一种酶响应型二氧化硅释纳米制剂、制备方法及应用

1.本发明涉及药物制剂技术领域，具体涉及一种酶响应型二氧化硅释纳米制剂、制备方法及应用。


背景技术：

2.动脉粥样硬化(atherosclerosis)是导致心血管疾病(cardiovascular disease) 的主要原因之一。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其特点是脂质滞留在中、大动脉壁，单核细胞浸润形成斑块，随着疾病的发展最终可导致心肌梗死、缺血性卒中等致命事件。传统的药物治疗包括降脂药物(如他汀类、贝特类)、血小板聚集抑制剂、抗高血压药物和抗糖尿病药物(如噻唑烷二酮类)等通常疗效低、副作用严重，因此需要开发新型药物载体来精确治疗动脉粥样硬化。因此，各种多种功能化的有机或无机纳米颗粒被用来对抗动脉粥样硬化。
3.介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)因其具有高度有序的孔道、大表面积、高孔容、多种表面功能和良好的生物相容性而受到广泛关注。它们可以在内部或外部表面实现治疗药物高负载，同时以可控的方式释放药物。此外，通过修饰刺激应答的“开关”，可以进一步操纵药物的释放，在特定的环境刺激下可以将该“开关”移除，将密封的药物释放。此外，颗粒表面可与多种靶向配体偶联实现对目标细胞的精准给药。
4.动脉粥样硬化斑块部位和巨噬细胞内部存在大量透明质酸酶(haase)，可以针对透明质酸(ha)修饰的纳米制剂触发酶响应特性，从而加速药物从孔道内部的泄露；此外，巨噬细胞表面大量的cd44受体可以特异性结合透明质酸修饰的纳米制剂，通过细胞内吞作用进入巨噬细胞并释放药物。在纳米颗粒表面通过静电吸附修饰一层聚乙烯亚胺(pei)为透明质酸的化学修饰提供了大量的氨基基团。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种酶响应型二氧化硅纳米制剂，该纳米制剂拥有高载药量、低毒性、巨噬细胞靶向性以及斑块部位酶响应性药物释放的特点，具有具有酶响应性的二氧化硅纳米制剂是将辛伐他汀载入介孔二氧化硅纳米粒，然后通过将聚乙烯亚胺和透明质酸在介孔二氧化硅纳米粒外表面的逐层修饰形成，所制备纳米粒水合粒径为 100～220nm。
6.本发明的第二个目的是提供一种酶响应型二氧化硅纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
7.1)在碱性环境下制备介孔二氧化硅纳米粒，干燥煅烧后得到介孔二氧化硅纳米粒粉末；
8.2)将介孔二氧化硅纳米粒和辛伐他汀溶于溶剂中，反应至完全后收集样品，得到包载辛伐他汀的介孔二氧化硅纳米粒；
9.3)将聚乙烯亚胺加入到2)中获得的包载辛伐他汀的介孔二氧化硅纳米粒中，反应
完全后收集样品，获得聚乙烯亚胺修饰的包载辛伐他汀的介孔二氧化硅纳米粒；
10.4)将活化后的透明质酸钠加入到3)中获得的聚乙烯亚胺修饰的包载辛伐他汀的介孔二氧化硅纳米粒中反应，反应完全后收集样品，最终得到一种酶响应型二氧化硅纳米制剂；
11.优选的，2)中所述抗动脉粥样硬化药物为辛伐他汀一种。
12.优选的，2)中所述溶剂为二氯甲烷一种。
13.优选的，2)中所述介孔二氧化硅纳米粒与辛伐他汀的质量比为＝2:1～2；所述辛伐他汀在溶剂中的浓度为15～30mg/ml。
14.优选的，3)中所述聚乙烯亚胺在溶液中的浓度为2mg/ml。
15.优选的，3)中所述溶剂为ph＝7.4的pbs缓冲溶液；4)中，所述溶剂为超纯水。
16.优选的，4)中所述活化剂为酰胺缩合剂，所述酰胺缩合剂为edc/nhs。优选的，1)中，将十六烷基溴化铵和氢氧化钠溶于超纯水中，搅拌加热至 80℃，待溶液完全澄清后，加入无水乙醇，再搅拌5min，然后缓慢滴入正硅酸乙酯溶液，在80℃下反应2h，经离心、蒸馏水洗涤3次，甲醇洗涤1 次，然后将产物转移到蒸发皿中，在恒温烘箱中烘干一夜，待产物完全干燥后，转移到马弗炉，550℃下煅烧5h，最终得到白色粉末，产物记录为介孔二氧化硅纳米粒msn；
17.2)中，30mg msn和15mg辛伐他汀sim混合于2ml二氯甲烷中，超声10min使其分散均匀后在室温下搅拌24小时，接下来，离心去除上清液，剩余固体在真空烘箱中室温干燥24小时后，产物记为辛伐他汀负载的介孔二氧化硅纳米粒sim@msn；
18.3)中称取sim@msn分散在pbs中，500rpm转速下，在纳米溶液中缓慢滴加100μl pei溶液，常温搅拌30min，然后将产物离心，水洗涤3 次，4度保存，记为辛伐他汀负载的聚乙烯亚胺包覆的介孔二氧化硅纳米粒 sim@pei-msn；
