甘草查尔酮A及光甘草定和甘草查尔酮A的组合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用

甘草查尔酮a及光甘草定和甘草查尔酮a的组合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于抗肿瘤生物医药技术领域，特别涉及一种甘草查尔酮a及光甘草定和甘草查尔酮a的组合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。


背景技术：

2.结直肠癌是恶性消化道常见肿瘤之一，发病人数逐渐增多，现多以外科手术与放化疗及靶向制剂相结合的手段为主，存在生存期短预后差的问题。中医药作为癌症治疗的辅助方式，可提升患者预后、改善患者生命质量，已在临床得到广泛认可。甘草是常用的补气类中药材，梁军在分析历代治疗结肠癌的中医方剂古籍中发现甘草作为补虚药被大量的使用，出现频次在所有药物中排序第四，作为治疗结肠癌方剂中的核心药物。
3.虽然有文献报道甘草粗提物、黄酮或皂苷有效部位、单体化合物对乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、肺癌等肿瘤有不同程度的抑制作用，但是但对于中药本身“多成分
‑ꢀ
多通路-多靶点“的作用机制有待更深入探究，以用现代科学技术手段揭示中药药效物质基础与作用机制，进一步为古方中的经典临床应用提供依据。
4.甘草查尔酮a(licochalcone a，cas号：58749-22-7)是一种类天然酚类化合物，如式一所示。它可以从甘草中分离得到，显示了体外抗疟、抗癌、抗菌和抗病毒(特别是抗流感病毒神经氨酸酶)的特性。
[0005][0006]
现有技术中，例如，专利号为201210403351.8的中国发明专利公开了甘草查尔酮a在制备抗癌药物或保健品中的应用，并具体公开了甘草查尔酮a可显著抑制4t1小鼠乳腺癌细胞、 mda-mb-231人乳腺癌细胞、a375人黑色素瘤细胞、ags人胃癌细胞、人胰腺癌panc-1、人肝癌细胞株hepg2、smmc-7721和人肺癌细胞株h2126的增殖和集落形成。然而，一方面，甘草查尔酮a的抑制癌细胞增殖的作用机制不清楚，另一方面，甘草查尔酮a对结肠癌的作用鲜见报道。


技术实现要素：

[0007]
基于此，本发明提供一种甘草查尔酮a在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
[0008]
本发明还提供一种光甘草定和甘草查尔酮a的组合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
[0009]
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0010]
一种甘草查尔酮a在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
[0011]
优选地，以甘草查尔酮a作为唯一活性成分用于制备治疗结直肠癌的药物。
[0012]
优选地，甘草查尔酮a的作用使得cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、bax蛋白表达水平显著升高，bcl-2、mmp9蛋白表达显著下降。
[0013]
优选地，在所制备的治疗结直肠癌的药物中，甘草查尔酮a通过调控pi3k/akt/mtor信号通路发挥作用。
[0014]
优选地，在所制备的治疗结直肠癌的药物中，甘草查尔酮a的使用浓度为 5μg/ml-40μg/ml。
[0015]
一种光甘草定和甘草查尔酮a的组合物在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
[0016]
优选地，以光甘草定和甘草查尔酮a的组合物作为唯一活性成分用于制备治疗结直肠癌的药物。
[0017]
优选地，光甘草定和甘草查尔酮a的组合物的作用使得cleaved-caspase3、 cleaved-caspase9、bax蛋白表达水平显著升高，bcl-2、mmp2、mmp9蛋白表达显著下降。
[0018]
优选地，在所制备的治疗结直肠癌的药物中，光甘草定和甘草查尔酮a的组合物通过调控pi3k/akt/mtor信号通路发挥作用。
[0019]
优选地，在所制备的治疗结直肠癌的药物中，光甘草定和甘草查尔酮a的组合物的使用浓度为5μg/ml-40μg/ml。
[0020]
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
[0021]
将甘草查尔酮a用于制备治疗结直肠癌的药物，通过cck-8法验证甘草查尔酮a(lca) 对人结肠癌细胞sw480、sw620的抑制活性，表明5μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的lca作用于sw480、sw620细胞24h，48h，72h后，各组存活率均显著降低。采用流式细胞仪技术检测了lca高、中剂量组(40μg/ml和20μg/ml)对人结肠癌细胞sw480、sw620细胞凋亡的影响，表明20μg/ml、40μg/ml的lca作用于sw480、sw620的凋亡率具有显著统计学差异，凋亡率升高(p《0.001)。通过细胞划痕实验研究40μg/ml的lca对人结肠癌细胞sw480和 sw620细胞迁移的影响，lca作用于人结肠癌细胞sw480的迁移率为(44.93
±
0.49)％，与对照组无统计学意义；作用于人结肠癌细胞sw620的迁移率为(30.33
±
0.91)％，有统计学意义(p《0.001)，能显著抑制细胞迁移能力。通过transwell实验研究40μg/ml的lca对人结肠癌细胞sw480和sw620细胞侵袭能力的影响，lca组作用于sw480处理后的侵袭数为 (63.60
±
8.91)，与对照组无统计学意义；作用于sw620处理后的侵袭数为(53.6
±
6.47)，有统计学差异(p《0.01)，侵袭细胞数量显著减少。通过western blotting实验检测各组甘草活性成分干预后，对人结肠癌sw480、sw620细胞转移侵袭相关蛋白表达水平的影响。lca 药物干预后，在sw480细胞中bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平均显著升高(p《0.05，p《0.001，p《0.001)，bcl-2、mmp2、mmp9蛋白表达量均显著下降(p《0.01)；在sw620细胞中bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平均显著升高 (p《0.05，p《0.001，p《0.001)，bcl-2、mmp9蛋白表达显著下降(p《0.05)。lca可体外抑制人结肠癌sw480、sw620细胞增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡，其作用机制可能与抑制 pi3k/akt/mtor的信号通路有关。
[0022]
