一种包含骨桥蛋白的益生菌组合物的制作方法

1.本发明属于益生菌技术领域，具体涉及一种特别适于婴幼儿使用的效果增加、作用时间延长的包含骨桥蛋白的益生菌组合物。本发明还涉及所述益生菌组合物在制备预防、改善或治疗黄疸的产品中的用途。


背景技术：

2.益生菌(probiotics)是有益于宿主健康和/或生理功能的含有足够数量的活的微生物。其摄入宿主体内后，通过改善宿主肠道等黏膜表面的菌群或酶的平衡、刺激机体的特异性或非特异性免疫力等从而产生健康益处。益生菌近年来无论作为健康食品还是治疗制剂均受到广泛关注尤其在儿科的临床应用备受瞩目。
3.用于功能性食品、保健品或药品的益生菌应该满足以下标准：有益的生理作用。益生菌株是人体内正常菌群的成员、或是能调节体内正常菌群平衡对人体无毒无害的一些外来细菌。菌种具有稳定的生物学、遗传学特性。菌种能保持稳定的活菌状态，适于大规模工业生产。人可以安全使用。耐受酸、胆汁的作用。能够产生抗微生物物质。目前国内外的益生菌制剂较多，多菌种制剂大多是以乳酸菌、双歧杆菌为主制成，除此以外还有酵母菌、肠球菌、芽孢杆菌等。益生菌剂型多样，有片剂、滴剂、胶囊、颗粒剂等。
4.黄疸是常见的临床症状，在新生儿期尤为常见，医学上把未满月(出生28天内)新生儿的黄疸，称之为新生儿黄疸(neonatal jaundice)。新生儿黄疸是指新生儿时期，由于胆红素代谢异常，引起血中胆红素水平升高，而出现皮肤、粘膜及巩膜黄染为特征的症状，是新生儿中最常见的临床问题。由于其发病机制不同，它既可以是生理现象，又可以是病理现象。生理性黄疸是指单纯因胆红素代谢特点引起的暂时性黄疸，在出生后2-3天出现，4-6天达到高峰，7-10天消退，早产儿持续时间较长。若生后24小时即出现黄疸，每日血清胆红素升高超过5mg/dl或每小时＞0.5mg/dl；持续时间较长，足月儿大于2周，早产儿大于4周仍不消退，甚至继续加深加重或消退后重复出现或生后一周至数周内才开始出现黄疸，均为病理性黄疸。
5.有文献报道，肠道益生菌可以帮助新生儿肠道菌群建立，加快胆红素排泄，在蓝光治疗基础上给予益生菌，不仅退黄效果显著，且不良反应明显减少(例如，参见，曾瑜斌，“肠道益生菌联合蓝光照射治疗新生儿病理性黄疸的疗效及对患儿免疫功能的改善作用”，中国药物经济学，2020年第15卷第3期，第86-89页)。另有研究表明，母乳性黄疸患儿口服益生菌制剂5天，可显著降低血清胆红素水平，减少十二指肠液和粪便中肠腔内β-葡萄糖醛酸酶(β-gd)的含量(例如，参见，郑承宁等，“微生态调节剂在儿科的临床应用”，世界临床药物，2004年第4卷第5期，第26-27页)。但是，在实际应用中，益生菌单独使用通常效果不佳，其一般与其他药物联用或用于辅助其他疗法，并且通常需要长期大量使用才能产生较好的效果。显然，这对于益生菌在婴幼儿中的使用是不利的。
6.骨桥蛋白(opn)最初发现于骨骼中，人乳中质量浓度也相对较高。骨桥蛋白是高度糖基化和磷酸化的酸性蛋白质，包含一段精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列。骨桥蛋白在免疫
激活、创伤修复、血管再生、骨骼重塑过程中具有重要的生理作用。目前，牛乳来源的骨桥蛋白已实现了规模化生产和商业应用，添加骨桥蛋白的婴儿配方乳粉也逐渐成为研究热点。donovan等将新生恒河猴随机分组喂养观察3个月，发现普通配方粉(骨桥蛋白质量浓度10mg/l)和人乳(骨桥蛋白质量浓度约130mg/l)喂养的恒河猴在转录组上存在差异，这些转录组与生长发育、半乳糖代谢、细胞骨架重塑和免疫应答等密切相关，食用添加骨桥蛋白的配方粉(骨桥蛋白质量浓度125mg/l)可使这种差异降低至1/5以下(参见，例如，陈建行等，“婴儿配方乳粉蛋白质的人乳化研究进展”，中国乳品工业，第44卷，第9期，2016年，第31-37、46页)。现在已经发现了骨桥蛋白的多种药理学作用，但是目前尚无骨桥蛋白与益生菌联用方面的报道，也没有将骨桥蛋白用于预防或治疗黄疸方面的报道。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，本发明通过以特定用量比例将主要活性成分益生菌与辅助成分骨桥蛋白组合，制成了一种特别适于婴幼儿使用的效果增加、作用时间延长的益生菌组合物。本发明还涉及所述益生菌组合物在制备预防、改善或治疗黄疸的产品中的用途。