19.4)中，ha、nhs和edc溶解在超纯水中并搅拌1h活化羧基，然后加入sim@pei-msn，超声分散10min后继续搅拌24h，然后将产物离心，水洗涤3次，冷冻干燥过夜，产物记为一种酶响应型二氧化硅释纳米制剂sim@ha-msn。
20.在本发明的技术方案中，步骤4)所述酰胺缩合剂选自edc/nhs。
21.本发明中所用的聚乙烯亚胺为市售产品，其分子量优选为10kda；本发明中所用的透明质酸钠为市售产品，其分子量优选为330kda。
22.本发明的第三个目的是提供一种酶响应型二氧化硅纳米制剂的应用，酶响应型二氧化硅纳米制剂被应用于动脉粥样样硬化的治疗中。
23.本发明与现有技术相比，其有益效果在于：
24.本发明的一种酶响应型二氧化硅纳米制剂的制备方法简单，成本低，无污染；纳米粒粒径均匀、分散性好，且具有高载药量、高生物相容性和低毒性的特点，可以在提高辛伐他汀的生物利用度的同时特异性靶向巨噬细胞表面的cd44受体，并在病灶部位高浓度酶环境下触发酶响应特性释放药物来提高其抗动脉粥样硬化效果。
附图说明
25.图1为本发明中制备的一种酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的工艺流程图；
26.图2为本发明中制备的一种酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的透射电子显微镜
图；
27.图3为本发明中制备的一种酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的水合粒径图；
28.图4为本发明中制备的一种酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的zeta电势图；
29.图5为本发明中制备的一种酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的氮气吸附/脱附曲线；
30.图6为本发明中制备的一种酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的体外释药曲线；
31.图7为本发明中制备的一种酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的细胞毒性评价结果图；
32.图8为本发明中制备的一种酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的血液相容性评价结果图；
33.图9为本发明中制备的一种酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的细胞摄取评价结果图；
34.图10为本发明中制备的一种酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的体外抗炎评价结果图；
35.图11为本发明中制备的一种酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的抗巨噬细胞泡沫化评价结果图。
具体实施方式
36.为了使本发明技术方案更容易理解，现结合附图采用具体实施例的方式，对本发明的技术方案进行清晰、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
37.实施例1
38.一种酶响应型二氧化硅纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
39.1)将0.4g的十六烷基溴化铵和1.44ml 2m的氢氧化钠溶于200ml 超纯水中，搅拌加热至80℃。待溶液完全澄清后，加入0.4ml无水乙醇，再搅拌5min，然后缓慢滴入2ml正硅酸乙酯溶液，在80℃下反应2h。经离心(10200rpm,15分钟)，蒸馏水洗涤3次，甲醇洗涤1次。然后将产物转移到蒸发皿中，在恒温烘箱中烘干一夜。待产物完全干燥后，转移到马弗炉，550℃下煅烧5h，最终得到白色粉末，产物记录为介孔二氧化硅纳米粒msn。
40.2)30mg msn和15mg辛伐他汀sim混合于2ml二氯甲烷中，超声 10min使其分散均匀后在室温下搅拌24小时。接下来，离心去除上清液，剩余固体在真空烘箱中室温干燥24小时后，产物记为辛伐他汀负载的介孔二氧化硅纳米粒sim@msn。
41.3)称取30mg sim@msn分散在4ml pbs中，500rpm转速下，在纳米溶液中缓慢滴加100μl pei溶液(75mg/ml)，常温搅拌30min。然后将产物离心，水洗涤3次，4度保存，记为辛伐他汀负载的聚乙烯亚胺包覆的介孔二氧化硅纳米粒sim@pei-msn。