将光甘草定和甘草查尔酮a的组合物(cmc)用于制备治疗结直肠癌的药物，通过cck-8 法验证cmc对人结肠癌细胞sw480、sw620的抑制活性，表明5μg/ml、20μg/ml、40μg/ml 的cmc作用于sw480、sw620细胞24h，48h，72h后，各组存活率均显著降低。采用流式细胞仪技术检测了cmc高、中剂量组(40μg/ml和20μg/ml)对人结肠癌细胞sw480、sw620细胞凋亡的影
响，表明20μg/ml、40μg/ml的cmc作用于sw480、sw620的凋亡率具有显著统计学差异，凋亡率升高(p《0.001)。通过细胞划痕实验研究40μg/ml的cmc对人结肠癌细胞sw480和sw620细胞迁移的影响，cmc作用于人结肠癌细胞sw480的迁移率为(33.62
±
1.86)％，作用于人结肠癌细胞sw620的迁移率为(22.23
±
0.77)％，均有统计学意义(p《0.001)，能显著抑制细胞迁移能力。通过transwell实验研究40μg/ml的cmc对人结肠癌细胞sw480 和sw620细胞侵袭能力的影响，cmc组作用于sw480处理后的侵袭数为(37.80
±
4.66)，作用于sw620处理后的侵袭数为(32.80
±
3.27)，均有统计学差异(p《0.01)，侵袭细胞数量显著减少。通过western blotting实验检测cmc干预后，对人结肠癌sw480、sw620细胞转移侵袭相关蛋白表达水平的影响。cmc药物干预后，在sw480细胞中bax、cleaved-caspase3、 cleaved-caspase9蛋白表达水平均显著升高(p《0.05，p《0.001，p《0.001)，bcl-2、mmp2、 mmp9蛋白表达量均显著下降(p《0.01)；在sw620细胞中bax、cleaved-caspase3、 cleaved-caspase9蛋白表达水平均显著升高(p《0.05，p《0.001，p《0.001)，bcl-2、mmp2、 mmp9蛋白表达显著下降(p《0.05)。cmc可体外抑制人结肠癌sw480、sw620细胞增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡，其作用机制可能与抑制pi3k/akt/mtor的信号通路有关。
附图说明
[0023]
图1为cck-8法检测tfgr、lca、gbn、cmc对sw480细胞增殖的影响(a:lca；b:tfgr； c:gbn；d：cmc；与对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01,n＝3：)。
[0024]
图2为cck-8法检测tfgr、lca、gbn、cmc对sw620细胞增殖的影响(a:lca；b:tfgr； c:gbn；d：cmc；与对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01,n＝3：)。
[0025]
图3为甘草活性成分各实验组对人结肠癌sw480、sw620细胞凋亡的影响。
[0026]
图4为甘草活性成分各实验组对人结肠癌sw480、sw620细胞核形态的影响(400
×
，图中箭头所示固缩的染色质，或破碎的细胞核)。
[0027]
图5为甘草活性成分各实验组对人结肠癌sw480、sw620细胞迁移的影响(100
×
，与对照组比较，*p《0.05,**p《0.01.***p《0.001)。
[0028]
图6为tfgr、lca、cmc、gbn对人结肠癌sw480、sw620细胞侵袭能力的影响(x
±
s，n＝3)。
[0029]
图7为tfgr、lca、gbn对人结肠癌sw480和sw620细胞相关凋亡因子蛋白表达的影响(x
ꢀ±
s，n＝3)。
[0030]
图8为cmc对人结肠癌sw480和sw620细胞相关凋亡因子蛋白表达的影响(x
±
s，n＝3)。
[0031]
图9为tfgr、lca、cmc、gbn对sw480和sw620细胞相关凋亡因子基因表达的影响(x
ꢀ±
s，n＝4)。
[0032]
图10为cmc对人结肠癌细胞pi3k-akt-mtor通路相关蛋白表达水平的影响 (*p《0.05,***p《0.01，vs.模型组)。
具体实施方式
[0033]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。以下将结合本发明实施例的附图，对本发明的技术方案做进一步描述，本发明不仅
限于以下具体实施方式。
[0034]
1.1实验材料
[0035]
1.1.1细胞株
[0036]
人结肠癌细胞株sw480、sw620细胞均购自上海泸宇生物科技有限公司。所有细胞在 10％胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)的l15培养基中培养，培养基中加入双抗(100μg/ml链霉素和100单位/ml青霉素)，放置于37℃、5％co2培养箱中培养。细胞每两天换液一次，按1∶3进行传代，实验中均取对数生长期的细胞进行。
[0037]
1.1.2实验动物
[0038]
spf级balb/c裸鼠，雄性60只，3-4周龄，体重18.0
±
2.0g。购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：no110322200101294471。动物实验获得宁夏医科大学动物实验中心伦理委员会审批同意。
[0039]
1.1.3实验药品
[0040]
tfgr(uvhplc≥98％，批号：20141015)购自于上海源叶生物科技有限公司；
[0041]
gbn标准品(批号：g006171216)购自于上海源叶生物科技有限公司；
[0042]
lca标准品(批号：p21o8f46473)购自于上海源叶生物科技有限公司；
[0043]
5-氟尿嘧啶(fluorouracil injection，5-fu)天津金耀药业有限公司，生产批号2004201，规格10ml∶0.25g；
[0044]
10％水合氯醛购自兰州大学第二医院。
[0045]
1.1.4实验试剂
[0046]
各实验试剂均选自市售的符合标准要求的实验试剂。
[0047]
1.1.5仪器设备
[0048][0049]
1.2实验方法
[0050]
1.2.1人结肠癌细胞sw480荷瘤小鼠模型建立
[0051]
spf级balb/c裸鼠，雄性，3-4周龄，体重18.0
±
2.0g，检疫合格后在宁夏医科大学实验动物中心进行适应性喂养5天，待后续人结肠癌sw480、sw620细胞株移植瘤造模。
[0052]
人结肠癌sw480、sw620细胞株按常规细胞培养法进行培养、传代。收集对数生长期呈良好生长状态的sw480细胞，调整细胞悬液浓度为2
×
106个/ml，分装于注射器内，每只注射器吸取0.1ml细胞悬液，备用。
[0053]
裸鼠注射处皮肤碘伏消毒后，将准备好的细胞悬液注射于balb/c裸鼠的右侧腋窝下方的皮下部位。接种后常规饲养，待移植瘤结节直径长至4-5mm左右时，根据裸鼠体重按完全随机分组原则分组：空白对照组(0.05％羧甲基纤维素钠)5ml
·
