异叶茴芹提取物在制备预防或治疗肝衰竭药物中的应用

异叶茴芹提取物在制备预防或治疗肝衰竭药物中的应用
(一)技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种异叶茴芹提取物在制备预防或治疗肝衰竭药物中的应用。
(二)

背景技术：

2.急性肝衰竭(acute liver failure，alf)是一种发病急、病情重、死亡率极高的严重肝脏疾病；临床上常表现为肝细胞大量凋亡、坏死，肝功能、凝血功能障碍、黄疸和肝性脑病等复杂症状。alf病因复杂，且存在明显地域差异性；如戊型肝炎病毒(hev)是印度alf的主要因素，而在西方，对乙酰氨基酚等药物和酗酒是引发alf的主要原因。鉴于alf发病确切机制尚不清楚，目前临床上主要针对alf病症给予综合性治疗，但疗效欠佳；人工肝可较好改善肝功能，降低死亡率，但血浆来源不足，血透等费用昂贵；肝脏移植是终末期alf 治疗的最佳选择，但肝源稀缺，术后免疫排斥和高昂费用等因素极大制约了其临床应用。因此，寻找一种预防、治疗或缓解alf的有效药物仍然是当前alf防治研究的重要方向。
3.临床研究表明，源自肠道菌群的脂多糖(lipopolysaccharide，lps)可激活肝脏巨噬细胞释放肿瘤坏死因子-ɑ
(tnf-ɑ
)等炎症因子，这些因子作用于病毒、药物或酒精等损伤因子致敏的肝细胞时可加剧肝细胞凋亡、坏死，从而引发alf。lps和 d-氨基半乳糖(d-galactosamine，d-glan)联合处理是目前较为公认的alf模型诱导方法，能够较好模拟临床alf症状。因此，采用lps/d-glan诱导的小鼠急性alf 模型评价保肝药物，探究其可能分子机制，对关键保肝活性成分发现和保肝药物开发具有重要意义。
4.畲药异叶茴芹为伞形科植物异叶茴芹(pimpinella diversifolia dc.)的干燥全草，具有理气止痛、活血通经、除湿解毒和消积健脾等功效，民间常用于肺结核、痢疾、小儿疳积和风湿痹痛等病证治疗。现代药理学研究表明，异叶茴芹水提物、醇提物均具有一定抗炎、止血及镇痛作用，其总黄酮具有较好抗氧化活性，乙醇浸提酊剂对急性扭伤具有较好疗效。此外，研究发现，异叶茴芹根、茎叶富含挥发油，叶藓品中含量高达1.7％。gc-ms鉴定发现，根、茎叶挥发油中均含有丰富的萜类和芳香族类化合物，然而几乎未见其系统的药理学相关研究报道。
5.本发明公开了一种异叶茴芹根挥发油(pimpinella diversifolia root essential oil， pdreo)在预防和治疗急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭疾病方面的应用，查阅文献，未见有关异叶茴芹用于肝衰竭相关疾病治疗的应用，更未见异叶茴芹根挥发油调节氧化应激相关酶系、抑制肝细胞凋亡、拮抗肝衰竭相关报道。
(三)

技术实现要素：

6.本发明目的是提供一种异叶茴芹提取物在制备预防或治疗急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭药物中的应用，异叶茴芹提取物通过上调抗氧化相关基因表达，抑制肝细胞凋亡，几乎可完全拮抗lps/d-glan诱导的c57bl/6小鼠肝脏衰竭，表现出显著的保肝活性，达到预防或治疗急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭的作用，解决当前防治肝衰竭药物不足问题。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
8.本发明提供一种异叶茴芹提取物在制备预防或治疗肝衰竭药物中的应用。
9.所述异叶茴芹提取物为异叶茴芹根通过水蒸气蒸馏、或萃取剂萃取获得的挥发油。所述萃取剂可以是乙醚、石油醚、二氯甲烷、氯仿等常用试剂中的一种或几种混合物。
10.所述药物为提高肝组织谷胱甘肽(gsh)、过氧化氢酶(cat)和总超氧化物歧化酶(sod)水平的药物，或者所述药物为抑制肝细胞凋亡，有效降低血清中谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)的药物。