42.4)15mg ha、40mg nhs和30mg edc溶解在10ml超纯水中并搅拌1h活化羧基，然后加入30mg sim@pei-msn，超声分散10min后继续搅拌24h，然后将产物离心，水洗涤3次，冷冻干燥过夜，产物记为一种酶响应型二氧化硅释纳米制剂sim@ha-msn。酶响应型介孔二氧化硅纳米制剂的工艺流程图请同时参阅图1。
43.如图2所示，为本发明中制备的一种酶响应型二氧化硅纳米制剂的透射电镜图，可
以看出纳米粒呈椭圆形，表面分布的二维孔道因聚合物的修饰而难以分辨，如图3所示水合粒径结果为189.1
±
5.8nm。
44.如图4所示，实施例1所制备的msn、sim@pei-msn和sim@ha-msn 的zeta电位分别为-25.1
±
2.8mv、+30.1
±
3.0mv和-22.6
±
3.4mv，三者表面电荷绝对值都较高，颗粒之间的排斥作用较强，因此在溶液中可以稳定分散。
45.如图5所示，为氮气吸附脱附曲线图和孔径分布图，与msn相比， sim@ha-msn的bet比表面积、孔体积和孔径均显著减小，表明纳米表面得到了成功改性。
46.实施例2
47.一种介孔二氧化硅纳米粒的载药量和包封率测定方法，包括以下步骤：
48.采用紫外分光光度仪测定辛伐他汀负载的介孔二氧化硅纳米粒 sim@msn的载药量和包封率。精密称取30mg msn和15mg sim混合于 2ml二氯甲烷中，超声10min使其分散均匀后在室温下搅拌24小时。后离心收集上清液，过0.22μm滤膜，然后用紫外分光光度仪测量辛伐他汀含量，检测波长设置为238nm。
49.根据下面列出的方程式进行计算：
50.载药量＝(纳米中药物含量)/(纳米总量)
×
100％
51.包封率＝(实际载药量)/(初始投药量)
×
100％
52.表1为实施例1所制备的辛伐他汀负载的介孔二氧化硅纳米粒 sim@msn的载药量与包封率。
53.表1：
54.载药量(％)包封率(％)21.32
±
1.3155.21
±
2.23
55.从表1可知，实施例1所制备的辛伐他汀负载的介孔二氧化硅纳米粒 sim@msn拥有较高的载药量和包封率。
56.实施例3
57.一种酶响应型二氧化硅纳米制剂sim@ha-msn体外酶响应释放的研究，包括以下步骤：
58.简单地说，将一定量的纳米颗粒均匀地分散在40ml pbs(10mm，含 0.2％sds,ph＝7.4)中。为了研究酶的响应性，选择在介质中加入透明质酸酶。所有样品在37℃下以100rpm的速度摇匀。在指定的时间间隔，离心样品，收集缓冲液2ml，更换相同体积的新鲜缓冲液。采用agilent c18色谱柱(4.6mm
×
250mm,5μm)，在238nm波长下用高效液相色谱(hplc, agilent 1200系列)测定sim释放量。流动相为乙腈:0.025m磷酸二氢钠溶液(76:24v:v)，流速1.0ml/min，进样量20μl。
59.如图6所示，实例3辛伐他汀体外释放结果。sim@msn在48h内的缓释量为70.11
±
4.64％，而sim@ha-msn的缓释量为28.02
±
4.11％，表明 ha涂层可有效阻止sim的释放。为了模拟高水平透明质酸酶(haase)表达的斑块环境，在缓冲液中加入haase(100u/ml)。与空白pbs的低药物释放相比，sim@ha-msn在48h内药物释放率为62.24
±
5.82％，原因是haase 降解后ha层迅速破裂。总的来说，这些结果表明sim@ha-msn上的ha 修饰可以作为一个“看门人”，可以有效地阻断正常组织的药物泄漏，且相较于sim@msn有着体外缓释的效果。
60.实施例4
61.一种酶响应型二氧化硅纳米制剂对细胞毒性的研究，包括以下步骤：
62.如图7所示为纳米粒对小鼠巨噬细胞raw264.7细胞和人脐静脉上皮细胞huvec细胞细胞毒性的结果，采用阿尔玛蓝试剂测定纳米粒对细胞的毒性。具体步骤为：分别将raw264.7细胞和huvec细胞接种到96孔板中，每孔密度为5
×
103细胞，在温度为37℃，湿度为5％co2培养箱中培养过夜。在96孔板上分别加入不同浓度(0,10,50,200,400μg/ml)的 sim@ha-msn作为实验组和空白培养基作为对照组。24h后弃掉培养基, 每孔加入100μl alamar blue试剂继续孵育4h。然后利用酶标仪 (spectramax id5,bio-strategy)进行分析，波长设置为570nm和600nm。计算并报告实验组与对照组的细胞活力百分比
63.细胞毒性实验结果显示sim@ha-msn在20-400μg/ml浓度下孵育细胞24h后，raw 264.7细胞和huvecs的存活率均高于80％，表明颗粒具有良好的细胞相容性。高剂量sim@ha-msn导致细胞活力下降可能是由于释放的sim可以抑制巨噬细胞的增殖，抑制斑块炎症反应。