kg-1
；阳性对照组(5-fu)20mg
·
kg-1
； tfgr高、中、低剂量组分别以400mg
·
kg-1
、200mg
·
kg-1
、100mg
·
kg-1
；甘草查尔酮a(lca) 高、中、低剂量组分别以40mg
·
kg-1
、20mg
·
kg-1
、5mg
·
kg-1
；光甘草定(gbn)高、中、低剂量组分别以40mg
·
kg-1
、20mg
·
kg-1
、5mg
·
kg-1
；甘草查尔酮a与光甘草定的组合物 (cmc)高、中、低剂量组分别以40mg
·
kg-1
、20mg
·
kg-1
、5mg
·
kg-1
,其中，cmc中，甘草查尔酮a与光甘草定的物质的量的比为1:1。
[0054]
给药方式：阳性对照组腹腔注射、隔天给药；空白组和tfgr、lca、gbn、cmc高、中、低剂量组每日定时灌胃给药一次，每次以体重为标准计算给药量，连续灌胃14天。给药后每日观察裸鼠的生活行为状态及肿瘤的生长状况。每隔3-4日用游标卡尺测量皮下肿瘤直径，测量肿瘤的长轴(a)与短轴(b)，计算移植瘤体积v＝a
×
b2/2，绘制瘤体积曲线。各组小鼠于末次给药次日予以10％水合氯醛麻醉后脱颈处死，剥离移植瘤组织并称重，计算各组小鼠抑
瘤率：抑瘤率(％)＝[模型组平均瘤质量(g)－给药组平均瘤质量(g)]/模型组平均瘤质量(g)
×
100％。取材要快，保证组织新鲜，取出的瘤体部分组织放置于4％多聚甲醛中固定 24h后进行，待后续病理学实验使用。另留存部分组织于液氮中保存，用于检测肿瘤组织的相关蛋白及mrna的表达。
[0055]
1.2.2制作石蜡切片
[0056]
将固定好的各组肿瘤组织块修整后放入包埋盒内，并在包埋盒上做好标记，然后置于全自动脱水机内进行脱水、浸蜡，浸蜡结束后，用包埋机包埋，待蜡块完全凝固后，进行切片处理，厚度为5μm，摊片、烤片，切片置于4℃保存。
[0057]
1.2.3荷瘤小鼠移植瘤组织he染色病理学观察
[0058]
将切片进行he染色，首先依次用二甲苯ⅰ和二甲苯ⅱ各脱蜡10min，利用下行酒精脱蜡(顺序依次是无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、水各5min)，将切片浸入苏木精染液染色5min，快速水洗去浮色，盐酸酒精分化数秒，流水冲洗15min 反蓝；再将切片浸入伊红染液染色5min，快速水洗去浮色；利用上行酒精脱水(顺序依次是70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇各放置数秒，95％乙醇、无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ中各放置5min)，脱完水的切片浸于二甲苯ⅰ和二甲苯ⅱ中透明各5min；将切片从二甲苯中拿出，让二甲苯稍凉干一下(切忌干片)，滴加中性树胶，盖上盖玻片，封好的玻片置于通风橱内凉干。最后将切片放在显微镜载物台上进行图像采集与观察分析。
[0059]
1.2.4采用免疫组化法检测移植瘤组织蛋白表达
[0060]
将切片依次用二甲苯ⅰ和二甲苯ⅱ各脱蜡10min，利用下行酒精脱蜡(顺序依次是无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇各5min)，然后将经过二甲苯和梯度酒精的切片放入水中水化数分钟；然后将水化后的切片放在装有适量柠檬酸(ph6.0) 修复液的修复盒里，并放置于微波炉内(用胶带密封好，防止修复液沸腾溢出)，中火8min，停火保温8min，中低火7min，修复完自然冷却，pbs洗5min(3次)；再放入到3％过氧化氢孵育25min，pbs洗5min(3次)；组化笔画圈防止试剂流走，滴加10％正常山羊血清均匀覆盖组织室温封闭30min；甩掉血清，加入按比例用pbs稀释好的一抗均匀覆盖组织，置于4℃冰箱过夜；次日，从冰箱拿出切片复温30min，pbs洗5min(3次)，加入按比例稀释好的二抗室温孵育50min，pbs洗5min(3次)；滴加新鲜配置的dab显色液均匀覆盖组织，显微镜下控制显色，纯水冲洗终止显色；切片入苏木素复染2min，自来水洗，盐酸酒精分化数秒，自来水反蓝；上行酒精脱水(顺序依次是70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇各放置数秒，95％乙醇、无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ中各放置5min)二甲苯透明5min，中性树胶封片，封好的片子在通风橱内晾干。最后将切片放在显微镜载物台上进行图像采集。
[0061]
1.2.5采用western blotting检测移植瘤组织相关蛋白表达水平
[0062]
把各组移植瘤的组织剪碎成3mm
×
3mm左右小块分别放在不同2ml预冷的离心管中，每100mg肿瘤组织加入0.5-1ml配置好的预冷裂解液，加入两颗小钢珠，放入全自动冷冻研磨仪，60hz研磨90s，裂解后的组织12000rpm/min，4℃离心5min，分别将上清液转移至新的标记好组别预冷的离心管内即为各处理组肿瘤组织的全蛋白提取物。用bca蛋白定量试剂盒分别对各组肿瘤组织全蛋白提取物的总蛋白含量进行检测。将上样缓冲液分别加入各组肿瘤组织全蛋白提取物中，加入比例为4∶1，煮沸5min，使蛋白变性后，分装备用。将制好的电泳实验胶板放入电泳槽中，加入电泳液，加入各组蛋白样本，恒定电压120v电泳分离。
在200ma条件下将胶上目的蛋白条带转移至pvdf膜(经甲醇活化)上，用pbst 洗3次，每次10min；然后将pvdf膜放置抗体孵育盒内，加入5％的脱脂奶粉(用pbst配制)在摇床上室温封闭1h，然后用pbst清洗条带一次。用一抗稀释液按照下表配制各抗体浓度。将配好的一抗孵在相应的条带上，4℃冰箱密封过夜。次日，回收一抗。将条带用pbst 洗三次，每次10min。根据条带数量，用5％脱脂奶粉按表五配制二抗，室温孵育二抗1h。孵育结束后pbst洗三次，每次10min。将发光液孵在条带上，用全自动化学发光仪进行曝光，存储条带图片。
[0063]
1.2.6采用q-pcr检测移植瘤组织相关mrna表达水平
[0064]
①
总rna提取
[0065]
将冻存于超低温冰箱内的组织置于预冷的rnase-free ep管中，每10-20mg组织中加入 300μl裂解液rl，用冷冻研磨仪研磨，12000rpm(～13400
×
g)离心5min；取上清，缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀；得到的溶液与沉淀一并转入吸附柱cr3(吸附柱置于收集管中)，12000rpm(～13400
×
g)离心30s，弃去收集管中废液，将吸附柱放回收集管内；加入500μl去蛋白液rd，12000rpm(～13400
×
g)离心30s，去除废液并将将吸附柱放回收集管内；向吸附柱cr3中央加入500μl洗涤液rw，静置2min，4℃，12000rpm(～13400
ꢀ×