8.具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
9.在第一个方面中，本发明提供了一种包含骨桥蛋白的益生菌组合物，所述组合物包含益生菌和骨桥蛋白，所述益生菌和骨桥蛋白的重量比为2-10：0.5-1，其中所述益生菌是主要活性成分，所述骨桥蛋白是用于增强益生菌效果、延长益生菌作用时间的辅助成分，所述益生菌选自双歧杆菌和/或乳杆菌。
10.作为可选的方式，在上述益生菌组合物中，所述所述益生菌和骨桥蛋白的重量比为2-5：1。
11.作为可选的方式，在上述益生菌组合物中，所述所述益生菌和骨桥蛋白的重量比为3.8：1。
12.作为可选的方式，在上述益生菌组合物中，益生菌的含量范围为106cfu/100g-10
13
cfu/100g。
13.作为可选的方式，在上述益生菌组合物中，所述益生菌选自以下一种或多种：动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis bb-12)、长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis r0033)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)、动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis hn019)、动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis bi-07)、短双歧杆菌(bifidobacterium breve m-16v)，瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)、鼠李糖乳酪杆菌(lactobacillus rhamnosus lgg)或鼠李糖乳酪杆菌(lactobacillus rhamnosus hn001)。
14.作为可选的方式，在上述益生菌组合物中，所述益生菌选自以下一种或多种：瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)或长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis r0033)。
15.作为可选的方式，在上述益生菌组合物中，所述益生菌选自瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)或长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis r0033)的组合。
16.优选地，在上述益生菌组合物中，所述益生菌由瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)或长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis r0033)组成，其中以重量份数计，所述瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus r0052)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum r0071)或长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis r0033)的比例为11.6：1：2。
17.作为可选的方式，在上述益生菌组合物中，所述组合物还包含母乳低聚糖，所述母乳低聚糖选自2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-二盐藻四糖、乳糖-n-盐藻基戊糖i、乳糖-n-盐藻基戊糖ii、乳糖-n-盐藻基戊糖iii、乳糖-n-四糖、乳酰-n-新四糖、3