11.所述药物为预防或治疗急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭的药物。
12.所述异叶茴芹提取物富含异胡萝卜烯、4-甲氧基-2-(3-甲基环氧乙烷基)-苯基异丁酸酯、2-甲基-4-甲氧基-2-(3-甲基-2-环氧乙烷基)苯基丁酸酯和青枝烯及其异构体，是将异叶茴芹根打粉，过筛，加入水和萃取剂提取异叶茴芹根挥发油(优选采用同时回流萃取装置提取)。具体按如下方法制备：将异叶茴芹根洗净，烘干，打粉，过30-80 目(优选40目)筛；称取粉末，加蒸馏水，以水不互溶的低沸点有机溶剂为萃取剂，用同时回流萃取装置回流提取(优选4h)；提取结束后分离有机相，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，过滤，滤液35℃减压除去有机溶剂，得淡黄色挥发油，即为异叶茴芹提取物；所述蒸馏水体积用量以粉末重量计为5-15ml/g，优选10ml/g；所述萃取剂可以是乙醚、石油醚、氯仿、二氯甲烷中的一种，优选为二氯甲烷；所述萃取剂体积用量以粉末重量计为0.1-0.5ml/g，优选0.25ml/g；所述烘干优选60℃。
13.优选的，所述药物还包括其他防治急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭的药物，以异叶茴芹根挥发油与其他防治急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭的药物共同作为活性成分。
14.所述药物还包括药学上可接受的各种制剂类型，包括但不限于滴丸、注射剂、胶囊片剂、颗粒剂、乳剂、贴剂、膏剂、丸剂等。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种异叶茴芹提取物在制备预防或治疗急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭药物中的应用。动物实验研究表明，该挥发油可有效改善lps/d-glan诱导的肝组织水肿、瘀血，有效降低血清谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)水平，同时显著提高肝脏组织谷胱甘肽(gsh)、总超氧化物歧化酶(sod)和过氧化氢酶(cat)水平；并显著降低肝脏脂质过氧化产物丙二醛(mda)浓度。肝组织切片he染色和凋亡染色结果表明，该挥发油可极显著改善肝细胞皱缩、间隙变大、红细胞外溢等现象，显著减少肝细胞凋亡，从而防止肝脏衰竭，并拮抗lps/d-glan诱导的c57bl/6小鼠死亡。更为关键的是，本发明公开的异叶茴芹挥发油在150mg/kg给药剂量时，保肝活性显著优于临床用药n-乙酰半胱氨酸(300mg/kg)，表现出良好的急性肝衰竭防治作用。
16.本发明公开的异叶茴芹根挥发油对lps/d-glan诱导的急性肝衰竭具有极佳的保护作用，在临床上急性肝衰竭或慢加急肝衰竭的防治方面具有广阔应用前景，开辟了畲药异叶茴芹新的功效用途。
(四)附图说明
17.图1异叶茴芹根提取物对原代肝细胞损伤保护作用；与对照组比较，
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p《0.01；与模型组比较，
**
p《0.01。
18.图2异叶茴芹根挥发油gc-ms总离子流图。
19.图3挥发油对肝脏指数和血清alt、ast影响；与对照组比较，
##
p《0.01；与模型组比较，
**
p《0.01；a代表肝脏指数；b代表血清alt；c代表血清ast。
20.图4挥发油对肝脏抗氧化指标影响；与对照组比较，
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p《0.05，
##
p《0.01；与模型组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；a代表脂质过氧化产物mda水平；b代表gsh水平； c代表sod水平；d代表cat水平。