g)离心30s，弃去废液，重复此步骤一次；将吸附柱放回收集管内；向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(含乙醇)，室温静置2min，12000rpm(～13400
×
g)离心1min，弃废液并将吸附柱放回收集管内，然后再重复加入漂洗液漂洗一次，12000rpm(～13400
×
g) 离心2min，弃废液，将吸附柱置于室温放置数分钟，晾干材料中残留的漂洗液，将吸附柱 cr3转入新的rnase-free ep管，向吸附膜中间部位悬空滴加100μl rnase-free ddh2o，室温放置2min，12000rpm(～13400
×
g)离心2min，得到总rna提取液，进行纯度测定。
[0066]
②
反转录合成cdna
[0067]
取装有总rna提取液(《5μg)的ep管，放置冰上，管中依次加入oligo(dt)1μl，加入nuclease-free水至管中总体积12μl，短暂离心，放入pcr仪中65℃孵育5min，反应后将pcr产物放在冰上冷却，短暂离心，向无酶的pcr管中按指定顺序加入以下组分：5
×ꢀ
reaction buffer(4μl)、ribolock rnase inhibitor(20u/μl)(1μl)、10mm dntp mix (2μl)、revertaid m-mulv rt(200u/μl)(1μl)。反应体系总体积为20μl，轻轻混匀，短暂离心后放入pcr仪中进行cdna合成，条件为42℃孵育60min，70℃孵育5min，终止反应。将上述反映产物置于冰盒内，短暂离心，得到逆转录的cdna可直接实验或置于
ꢀ‑
80℃冰箱内保存。
[0068]
③
rt-qpcr检测移植瘤组织相关mrna表达量
[0069]
其中内参基因选定为β-actin，目标基因的mrna引物见下表：
[0070]
各组rt-qpcr引物序列
[0071][0072]
分别向各处理组逆转录的cdna样本中加入90-100μl的rnase-free ddh2o，将样本稀释至浓度适中，各组样品放置专用八联管中，按下表中配置反应体系：2*aceq universal sybrqpcr master mix(10μl)、rox passive reference dye(50
×
)(0.5μl)、每组cdna 样本(2μl)、pcr forward primer 0.4μl(0.5μl)、pcr reverse primer 0.4μl(0.5 μl)、rnase-free ddh2o(0.5μl)。
[0073]
将以上反映体系放入abi stepone plus实时荧光定量pcr仪中，设置反应条件如下：
[0074][0075]
反应结束后，得到目标mrna相对表达量，通过2
‑△△
ct
法计算目标基因相对于内参的表达情况，得到需要测定基因的相对定量检测，表达量以倍数表示。
[0076]
1.2.7细胞培养
[0077]
①
细胞复苏
[0078]
取出液氮中冻存的细胞株快速解冻，然后用移液枪转移至事先准备好的无菌10ml离心管中，放入离心机内离心(1000rpm，5min)，离心完毕后弃上清。然后加入1ml含10％胎牛血清的细胞培养基反复吹打，直至成单细胞悬液，再将其转移至细胞培养瓶中，并向培养瓶中加入5-6ml完全培养基后将其放在5％二氧化碳培养箱内，调节温度培养箱至37℃进行细胞培养。
[0079]
②
细胞传代
[0080]
镜下观察细胞密度增殖85％左右时即可传代。将细胞培养瓶中的废旧培养基弃去，用3mlpbs冲洗，重复3次。然后瓶中加入1ml 0.25％胰蛋白酶消化液，微微晃动使得消化液在瓶内分布均匀，将培养瓶放置培养箱内数分钟，取出后镜下观察待细胞变圆，立即加入3ml完全培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打瓶壁直至大部分贴壁细胞基本脱落，将细胞悬液转移至15ml离心管，1000rpm离心5min，弃上清。取1ml完全培养基重悬细胞吹打成单细
胞悬液，进行计数，依据实验具体情况，可将细胞悬液分至2-3个培养瓶内，各瓶内分别加入完全培养基5-7ml，放至37℃，5％二氧化碳培养箱内进行培养。
[0081]
③
细胞冻存
[0082]
取密度为60-70％对数生长期的细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化液按细胞传代中的条件进行消化吹打成单细胞悬液，并将其转移至10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃去培养基加入无血清冻存液1ml，吹打均匀后再次转移至细胞冻存管中，做好标记。将冻存管放入细胞冻存盒内放入-80℃冰箱内，过夜后转移至液氮罐中可长期保存。
[0083]
1.2.8药物储存液的配置
[0084]
称取tfgr配置成100mg/ml，并进行倍数稀释成50、25、12.5mg/ml。精密称取lca、 gbn，分别溶于dmso溶液配置成母液，0.22μm微孔滤膜过滤后置于4℃备用。每次细胞给药前先将各组药物用完全培养基进行稀释，使终浓度分别为100、50、25、12.5μg/ml。
[0085]
后续实验的药物配置：lca、gbn、cmc按上述方法配置，给药终浓度分别为40、20、10、 5μg/ml，tfgr提取物给药终浓度为100、75、50、25μg/ml。
[0086]
1.2.9流式细胞术检测tfgr、lca、gbn、cmc对人结肠癌细胞凋亡的影响
[0087]
将细胞接种于6孔板中，细胞过夜培养后，进行细胞加药。分别给予不同浓度lca(20μ g/ml、40μg/ml)、gbn(20μg/ml、40μg/ml)、cmc(20μg/ml、40μg/ml)、总黄酮(75μg/ml、100μg/ml)处理细胞，在37℃、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养24h 后，用不含edta胰酶消化收集细胞，室温2000rpm离心5min，再用冷pbs洗涤细胞两次，用400μl 1
×
binding buffer悬浮细胞，浓度大约为1
×
106个/ml；在细胞悬液中加入5μ l annexin v-fitc，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15min，加入10μl pi后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育5min；在1h内流式细胞仪上机器检测，分析总凋亡率。
[0088]
1.2.10hoechst 33258荧光染色法观察tfgr、lca、gbn、cmc对人结肠癌细胞核形态的影响
[0089]
取普通洁净盖玻片于70％乙醇中浸泡5min或更长时间，用细胞培养基pbs洗涤3遍，再用细胞培养液洗涤1遍。将盖玻片置于6孔板内，种入细胞培养过夜，细胞密度约为50％-80％。分别给予各组药物(40μg/ml的lca、40μg/ml的gbn、40μg/ml的cmc、100μg/ml 的tfgr)处理细胞，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10min或4℃过夜。去固定液，用pbs洗涤2次，每次3min，弃去液体，加入0.5ml hoechst 33258染色液，染色5min，手动摇晃充分接触。用pbs洗涤2次，每次3min，之后用抗淬灭封片液封片。用荧光显微镜观察染色情况，并采集图像。