’‑
唾液乳糖、6
’‑
唾液乳糖、唾液酸基乳糖基-n-四糖或二唾液酸基乳糖基-n-四糖的一种或多种。
18.作为可选的方式，在上述益生菌组合物中，所述益生菌组合物是口服制剂，所述口服制剂的剂型是口服液、滴剂、片剂、粉剂、胶囊剂或颗粒剂。
19.在第二个方面中，本发明提供了骨桥蛋白用于增强益生菌效果、延长益生菌作用时间的用途，骨桥蛋白和益生菌均包含在上述第一个方面所述的益生菌组合物中。
20.作为可选的方式，在上述用途中，所述骨桥蛋白显著增强益生菌预防、改善或治疗黄疸的效果。
21.在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的益生菌组合物在制备预防、改善或治疗黄疸的产品中的用途。
22.作为可选的方式，在上述用途中，所述黄疸是婴儿黄疸。
23.可选地，所述黄疸是溶血性黄疸。
24.所述婴儿是指月龄为0-12个月的婴幼儿，优选地为月龄为0-6个月的婴幼儿，更优选地为月龄为0-3个月的婴幼儿。
25.作为可选的方式，在上述用途中，所述产品是药物、功能性食品或保健品。
26.本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
27.(1)本发明以特定用量比例将主要活性成分益生菌与辅助成分骨桥蛋白组合，后者能够有效增强益生菌的效果(特别是在预防、改善或治疗黄疸中的效果)，延长益生菌的作用时间，从而极大地降低益生菌的用量。
28.(2)本发明益生菌组合物中使用婴儿配方奶粉和营养补充剂中可以使用的骨桥蛋白作为辅助成分，对于婴幼儿特别是婴儿是非常安全的。
29.(3)本发明益生菌组合物能够口服施用，例如可以将其制成能够加入婴幼儿配方奶粉或母乳中服用的制剂，以便于使用并增加婴幼儿的依从性。
具体实施方式
30.本发明人在对益生菌作用的深入研究中，通过大量筛选，意外地发现了能够显著提高益生菌效果、延长其作用时间并显著降低其用量的方法，研制出了一种特别适于婴幼儿使用的效果增加、作用时间延长的包含骨桥蛋白的益生菌组合物。本发明还涉及所述益生菌组合物在制备预防、改善或治疗黄疸的产品中的用途。在此基础上完成了本发明。
31.如本文所用，“辅助成分”通常指不具有或几乎不具有目标活性，但是能够增强主要活性成分目标活性的物质。
32.如本文所用，术语“婴儿”是指月龄为0-12个月的婴幼儿，优选地为月龄为0-6个月的婴幼儿，更优选地为月龄为0-3个月的婴幼儿。
33.如本文所用，“益生菌”是一种肠道微生态制剂，待婴幼儿口服后，其将于婴幼儿肠道内生长繁殖，从而可使婴幼儿肠道于短时间内出现有益菌群，并维持正常菌群达到最佳状态。
34.本发明益生菌组合物是口服制剂，所述口服制剂的剂型是口服液、滴剂、片剂、粉剂、胶囊剂或颗粒剂。优选的口服制剂是能够加入婴儿配方奶粉或母乳中服用的制剂。
35.上述各种剂型可以根据制剂领域的常规工艺制备而成。
36.本发明中涉及的各种益生菌均为市售产品。
37.下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
38.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
39.下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
40.实施例：本发明益生菌组合物对实验性黄疸的体内药效学实验1.实验材料与方法
41.1.1实验动物
42.清洁级成年雄性sd大鼠，体重200g-250g。
43.1.2主要实验药物及试剂
44.瑞士乳杆菌r0052：拉曼，1.5
×
10
11
cfu/g，两歧双歧杆菌r0071:拉曼，5
×
10
10
cfu/g，长双歧杆菌婴儿亚种r0033，拉曼，2.5
×
10
10
cfu/g。骨桥蛋白、乙酰苯肼(aph)、总胆红素测定试剂盒、直接胆红素测定试剂盒、谷胱苷肽测定试剂盒等。
45.1.3动物模型的建立和分组给药