21.图5肝组织切片he染色结果；注：a-e分别为对照组、模型组、阳性药物组、 pdreo低剂量和pdreo高剂量组。
22.图6肝组织切片tunel染色结果。
23.图7异叶茴芹根挥发油对小鼠存活率影响图。
(五)具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
25.本发明实施例所用雄性c57bl/6小鼠，体重19-21g，购自浙江省医学科学院实验动物中心。
26.药物及试剂：新鲜异叶茴芹，采自福建宁德，经鉴定为伞形科异叶茴芹(pimpinelladiversifolia dc.)；脂多糖(lps，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，批号： 0000135218)，d-半乳糖胺盐酸盐(d-glan，上海麦克林生化科技有限公司，批号： c13215177)；丙二醛(mda)、总超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、谷胱甘肽(gsh)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；pbs buffer(莫纳生物科技有限公司，批号：gp200809)；一步法tunel原位细胞凋亡检测试剂盒(elabscience公司，批号：5hnhlc9s4p)； n-乙酰半胱氨酸(碧云天，批号：030619190321)；吐温-80(无锡市亚泰联合化工有限公司，批号：2020-01-01)；其它试剂均为分析纯。
27.仪器：agilent 7250gc-q/tof ms色谱分析系统(安捷伦科技公司，美国)；生物组织石蜡包埋机(赛默飞世尔科技公司)；magna lyser全自动组织匀浆机(德国 roche)；多功能酶标仪(perkin elmer公司)；lightcycler 480ii荧光定量pcr仪 (rohce公司)；轮转式切片机(lecia公司)；正置显微镜(motic公司)。
28.实施例1、异叶茴芹根提取物对体外原代肝细胞损伤保护作用
29.1、提取物制备：异叶茴芹根洗净，60℃烘干，打粉，过40目筛，获得粉末。
30.挥发油(pdreo)：称取粉末200g，加2l蒸馏水，以50ml二氯甲烷为萃取剂，用同时回流萃取装置回流提取4h；提取结束后，取二氯甲烷相用无水硫酸镁干燥过夜，过滤，滤液35℃减压除去有机溶剂，得淡黄色挥发油(pdreo)381.82mg。
31.水提物(pdrwe)：称取粉末100g，用10倍量的水回流提取2次，每次1h，合并两次滤液，减压浓缩，低温冷冻真空干燥得水提物(pdrwe)11.38g。
32.醇提物(pdree)：称取粉末100g，用10倍量的体积浓度60％乙醇水溶液回流提取2次，每次1h，合并两次滤液，减压浓缩，低温冷冻真空干燥得醇提物(pdree) 8.67g。
33.2、提取物对原代肝细胞损伤保护作用：取c57bl/6小鼠原代肝细胞和raw264.7 小鼠巨噬细胞，分别用dmem培养基(gibco公司，含10％胎牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)稀释，以肝细胞2万个每孔，巨噬细胞8千个每孔混合接种96 孔板，贴壁共培养过夜
后，弃培养液，孔板分成对照组、模型组和提取物组。对照组和模型组添加新的dmem培养基150μl，提取物组分别加入含不同浓度的提取物 (pdreo加入浓度2.5、5、10μg/ml、pdrwe加入浓度50、100、150μg/ml，pdree 加入浓度30、60、90μg/ml)的dmem培养基150μl，分别在37℃预处理1h，然后模型组和提取物组分别加入50μl含有lps和d-glan的dmem培养基，使得lps 和d-glan的终浓度分别为1μg/ml和5mg/ml，刺激培养24h，3000rpm离心5min，收集上清，采用试剂盒测定alt水平，分析药物保肝活性。