[0090]
1.2.11划痕实验检测tfgr、lca、gbn、cmc对人结肠癌细胞迁移能力的影响
[0091]
选取对数生长期细胞，培养各组细胞至密度80％，按1
×
105/孔细胞铺板，置于培养箱中孵育，贴壁后观察并在板背面标记，用10μl无菌枪头垂直于六孔板在标记处进行划痕，弃去原有培养基，加入各组含药培养基(40μg/ml lca、40μg/ml gbn、40μg/ml的cmc、 100μg/ml tfgr)处理细胞。将各组细胞置于37℃的培养箱中分别培养0h、24h后进行拍照记录，测定划痕愈合距离，每组实验重复3次。
[0092]
1.2.12transwell实验检测tfgr、lca、gbn、cmc对人结肠癌细胞侵袭能力的影响
[0093]
首先matrigel胶4℃过夜解冻，将matrigel胶置冰上放入超净台，用无血清培养基将胶1:3稀释，用40μl预先稀释好的matrigel胶包被到小室上部，取出transwell小室放入
24孔板中，在培养箱放置2h使胶凝固，基底膜形成，备用。
[0094]
取对数生长期细胞接种于60mm3培养皿中，待其密度达80％时吸弃原培养基，用pbs漂洗两次，胰酶消化，1000rpm离心5min，弃上清液，管中加入不含血清培养基制成细胞悬液后计数，吸取细胞悬液200μl加入transwell小室的上室，细胞数均为3
×
104/孔，小室放置于24孔板中，贴壁后吸去培养基，按各处理组不含fbs的含药培养基加入上室(40μ g/ml lca、40μg/ml gbn、40μg/ml的cmc、100μg/ml tfgr)处理细胞24h，下室每孔加入20％fbs培养基500μl，置于细胞培养箱中培养。吸弃培养基，将transwell小室用pbs清洗2次，4％多聚甲醛室温下固定30min(上室200μl，下室500μl)，弃去固定液，pbs洗涤2次，加入0.1％结晶紫染液染色15min，弃染色液，pbs冲洗2次。显微镜下对侵袭至微孔膜下层的细胞计数，每个样本选取5个视野计数细胞个数,进行数据处理。
[0095]
1.2.13western blotting检测tfgr、lca、gbn、cmc对人结肠癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响
[0096]
贴壁肿瘤细胞吸去培养基后，分别加入10ml/150mm培养板的冷pbs洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液；用细胞刮子刮下贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中，800
×
g 离心10min，弃上清，再用10ml/150mm培养板的冷pbs，800
×
g离心5min洗两次；在每1ml冷lysis buffer加入10μl磷酸酶抑制剂，1μl蛋白酶抑制剂和5μl的100mmpmsf，混匀，冰上保存数分钟待用；细胞洗涤后，转至新的预冷的离心管中，加入1ml上述配制好的冷lysis buffer；置于4℃摇床平台上，剧烈振荡30s，放置冰上4min，重复5次；然后12000rpm，4℃离心5min，取上清为全蛋白提取物。用bca蛋白定量试剂盒分别对各组肿瘤组织全蛋白提取物的总蛋白含量进行检测。各处理组蛋白按1.2.5方法进行实验。
[0097]
1.2.14qrt-pcr检测tfgr、lca、gbn、cmc对人结肠癌细胞凋亡相关mrna水平的影响
[0098]
贴壁细胞吸取培养基，用pbs洗涤细胞，吸出pbs，正常消化细胞，将细胞溶液转移至 rnase-free离心管中，300
×
g离心5min，收集细胞沉淀，除去上清。向管中加入350μl 裂解液rl，所有溶液转移至过滤柱cs上，12000rpm(～13400
×
g)离心2min，收集滤液。向滤液中加入350μl 70％乙醇，混匀，得到的溶液与沉淀一并转入cr3中，12000rpm(～13400
ꢀ×
g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中，向吸附柱中加入350μ l去蛋白液rw1，12000rpm(～13400
×
g)离心1min，弃去废液，将吸附柱放回收集管内；向吸附柱cr3中央加入80μl dnaseⅰ工作液(10μl dnaseⅰ储存液中加入70μl rdd 溶液，混匀)，室温放置15min，向吸附柱中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm(～13400
ꢀ×
g)离心1min，弃去废液，将吸附柱放回收集管内；向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液 rw(含乙醇)，室温静置2min，12000rpm(～13400
×
g)离心1min，将吸附柱放回收集管内，重复加入漂洗液漂洗一次，12000rpm(～13400
×
g)离心2min，弃废液，将吸附柱置于室温放置数分钟，晾干，将吸附柱cr3转入新的rnase-free ep管，向吸附膜中间部位悬空滴加100μl rnase-free ddh2o，室温放置2min，12000rpm(～13400
×
g)离心2min，得到细胞总rna提取液，进行纯度测定。逆转录cdna与pcr实验参考1.2.6方法。
[0099]
1.2.15运用反向虚拟筛选技术探讨gbn和lca抗结肠癌的潜在作用靶标及信号通路
[0100]
利用反向虚拟筛选平台的whole靶标库，疾病基因对应的靶标晶体结构完全解析，共包括140个靶标的2119个活性位点；part靶标库，疾病基因对应的靶标结构部分被解析，
共包括506个靶标的5487个活性位点。利用drugbank数据库搜索获得lca和gbn的结构式文件，提交反向虚拟平台筛选，进行分子虚拟对接，对化合物与蛋白结合能进行打分，返回打分前200的结果。分值的绝对值越大表明药物与该靶点结合越稳定。结果对照proteinbank、 kegg数据库进行靶点预测与通路分析。
[0101]
1.2.16lca、gbn、cmc体外抗结肠癌的蛋白质组学研究
[0102]
实验共分为8组，其中4组为人结肠癌sw480细胞，4组为人结肠癌sw620细胞。sw480 细胞的处理方式分别为空白对照、40μg/ml lca、40μg/ml gbn、40μg/ml cmc、100μ g/ml tfgr，各药物组处理24h。sw620细胞的处理方式同sw480细胞。细胞培养方法见1.2.7 所述。蛋白提取与定量同前文所述。
[0103]
酶解及标记：
[0104]
