用该支架进行猪后腿膝关节滑车部位和股骨髁软骨的损伤修复。
39.将猪龄6个月，体重约85kg的猪后腿膝关节滑车部位和股骨髁软骨，行全层软骨缺损造膜，缺损直径14mm(面积1.5cm2)。在缺损处进行微骨折打孔，将匹配尺寸的胶原支架多孔层朝向缺损处放入，固定5分钟后(未缝合、未使用生物胶)，关节复位后进行10次屈伸，胶原支架仍在原位，常规缝合创口。术后7天，取猪关节，发现缺损填充平整，胶原支架仍在原位，未脱落，跟缺损边缘粘附良好。猪膝关节滑车软骨缺损修复过程如图4所示，猪膝关节股骨髁软骨缺损修复过程如图5所示。
40.对术后7天的膝关节滑车部位和股骨髁部位组织，进行粘附力测试，测试过程如图6所示(图6为样本1的测试过程，其他样本测试过程相同)，结果如表1所示。测得胶原支架植入7天后的粘附力平均值为0.80n。(其中样本1和样本2为滑车部位，样本3和样本4为髁部位)。
41.表1粘附力学测试数据
42.检测项目样本1样本2样本3样本4平均值拉伸力0.44n0.76n1.22n0.76n0.80n
43.实施例3
44.取16mg/ml浓度的猪跟腱来源胶原蛋白溶液，平铺至尺寸为105mm
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105mm
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3mm的聚四氟乙烯凹槽模具中，放-20℃下12小时冷冻成型。将冷冻后的胶原浸入含nacl浓度为232g/l的磷酸盐缓冲溶液(磷酸氢二钠(na2hpo4)2.436g/l和磷酸二氢钾(kh2po4)0.8g/l，ph调至7.6)中20小时脱水。将脱水后的胶原整体用梯度压力(80～100kg30秒、130～150kg30秒、180～200kg30秒、450～500kg60秒)挤压成膜，再在致密膜上平铺浓度为约16mg/ml的胶原溶液至3mm厚度。置于在-20℃预冷冻20小时，再在冷冻干燥机中抽干48小时。将冻干后的双层胶原用浓度4mg/mledc交联3.5小时。将交联后的双层支架水洗3天，每天换水4次，再次在-20℃预冷冻16小时，再在冷冻干燥机中抽干70小时。将冻干后的支架剪切成所需的尺寸，密封包装，经22kgy的辐照剂量(γ射线)灭菌，即获得所述的胶原支架。
45.按照上述方法制备的胶原支架，致密层厚度为15μm，多孔层厚度为2.8mm，多孔层的孔径在200～250μm之间，多孔层的双层之间无缝连接，双层之间的连接力为0.64n。用该支架进行猪后腿膝关节双侧股骨滑车部位的损伤修复。
46.将猪龄6个月，体重约75kg的猪后腿膝关节双侧股骨滑车部位，行全层软骨缺损造
膜，缺损为矩形(缺损面积均约2.7cm2)，在左侧缺损处，进行微骨折打孔，将匹配尺寸的胶原支架多孔层朝向缺损处放入，固定10分钟后(未缝合、未使用生物胶)，关节复位后进行左侧腿部10次屈伸，胶原支架仍在原位，常规缝合创口。右侧缺损处，进行微骨折打孔，未植入支架。术后7天，取双侧猪关节，进行甲醛固定48h后，用刀具进行缺损纵切面切割，如图7所示，发现左侧滑车部位胶原支架仍在原位，未脱落，跟缺损边缘粘附良好，且填充的程度较右侧滑车部位单纯微骨折饱满。
47.实施例4
48.用实施例3制备的胶原支架进行猪后腿膝关节滑车部位和股骨髁软骨的损伤修复。
49.将猪龄6个月，体重约78kg的猪后腿膝关节股骨髁(缺损面积2.16cm2)和滑车部位(缺损面积2.72cm2)，行全层软骨缺损造膜，缺损为矩形，在缺损处进行微骨折打孔，将匹配尺寸的胶原支架多孔层朝向缺损处放入，固定4分钟后(未缝合、未使用生物胶)，关节复位后进行10次屈伸，胶原支架仍在原位，常规缝合创口。术后10天，取猪关节，发现缺损填充平整，胶原支架仍在原位，未脱落，跟缺损边缘粘附良好。猪膝关节髁软骨缺损修复过程如图8所示，猪膝关节滑车软骨缺损修复过程如图9所示。
50.对猪膝关节髁软骨缺损修复组织和软骨缺损修复组织进行he染色。结果如图10、11所示。如10为猪膝关节髁软骨缺损修复组织he图，图11为猪膝关节滑车软骨缺损修复组织he图。从图中可以看出胶原支架与缺损周围组织粘附良好，未有明显间隙，且支架内部含有微骨折术产生的骨髓基质干细胞(图10、11中箭头指向胶原支架与缺损接触部位)。
51.由以上实施例可知，本发明提供了一种胶原支架作为自粘修复材料的用途。该胶原支架在修复过程中不需要缝合固定和生物胶固定即可稳定粘附于关节软骨组织缺损处。
52.本发明提供的胶原支架与授权公告号为cn105381504b，授权公告日为2018.08.21的中国专利中制备的胶原支架是一样的。但是，在该中国授权专利的动物实验中，我们使用的实验动物为新西兰大白兔，植入胶原支架时是将胶原支架塞入到打好的直径为4mm的小孔中，该创伤面积较小，即使是非粘性的材料也能够牢牢固定。但是，我们在进行大型动物(猪)的实验过程中，由于猪的体重较大，实验用缺损面积也较大(达到10～14mm)，且缺损形状还包括了矩形。因此一般在实验过程中是需要对胶原支架进行额外缝合固定或生物胶固定的，但是我们发现利用该胶原支架对猪关节软骨组织进行大面积缺损修复时，即使不采用额外的固定措施，该胶原支架也能够通过自身的粘附性牢牢固定。因此，我们发现了该胶原支架的一种新性能，将其用于软骨组织大面积缺损修复时，无需固定缝合，大大缩短了手术流程。
53.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。