46.以下实验主要参考cn104739818a中所示的方法，并根据实际情况略作修改。简言之，本实施例采用乙酰苯肼(aph)作为造模药物，建造溶血性黄疸的大鼠模型，此模型也是国内外用于研究新生儿溶血性黄疸的常用模型。溶血性黄疸的最突出特征是患者的红细胞发生崩解，造成溶血。而造模所用药物乙酰苯肼对红细胞具有缓慢进行性氧化损伤性作用，使红细胞易于崩解，同时由于红细胞破裂胆红素释放，造成肝功能的损伤。其模拟的机理和病症等均与溶血性黄疸类似。
47.取体重在要求范围内的健康sd大鼠80只，随机挑出10只，作为正常对照组，剩余的70只大鼠，按剂量150mg/kg腹腔注射乙酰苯肼(aph)，连续注射3天，诱导建造红细胞氧化性溶血性黄疸的动物模型。之后对造模大鼠进行抽血比较，发现其胆红素与正常大鼠相比，显著升高，提示建模成功，且造模过程中无大鼠死亡。从建模成功的大鼠中选出70只大鼠随机平均分为7组，每组10只大鼠，分别命名为：模型对照组(n＝10)、骨桥蛋白组(n＝10)、r0052+r0071+r0033组(n＝10)、r0052+r0071+r0033+骨桥蛋白组(n＝10)、r0052+r0071组(n＝10)、r0052+r0071+骨桥蛋白组(n＝10)、连同正常对照组(n＝10)，共7个实验组，共70只。
48.本实验采用灌胃给药的方式对各组大鼠进行给药，空白组和模型组灌胃给予溶剂生理盐水溶液。给药时间为8天。各组治疗药物的组成和用量根据人与动物的剂量转换关系
进行换算，具体用量如下所示：
49.(1)骨桥蛋白组：骨桥蛋白：31mg/kg/d，以生理盐水作为溶剂，灌胃给药。
50.(2)r0052+r0071+r0033组：r0052：93mg/kg/d，r0071：8mg/kg/d，r0033：16mg/kg/d，将上述各成分按照重量比例制成混合物，以生理盐水作为溶剂，灌胃给药。
51.(3)r0052+r0071+r0033+骨桥蛋白组：r0052：93mg/kg/d，r0071：8mg/kg/d，r0033：16mg/kg/d，骨桥蛋白：31mg/kg/d，将上述各成分按照重量比例制成混合物，以生理盐水作为溶剂，灌胃给药。
52.(4)r0052+r0071组：r0052：93mg/kg/d，r0071：24mg/kg/d，将上述各成分按照重量比例制成混合物，以生理盐水作为溶剂，灌胃给药。
53.(5)r0052+r0071+骨桥蛋白组：r0052：93mg/kg/d，r0071：24mg/kg/d，骨桥蛋白：31mg/kg/d，将上述各成分按照重量比例制成混合物，以生理盐水作为溶剂，灌胃给药。
54.2.实验及检测指标
55.(1)治疗实验结束后(连续治疗8天)，采用浓度为1％的戊巴比妥钠溶液对大鼠进行腹腔注射进行麻醉，麻醉剂量为40mg/kg。，麻醉后对各组大鼠进行心脏采血，并分组标号。每份采血样品分为三份，一份用以测定肝功能的指标，另两份保存于-20℃冰箱内，备用。本实施例中采用速率法对alt(丙氨酸氨基转移酶酶)和ast(天冬氨酸氨基转移酶)活性进行测定，采用α-gst(α-谷胱甘肽-s-转移酶)检测试剂盒对α-gst进行检测；
56.(2)将(1)中留存的血样品取出，采用总胆红素检测试剂盒和直接胆红素检测试剂盒，对总胆红素和直接胆红素进行检测。
57.3.统计学处理
58.连续型变量形式的实验数据以表示，两组数据间的比较用两样本t检验。采用spss 23.0统计软件，p《0.05为有统计学意义。
59.4.实验结果
60.4.1本发明益生菌组合物对大鼠血清α-gst、alt、ast水平的影响
61.实验结果如下表1所示。在模型组中，血清α-gst、alt、ast水平与正常对照组相比显著升高，两组间具有显著性差异(p《0.01)，血清α-gst、alt、ast水平显著升高是溶血性黄疸的特征，这些结果表明大鼠实验性黄疸动物模型造模成功。
62.在r0052+r0071+r0033组中，血清α-gst、alt、ast水平在8天治疗后，已经显著下降，其与模型对照组之间存在显著性差异(p《0.05，p《0.01)。在骨桥蛋白组中，血清α-gst、alt、ast水平在8天治疗后，仅略低于模型对照组，表明单独使用骨桥蛋白并不能改善实验动物的实验性黄疸。