还原烷基化和酶解：取蛋白样品100μg，用裂解液补充体积到90μl。加入终浓度10 mmol/l tcep还原剂，在37℃下反应60min。加入终浓度40mmol/l碘乙酰胺，室温下避光反应40min。每管各加入预冷的丙酮(丙酮∶样品体积比＝6:1)，-20℃沉淀4h，10000
×
g 离心20min，取沉淀。用50mmol/l teab充分溶解样品，按照质量比1:50(酶∶蛋白)加入trypsin在37℃酶解过夜。tmt标记与混样，-20℃取出tmt试剂(thermofisher)恢复到室温，加入乙腈，涡旋离心，每100μg多肽加入一管tmt试剂，样品标记见下表。室温孵育2h；加入羟胺，室温反应15min，将等量标记产物混合于一管中，真空浓缩仪抽干。
[0105]
各组样品标记顺序列表
[0106][0107]
rplc一维分离：用uplc上样缓冲液复溶多肽样品，用反相c18柱acquity uplc beh c18 column1.7μm，2.1mm
×
150mm(waters，usa)进行高ph液相分离。a相2％乙腈(氨水调至ph10)，b相80％乙腈(氨水调至ph 10)，0～1.9min，100％a；2～17min，0～5％b；17～18 min，5％～10％b；18～35.5min，10％～30％b；35.5～38min，30％～36％b；38～39min，36％～42％b； 39～40min，42％～100％b；40～44min，100％b；44～45min，100％～0％b，见下表。紫外检测波长为214nm，体积流量为200μl/min，洗脱时间为48min。根据峰形和时间共收取20个馏份，合并成10个馏份，真空离心浓缩。
[0108]
uplc上样洗脱梯度
[0109]
细胞增殖的抑制作用
[0121]
实验结果见图1与图2。通过cck-8法验证tfgr、lca、gbn及cmc对人结肠癌细胞sw480、 sw620的抑制活性。测定了不同浓度的各药物组对上述两种细胞在不同时间内对肿瘤细胞增殖的影响，抑制结果如图1与图2所示。与对照组比较，甘草总黄酮各剂量组均有统计学意义(p《0.01)，均能不同程度的抑制sw480细胞和sw620细胞增殖，随着时间延长，随剂量增加而抑制作用逐渐增强，有一定剂量依赖性和时间依赖性，因24h处理组已有显著抑制增殖作用，所以选取24h处理组各组高剂量组进行后续实验。24h不同剂量的四种药物组的增殖抑制率不同，在作用于sw480细胞时如图1所示，20μg/ml lca的抑制率为(91.16
±
0.69)％； 20μg/ml gbn的抑制率(34.85
±
10.04)％；20μg/ml cmc抑制率为(79.05
±
3.50)％；50 μg/ml tfgr的抑制率(81.76
±
1.46)％，其中同水平浓度的单体化合物lca比gbn的抑制率更高，与对照组比较差异均有统计学意义(p《0.05，p《0.01)。在作用于sw620细胞时20μg/mllca的抑制率为(84.62
±
0.87)％；20μg/ml gbn的抑制率(92.34
±
0.24)％；20μg/ml cmc 抑制率为(93.87
±
0.54)％；50μg/ml tfgr的抑制率(81.74
±
1.76)％(见图2)，同等水平浓度的单体化合物lca与gbn均有抑制作用。sw620细胞较sw480细胞对药物lca、gbn、 cmc敏感性更强，细胞增殖抑制率更高，同等浓度药物作用下，sw620细胞增殖明显被抑制，而sw480细胞的抑制率较sw620低。后续作用机制及蛋白质组学实验均选用20μg/ml和40 μg/ml的各组单体化合物和配伍组以及75μg/ml和100μg/ml的甘草总黄酮组进行细胞凋亡实验，作用时间为24h。
[0122]
1.3.2tfgr、lca、cmc及gbn对人结肠癌细胞凋亡的影响
[0123]
采用流式细胞仪技术检测了lca、gb)、cmc高、中剂量组(40μg
·
ml-1
和20μg
·
ml-1
) tfgr的高、中剂量组(100μg
·
ml-1
和75μg
·
ml-1
)对人结肠癌细胞sw480、sw620细胞凋亡的影响，见图3所示。对照组sw480细胞凋亡率仅为(1.13
±
0.11)％，对照组sw620细胞凋亡率仅为(1.79
±
0.15)％。
[0124]
20μg
·
ml-1
lca作用于sw480的凋亡率仅为(2.39+0.17)％，对比对照组sw480细胞无显著差异；而其作用于sw620细胞的凋亡率为(4.56
±
0.26)％，相比于对照组sw620 细胞具有显著统计学意义，凋亡率升高(p《0.01)。40μg
·
ml-1
lca作用于sw480的凋亡率仅为(5.59
±
0.66)％，作用于sw620细胞的凋亡率为(11.56
±
1.44)％,与各对照组细胞凋亡率比较均有显著统计学差异(p《0.001)，用药后细胞凋亡率不同程度升高。20μg
·
ml-1
gbn 作用于sw480的凋亡率仅为(7.77
±
0.28)％，相比于对照组sw480细胞具有显著统计学意义，凋亡率升高(p《0.01)；其作用于sw620细胞的凋亡率为(6.35
±
0.53)％，相比于对照组sw620细胞无统计学意义。40μg
·
ml-1
gbn作用于sw480的凋亡率仅为(16.35
±
0.88)％，其作用于sw620细胞的凋亡率为(16.38
±
1.17)％，与各对照组细胞凋亡率比较均有显著统计学差异(p《0.001)，用药后细胞凋亡率不同程度升高。20μg
·
ml-1
cmc作用于sw480的凋亡率仅为(10.50
±
0.77)％，作用于sw620细胞的凋亡率为(12.55
±
0.13)％，相比于各对照组细胞具有显著统计学意义，凋亡率升高(p《0.05，p《0.01)。40μg
·
ml-1
cmc作用于 sw480的凋亡率仅为(18.54
±
1.16)％，而其作用于sw620细胞的凋亡率为(27.90
±
2.06)％，相比于各对照组细胞具有显著统计学意义，凋亡率显著升高(p《0.001)。75μg
·
ml-1
tfgr 作用于sw480的凋亡率仅为(17.29
±
0.94)％，对比对照组sw480细胞无显著差异；而其作用于sw620细胞的凋亡率为(15.84
±
0.71)％，100μg
·
ml-1
tfgr作用于sw480的凋亡率仅为(33.78
±
2.50)％，
其作用于sw620细胞的凋亡率为(32.97
±
0.51)％。各剂量组相比于各对照组细胞均具有显著统计学意义，凋亡率显著升高(p《0.001)。实验结果表明，gbn、 cmc、tfgr的中剂量组均可诱导人结肠癌细胞sw480发生凋亡；lca、cmc、tfgr的中剂量组均可诱导人结肠癌细胞sw620发生凋亡；lca、gbn、cmc高剂量组(40μg
·
ml-1
) 及tfgr的高剂量组(100μg
·
ml-1
)均能够明显诱导人结肠癌sw480细胞和sw620细胞发生凋亡。后续所有实验各组均选择高剂量组进行实验。
[0125]
1.3.3tfgr、lca、cmc及gbn对人结肠癌细胞核形态的影响
[0126]
经hoechst33258荧光染料染色后，考察药物对细胞核形态的影响，结果见图4所示。显微镜下观察发现对照组的人结肠癌sw480细胞、sw-620细胞的细胞核核均呈现微弱的蓝色荧光，核结构完整。lca、gbn、cmc高剂量组(40μg