64.实施例5
65.一种酶响应型二氧化硅纳米制剂对血液相容性的研究，包括以下步骤：
66.如图8所示评估了纳米粒的血液相容性。由于红细胞的损伤可诱导血红蛋白的释放，溶血率通过测定上清液中血红蛋白在576nm波长的吸光度来测定。msn的溶血率呈剂量依赖性，800μg/ml时溶血率高达46.24
±ꢀ
3.92％，红细胞明显溶血。相反的是，sim@ha-msn的溶血率(《5％)可以忽略。这一结果表明sim@ha-msn由于ha的屏蔽作用，与裸msn相比具有更好的血液相容性。
67.实施例6
68.一种酶响应型二氧化硅纳米制剂对细胞摄取的研究，包括以下步骤：
69.如图9所示研究了cd44介导的细胞摄取。将raw264.7细胞以5
×
104/ 孔的密度接种在24孔板中，在温度为37℃，湿度为5％co2培养箱中培养过夜。每孔加入100ng/ml lps，孵育24h。pbs洗涤后，fitc修饰的 ha-msn(fitc-ha-msn)和msn(fitc-msn)分别与raw264.7细胞共孵育2h，每组最终浓度为50μg/ml。pbs洗涤后，用100μl 4％pfa溶液在每孔固定10min,dapi染色10min。最后在共聚焦激光扫描显微镜 (clsm,leica stellaris)下观察细胞。竞争抑制实验中，用含ha的培养基(10 mg/ml)代替空白培养基，再用fitc标记的ha-msn(50mg/ml)与 raw264.7细胞共培养，处理方法与上述相同。
70.fitc-msn处理后的细胞呈现微弱的绿色荧光。相反，fitc-ha-msn 组捕捉到显著的绿色荧光。值得注意的是，在fitc-ha-msn处理前，用 10mg/ml的游离ha处理raw264.7细胞，由于游离ha阻断了巨噬细胞上的cd44受体，从而阻碍了细胞对ha-msn的识别和内化，因而呈现出非常微弱的绿色荧光。因此，上述数据表明，ha可以通过cd44介导的内化作用发挥靶向炎症巨噬细胞的作用。
71.实施例7
72.一种酶响应型二氧化硅纳米制剂对巨噬细胞炎症因子水平影响的研究，包括以下步骤：
73.如图10所示sim@ha-msn对raw264.7细胞分泌的典型炎症因子的影响。简单地说，将对数期生长的raw264.7以105/ml的密度接种到24孔板中，在37℃的5％co2培养箱中孵育一夜。阳性对照组用100ng/ml lps 处理24h，其余各组加入等量lps的同时分别加入等效的
游离sim、 sim@msn或sim@ha-msn处理24h。采用elisa试剂盒检测tnf-α和il-6蛋白浓度。与仅用lps刺激的对照组相比，经sim、sim@msn和sim@ha-msn处理后tnf-α和il-6水平显著降低。值得注意的是， sim@ha-msn组tnf-α和il-6的最低水平分别为514.12和273.62pg/ml。结果表明sim@ha-msn对炎性巨噬细胞拥有强大的抗炎作用。
74.实施例8
75.一种酶响应型二氧化硅纳米制剂对巨噬细胞泡沫化影响的研究，包括以下步骤：
76.如图11所示sim@ha-msn对raw264.7细胞诱导的泡沫细胞的抑制作用。简单地说，以5
×
104/孔的密度将细胞接种在24孔板上，在37℃的 5％co2培养箱中孵育一夜。阳性对照组用100ng/ml lps处理24h，其余各组加入等量lps的同时分别加入等效的游离sim、sim@msn或sim@ha-msn处理24h。随后,pbs的附着在每组巨噬细胞洗3次,固定为 4％pfa 10分钟,用新滤过的0.3％油红o染色15min。最后在60％异丙醇中放置5min，用光学显微镜成像。我们评估了sim@ha-msn对oxldl诱导的泡沫巨噬细胞形成的抑制作用，经过sim、sim@msn和 sim@ha-msn处理后，油红染色区域明显减少。其中sim@ha-msn的抑制作用最显著，染色面积仅为6.77
±
0.85％。这些结果证实了 sim@ha-msn对巨噬细胞泡沫的有效抑制作用，这可能有助于清除斑块中的泡沫细胞。
77.通过上述实施例3至实施例8，可以证明，具有酶响应性的二氧化硅纳米制剂对于动脉粥样硬化具有很好的治疗作用。
78.应当注意，在此所述的实施例仅为本发明的部分实施例，而非本发明的全部实现方式，所述实施例只有示例性，其作用只在于提供理解本发明内容更为直观明了的方式，而不是对本发明所述技术方案的限制。在不脱离本发明构思的前提下，所有本领域普通技术人员没有做出创造性劳动就能想到的其它实施方式，及其它对本发明技术方案的简单替换和各种变化，都属于本发明的保护范围。