34.3、结果：从图1结果可以看出，异叶茴芹根各提取物随处理剂量增加，alt水平均呈现一定下降趋势，但与模型组比较，异叶茴芹根水提物在50-150μg/ml剂量范围内未能有效降低alt水平；异叶茴芹根60％醇提物仅高剂量90μg/ml处理组 alt水平下降具有显著性差异，但alt水平仍然高达(129.70
±
16.46)u/l；异叶茴芹挥发油处理中、高剂量组则表现出显著的保肝活性，高剂量10μg/ml处理时alt 水平与对照组比较几乎无显著性差异；因此有必要对其挥发油体内保肝活性作进一步系统评价。
35.实施例2、异叶茴芹根挥发油(pdreo)表征及鉴定
36.(1)挥发油表征：取实施例1方法制备的挥发油(pdreo)通过气质联用色谱进行分析。
37.色谱条件：agilent 7250gc-q/tof ms色谱分析系统，hp-5ms毛细管柱(30 m
×
0.25mm
×
0.25μm，安捷伦公司，美国)。程序升温过程：起始温度为50℃，维持3min，以5℃/min升温至280℃，维持5min。载气：氦气，纯度99.999％，流速 1.0ml/min。进样口温度：250℃。进样量：1μl。分流比：10:1。
38.质谱条件：ei源电压：70ev；离子源温度：250℃；gc-ms接口温度：280℃；四级杆温度：150℃；数据扫描方式：tof-scan全扫描，一级质谱质量扫描范围m/z 40～ 450，采集速率5spectrum/s；溶剂延迟：3.5min。
39.(2)成分鉴定：按照上述色谱条件对c
7-c
40
正构烷烃混合对照品进行gc-ms 分析，记录各正构烷烃保留时间，采用保留指数的线性升温公式：ri＝100n+100(t
x
‑ꢀ
tn)/(t
n+1-tn)计算各挥发性组分的保留指数(ri)。其中，ri为被分析组分的保留指数， t
x
为被分析组分流出峰的保留时间(min)，tn为碳原子数为n的正构烷烃流出峰的保留时间(min)，t
n+1
为碳原子数为n+1的正构烷烃流出峰的保留时间(min)，且 tn＜t
x
＜t
n+1
。通过与nist 14数据库和相关文献比对分析鉴定挥发油各成分。
40.(3)结果：通过gc-ms分析，采用保留指数ri和质谱标准谱库检索相结合的双重定性的方法，从异叶茴芹根挥发油中共鉴定出27种主要成分(见图2和表1)，占挥发性成分总量的95.74％，其中萜类成分占45.87％，芳香族成分为32.57％，脂肪族为17.30％。其中化合物异胡萝卜烯、4-甲氧基-2-(3-甲基环氧乙烷基)-苯基异丁酸酯和2-甲基-4-甲氧基-2-(3-甲基-2-环氧乙烷基)苯基丁酸酯含量较高，分别达29.97％、 19.53％和6.88％；此外，脂肪族类化合物青枝烯及其同分异构体含量也较高，占挥发油总量的15.31％。
41.表1异叶茴芹根挥发油组成和含量
[0042][0043]
实施例3、异叶茴芹根挥发油(pdreo)对lps/d-glan诱导的c57bl/6小鼠急性肝衰竭保护作用
[0044]
(1)小鼠分组给药：c57bl/6雄性小鼠40只，随机分成5组，每组8只。空白对照(control)和模型组(model)，分别腹腔注射含体积浓度1％吐温80的pbs 溶液；阳性药物组(nac)腹腔注射300mg/kg n-乙酰半胱氨酸(nac)；pdreo 低剂量组腹腔注射50mg/kg挥发油；pdreo高剂量组腹腔注射150mg/kg挥发油；上述各药物均用含体积浓度1％吐温80的pbs溶液配制，连续给药3d，每天给药1 次，并于末次给药1h后腹腔注射lps(40μg/kg，溶剂为pbs)和d-glan(500 mg/kg，溶剂为pbs)进行造模，造模6h后麻醉小鼠，腹主动脉取血，凝固后3500rpm离心10min，取血清-80℃冷冻保存；解剖取肝脏，称重，部分组织用4％甲醛固定，其余组织液氮速冻，-80℃冷冻保存。
[0045]
(2)血清中alt、ast含量测定：按照alt、ast试剂盒说明书操作，测定各组小鼠血清中alt和ast水平。
[0046]
(3)肝组织生化指标测定：称取各组肝组织样本，以体积比1:9比例加入4℃预冷的pbs溶液，于magna lyser全自动组织匀浆机中匀浆处理，6000rpm，30s，匀浆液2500rpm离心