·
ml-1
)及tfgr的高剂量组(100μg
·
ml-1
) 各组出现细胞核致密浓染，呈亮蓝色荧光，细胞核呈现不同程度的凋亡特征改变：核固缩变小，核碎裂，细胞破碎不完整，个别组别有凋亡小体产生(具体核碎裂、核固缩图中箭头所示)。从细胞形态学来看，lca、gbn、cmc、tfgr均可诱导人结肠癌sw480细胞和sw620 细胞发生不同程度的凋亡。
[0127]
1.3.4tfgr、lca、cmc及gbn对人结肠癌细胞迁移的影响
[0128]
通过细胞划痕实验研究lca、gbn、cmc高剂量组(40μg
·
ml-1
)及tfgr的高剂量组 (100μg
·
ml-1
)对人结肠癌细胞sw480和sw-620细胞迁移的影响，结果如图5可见。对照组sw480细胞划痕24h后迁移率分别为(45.14
±
1.92)％，划痕愈合较快；lca、gbn、cmc、 tfgr各组作用于人结肠癌细胞sw480的迁移率分别为(44.93
±
0.49)％、(34.10
±
2.34)％、 (33.62
±
1.86)％、(24.09
±
3.68)％；对照组sw620细胞划痕24h后迁移率分别为(39.01
ꢀ±
3.95)％，划痕愈合较快；lca、gbn、cmc、tfgr各组作用于人结肠癌细胞sw620的迁移率分别为(30.33
±
0.91)％、(25.11
±
0.73)％、(22.23
±
0.77)％、(19.01
±
1.35)％。 lca与sw480对照组比较无统计学意义，与sw620对照组迁移率比较有统计学意义 (p《0.05)，可降低sw620的划痕愈合的迁移能力。gbn组分别与两个细胞系的对照组的迁移率比较，均有统计学意义(p《0.01，p《0.001)，能显著抑制细胞迁移能力。cmc组分别与两个细胞系的对照组的迁移率比较，均有统计学意义(p《0.01，p《0.001)，能显著抑制细胞迁移能力。tfgr组分别与两个细胞系的对照组的迁移率比较，均有显著统计学意义 (p《0.001)，能显著抑制sw480和sw620细胞迁移能力。实验结果表明,gbn、cmc、tfgr 均可显著抑制人结肠癌细胞sw480和sw620细胞迁移，减缓划痕愈合；lca仅可抑制人结肠癌细胞sw620细胞迁移。
[0129]
1.3.5tfgr、lca、cmc及gbn对人结肠癌细胞侵袭能力的影响
[0130]
通过transwell实验研究lca、gbn、cmc高剂量组(40μg
·
ml-1
)及tfgr的高剂量组 (100μg
·
ml-1
)对人结肠癌细胞sw480和sw-620细胞侵袭能力的影响，结果如图6可见。人结肠癌sw480细胞对照组的侵袭数为(71.00
±
8.72)，lca组作用于sw480处理后的侵袭数为(63.60
±
8.91)，gbn处理组侵袭数为(51.00
±
6.48)，cmc处理组侵袭数为(37.80
±ꢀ
4.66)，tfgr处理组侵袭数为(33.8
±
4.82)；人结肠癌sw620细胞对照组的侵袭数为(65.80
ꢀ±
8.44)，lca组作用于sw620处理后的侵袭数为(53.6
±
6.47)，gbn处理组侵袭数为(51.00
ꢀ±
6.56)，cmc处理组侵袭数为(32.80
±
3.27)，tfgr处理组侵袭数为(30.0
±
4.18)。lca 处理组与sw480对照组比较无统计学差异，与sw620对照组比较有统计学差异(p《0.001)，作用后侵袭数减少；gbn处理组分别与sw480、sw620对照组比较均有统计学差异(p《0.01， p《
0.001)，侵袭细胞数量显著减少；cmc处理组、tfgr处理组分别与sw480、sw620对照组比较均有显著统计学差异(p《0.001)，侵袭细胞数量显著减少。实验结果表明,gbn、cmc、 tfgr均可显著抑制人结肠癌细胞sw480和sw620细胞侵袭能力，侵袭细胞数显著降低；lca 仅可显著抑制人结肠癌细胞sw620细胞侵袭能力。
[0131]
1.3.6tfgr、lca、cmc及gbn对人结肠癌细胞凋亡转移侵袭相关蛋白表达水平的影响
[0132]
通过western blotting实验检测各组甘草活性成分干预后，对人结肠癌sw480、sw620 细胞转移侵袭相关蛋白表达水平的影响。结果见图7，与对照组比较；lca药物干预后，在 sw480细胞中bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平显著升高(p《0.01， p《0.001，p《0.001)，bcl-2、mmp2、mmp9蛋白表达显著下降(p《0.001，p《0.01，p《0.001)；在sw620细胞中bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达水平显著升高(p《0.01， p《0.001，p《0.001)，bcl-2、mmp9蛋白表达显著下降(p《0.001，p《0.01)。(见图7中a 所示)。
[0133]
与对照组比较，gbn药物干预后，在sw480细胞中bax、cleaved-caspase3、 cleaved-caspase9蛋白表达水平均显著升高(p《0.05，p《0.001，p《0.001)，bcl-2、mmp9蛋白表达量均显著下降(p《0.01)；在sw620细胞中bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9 蛋白表达水平均显著升高(p《0.001)，bcl-2、mmp2、mmp9蛋白表达显著下降(p《0.05)(见图7中b所示)。
[0134]
与对照组比较，tfgr药物干预后，在sw480细胞中bax、cleaved-caspase3、 cleaved-caspase9蛋白表达水平均显著升高(p《0.001)，bcl-2、mmp2、mmp9蛋白表达量均显著下降(p《0.001，p《0.01，p《0.001)；在sw620细胞中bax、cleaved-caspase3、 cleaved-caspase9、bcl-2蛋白表达水平均显著升高(p《0.001)，mmp2、mmp9蛋白表达量均显著下降(p《0.001，p《0.01，p《0.01)(见图7中c所示)。
[0135]
与对照组比较，cmc药物干预后，在sw480细胞中bax、cleaved-caspase3、 cleaved-caspase9蛋白表达水平均显著升高(p《0.001)，bcl-2、mmp2、mmp9蛋白表达量均显著下降(p《0.001，p《0.01，p《0.001)；在sw620细胞中bax、cleaved-caspase3、 cleaved-caspase9、bcl-2蛋白表达水平均显著升高(p《0.001)，mmp2、mmp9蛋白表达量均显著下降(p《0.001，p《0.01，p《0.01)(见图8所示)。
[0136]
以上结果表明gbn、lca、cmc、tfgr均可以通过caspase凋亡通路促进人结肠癌sw480、sw620细胞凋亡的发生，gbn、tfgr还可能抑制人结肠癌sw480、sw620细胞的迁移与侵袭。