63.在r0052+r0071+r0033+骨桥蛋白组中，血清α-gst、alt、ast水平在8天治疗后，显著下降，上述指标的测定结果已经与正常对照组的测定结果接近，其与模型对照组之间存在显著性差异(p《0.01)。该结果表明，在r0052+r0071+r0033中加入较低剂量的骨桥蛋白后，与单独使用r0052+r0071+r0033的结果相比，能够非常显著的改善益生菌对实验动物实验性黄疸的治疗作用(p《0.05)。
64.此外，表1中的结果还表明，在r0052+r0071组中，血清α-gst、alt、ast水平在8天治疗后，也显著下降，其与模型对照组之间存在显著性差异(p《0.05)。但是，尽管r0052+r0071组使用的益生菌总量与r0052+r0071+r0033组是相同的，该组益生菌对血清α-gst、alt、ast
水平的影响显著不及r0052+r0071+r0033组。并且，r0052+r0071+骨桥蛋白组对血清α-gst、alt、ast水平的影响也显著不及r0052+r0071+r0033+骨桥蛋白组。据此可以推测，本发明益生菌组合物对实验性黄疸的作用效果可能还与组合物中益生菌的具体种类及其配比相关。
65.表1：各组大鼠血清α-gst、alt、ast的活性检测(平均值
±
sd)
[0066][0067][0068]
注释：
**
p《0.05，与正常对照组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01，与模型对照组比较，
△
p《0.05，与r0052+r0071+r0033组比较。
[0069]
4.2本发明益生菌组合物对大鼠总胆红素和直接胆红素水平的影响
[0070]
实验结果如下表2所示。模型对照组的总胆红素和直接胆红素水平显著升高，与正常对照组相比，两组间具有显著性差异(p《0.01)，红细胞破裂释放胆红素使得血液中胆红素的水平升高是溶血性黄疸的特征，这些结果表明大鼠实验性黄疸动物模型造模成功。
[0071]
在r0052+r0071+r0033组中，总胆红素和直接胆红素水平在8天治疗后，已经显著下降，其与模型对照组之间存在显著性差异(p《0.05，p《0.01)。在骨桥蛋白组中，总胆红素和直接胆红素水平在8天治疗后，仅略低于模型对照组，表明单独使用骨桥蛋白并不能改善实验动物的实验性黄疸。
[0072]
在r0052+r0071+r0033+骨桥蛋白组中，总胆红素和直接胆红素水平在8天治疗后，显著下降，上述指标的测定结果已经与正常对照组的测定结果接近，其与模型对照组之间存在显著性差异(p《0.01)。该结果表明，在r0052+r0071+r0033中加入较低剂量的骨桥蛋白后，与单独使用r0052+r0071+r0033的结果相比，能够非常显著的改善益生菌对实验动物实验性黄疸的作用(p《0.05)。
[0073]
此外，表2中的结果还表明，在r0052+r0071组中，总胆红素和直接胆红素水平在8天治疗后，也显著下降，其与模型对照组之间存在显著性差异(p《0.05)。但是，尽管r0052+r0071组使用的益生菌总量与r0052+r0071+r0033组是相同的，该组益生菌对总胆红素和直接胆红素水平的影响显著不及r0052+r0071+r0033组。并且，r0052+r0071+骨桥蛋白组对总胆红素和直接胆红素水平的影响也显著不及r0052+r0071+r0033+骨桥蛋白组。据此可以推测，本发明益生菌组合物对实验性黄疸的作用效果可能还与组合物中益生菌的具体种类及其配比相关。
[0074]
表2：各组大鼠总胆红素和直接胆红素的含量测定(平均值
±
sd，μmol/l)
[0075][0076]
注释：
**
p《0.05，与正常对照组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01，与模型对照组比较，
△
p《0.05，与r0052+r0071+r0033组比较。
[0077]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。