[0137]
1.3.7tfgr、lca、cmc及gbn对人结肠癌细胞凋亡转移侵袭相关mrna表达水平的影响 qrt-pcr结果显示，与对照组比较，lca药物干预后，在sw480细胞中caspase3、caspase9、 bax基因水平显著升高(p《0.001，p《0.01，p《0.05)，mmp2基因水平显著下降(p《0.05)；在sw620细胞中caspase3、caspase9的基因水平显著升高(p《0.001)，bcl-2、mmp2基因水平显著下降(p《0.001，p《0.001)(见图9中a所示)。
[0138]
与对照组比较，gbn药物干预后，在sw480细胞中caspase3、caspase9、bax基因水平显著升高(p《0.001，p《0.001，p《0.05)，mmp2基因水平显著下降(p《0.01)；在sw620细胞中caspase3、caspase9、bax的基因水平显著升高(p《0.001)，bcl-2、mmp2基因水平显著下降(p
《0.001)(见图9中b所示)。
[0139]
与对照组比较，tfgr药物干预后，在sw480细胞中caspase3、caspase9、bax基因水平显著升高(p《0.01，p《0.001，p《0.001)，bcl-2、mmp2基因水平显著下降(p《0.01，p《0.001)；在sw620细胞中caspase3、caspase9、bax基因水平显著升高(p《0.05，p《0.001，p《0.001)， bcl-2、mmp2基因水平显著下降(p《0.01，p《0.05)；(见图9中c所示)。
[0140]
与对照组比较，cmc药物干预后，在sw480细胞中caspase3、caspase9、bax基因水平显著升高(p《0.01，p《0.001，p《0.001)，bcl-2、mmp2基因水平显著下降(p《0.01，p《0.001)；在sw620细胞中caspase3、caspase9、bax基因水平显著升高(p《0.05，p《0.001，p《0.001)， bcl-2、mmp2基因水平显著下降(p《0.01，p《0.05)；(见图9中d所示)。
[0141]
以上结果表明gbn、lca、cmc、tfgr对人结肠癌细胞凋亡转移侵袭相关mrna表达水平有所影响。
[0142]
进一步，western blot法观察cmc药物调控pi3k-akt-m tor通路相关蛋白在sw480、sw620 细胞中的表达结果
[0143]
与control组比较，cmc药物干预后，在sw480、sw620细胞中pi3k、akt、mtor、p-pi3k、 p-akt、p-mtor蛋白表达水平显著下降(p《0.05)；见图9。western blot法结果提示：cmc 药物可以通过pi3k-akt-mtor促进sw480、sw620细胞凋亡的发生。
[0144]
1.3.8运用反向虚拟筛选技术探讨光甘草定(gbn)和甘草查尔酮a(lca)抗结肠癌的潜在作用靶标及信号通路，结果显示：
[0145]
①
既是在结直肠癌细胞中表达上调的蛋白又作用于信号通路的候选蛋白，光甘草定筛选的候选靶标共13个，lca候选蛋白靶标共16个。最终预测到lca与gbn均可能有作用的蛋白靶标有8个，它们是braf、tgfbr1、csnk2a1、ppard、cdk2、hsp90ab1、rxra和mapk14。这些靶标多集中在pi3k/akt、mtor、mapk、wnt信号通路上。
[0146]
②
与癌症细胞系数据库ccle(cancer cell line encyclopedia)中基因信息比对，gbn 和lca筛选的靶标与sw480细胞基因信息比对，共7个靶基因；与sw620细胞中基因信息能比对，共5个靶基因。这些靶基因与gbn和lca筛选的靶标中既是在结直肠癌细胞中表达上调的蛋白又作用于信号通路的候选靶基因进行比对，有三个靶基因能比对，分别是ppard、 tgfbr1和hsp90ab1，此靶基因参与wnt、tgf-β、mapk、pi3k/akt信号通路。
[0147]
1.3.9tfgr、gbn、lca、cmc体外抗结肠癌的蛋白质组学研究结果
[0148]
运用蛋白质组学技术检测甘草黄酮活性成分作用于人结肠癌细胞后蛋白的表达差异，并对差异表达蛋白质进行生物信息学分析，推测作用信号通路，以此探讨甘草黄酮活性成分抗结肠癌的潜在作用机制。结果表明：
[0149]
①
共鉴定到57965个肽段，6750个蛋白。人结肠癌sw620细胞对照组分别与给药组(lca、 gbn和tfgr)进行对比，lca组间差异蛋白183个，其中给药组上调蛋白31个，下调蛋白152 个；与gbn组间差异蛋白150个，其中给药组上调蛋白43个，下调蛋白107个与tfgr组间差异蛋白180个，其中给药组上调蛋白62个，下调蛋白118个。给药组(lca、gbn和tfgr) 分别与人结肠癌sw480细胞对照组比较，lca组间差异蛋白165个，其中给药组上调蛋白29 个，下调蛋白136个；gbn组间差异蛋白55个，其中给药组上调蛋白23个，下调蛋白32个； tfgr组间差异蛋白200个，其中上调蛋白66个，下调蛋白134个。
[0150]
②
go功能注释分析结果显示，与sw620细胞对照组比较，lca组差异蛋白进行go注
释分析参与生物进程21条，细胞成分3条，分子功能11条；gbn组差异蛋白go注释分析，参与生物进程19条，细胞成分2条，分子功能8条；tfgr组差异蛋白进行go注释分析，参与生物进程15条，细胞成分2条，分子功能11条。与sw480对照组比较，lca组差异蛋白进行go注释分析参与生物进程18条，细胞成分3条，分子功能14条；gbn组间差异蛋白go 注释分析参与生物进程16条，细胞成分2条，分子功能7条；tfgr组差异蛋白进行go注释分析，参与生物进程18条细胞成分2条，分子功能12条。
[0151]
③
kegg功能分析结果显示，lca、gbn、tfgr分别作用于sw620细胞后组间差异蛋白kegg 注释分析，显示差异蛋白总共参与kegg途径193条。
[0152]
④
各处理组对照人结肠癌sw620细胞组共有差异蛋白382个，参与kegg代谢途径260 条，将主要途径signal transduction途径中29个差异蛋白进一步进行kegg通路分析，显示其在癌症、mtor、pi3k-akt信号通路中参与蛋白数最多，药物处理组除gtp、热休克应激蛋白和胞间粘着分子这几个蛋白外，其余信号传导相关蛋白表达均呈现不同幅度的下调。各处理组对照人结肠癌sw480细胞组共有差异蛋白348个，参与kegg代谢途径225条，将 signaltransduction途径中27个差异蛋白进一步进行kegg通路分析，显示其在癌症、pi3k-akt两条信号通路中参与蛋白数最多，除血红素氧化酶-1、arf-6蛋白外，其余信号传导相关蛋白表达均呈现不同幅度的下调，指示药物处理对信号途径有较好的回调作用。这些蛋白当中有些重要蛋白的调控与结肠癌的凋亡、转移、侵袭相关。
[0153]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。