10min，取上清；按照mda、cat、gsh和总sod试剂盒说明书操作，测定肝组织中各生化指标。
[0047]
(4)肝组织he染色：肝组织固定后脱水、透明、浸蜡、包埋等常规石蜡切片，作he染色，拍照对比观察分析肝脏损伤情况。
[0048]
(5)肝组织凋亡tunel染色：按照试剂盒说明书操作，采用elabscience公司一步法tunel原位细胞凋亡检测试剂盒对各肝组织切片作凋亡染色，最后滴加含有 dapi核染料的封片剂封片，荧光显微镜拍照记录分析。
[0049]
(6)结果：lps联合d-glan处理可短时间内导致严重炎症反应，肝细胞大量凋亡、坏死，表现为肝组织水肿，肝脏重量增加。从图3结果看，模型组肝指数达到 (53.713
±
3.642)mg/g体重，显著高于正常对照组(36.251
±
1.286)mg/g体重；阳性药物nac和pdreo低、高剂量组均可显著降低肝指数(见图3中a)，对肝组织肿大表现出较好的改善作用。血清中alt和ast水平显著升高，也反映模型组肝组织损伤严重，同样，各给药组均能有效降低alt和ast水平，尤其pdreo高剂量组alt显著低于阳性药物nac组，且与正常组无显著性差异(见图3中b)，但 ast水平仍然显著高于正常对照组(见图3中c)；总体上，从肝指数、alt和ast 水平看，pdreo低、高剂量组对lps/d-glan诱导的急性肝衰竭表现出较好的保护作用。
[0050]
研究表明，lps/d-glan可导致肝脏gsh耗竭，抗氧化系统失衡，从而导致肝细胞凋亡、坏死。因此对肝组织抗氧化酶系和mda水平进行了测定。模型组肝组织脂质过氧化产物mda水平显著升高(见图4中a)，表明肝组织处于氧化应激损伤状态；与其对应，gsh水平和sod水平显著下降，尤其前者与对照组比较几乎完全耗竭(见图4中b、c)。与模型组相比，nac，挥发油低、高剂量组均能显著上调gsh、 sod和cat水平(图4中d)，尤其挥发油低、高剂量组肝组织mda水平显著低于阳性药物nac处理组，且几乎与正常对照组相当，表现出显著的氧化应激调控作用。
[0051]
切片he染色可直接反应肝组织病变情况，从图5结果可以看出，正常组肝细胞结构清晰，红细胞主要在血管内，肝细胞间隙未见红细胞聚集(见图5中a)；模型组肝细胞间隙增大，其中充斥着大量红细胞，肝组织病变严重(见图5中b)；阳性药物组相比模型组有所改善，但仍然明显可见肝细胞间隙红细胞聚集(见图5中c)；挥发油低(见图5中d)、高剂量组(见图5中e)肝细胞结构与正常组比无显著形态差异，相对而言挥发油低剂量组肝细胞间隙稍有扩大，偶见个别红细胞分布；总体上看，肝组织切片he染色结果与血清和肝组织生化指标相对应，即异叶茴芹挥发油对lps/d-glan诱导的肝损伤具有较好保护作用。
[0052]
lps/d-glan处理可导致肝细胞大量凋亡，引发急性肝衰竭。tunel染色结果确证，模型组肝细胞凋亡率达到(35.979
±
2.928)％(fitc和dapi叠加后青色荧光细胞比例显著增加)(见图6)；同样，各药物处理组均能显著降低肝细胞凋亡率，尤其挥发油高剂量组凋亡率(0.019
±
0.036)％甚至低于正常组(0.114
±
0.0.114)％，表现出极强的保肝活性。
[0053]
实施例4、异叶茴芹根挥发油(pdreo)对lps/d-glan诱导的c57bl/6小鼠48 h内存活率影响
[0054]
(1)小鼠分组给药：c57bl/6雄性小鼠40只，随机分成5组，每组8只。空白对照(control)和模型组(model)，分别腹腔注射1％吐温80pbs溶液；阳性药物组腹腔注射nac 300mg/kg；pdreo低剂量组腹腔注射50mg/kg挥发油；pdreo 高剂量组腹腔注射150mg/kg挥发油。上述各药物均用含体积浓度1％吐温80的pbs 溶液配制，连续给药3d，每天给药1次，并于末次给药1h后腹腔注射lps(40μg/kg，溶剂为pbs)和d-glan(500mg/kg，溶剂为pbs)，造
模后观察统计小鼠存活率。
[0055]
(2)结果：结果见图7所示，模型组造模后8h开始陆续死亡，10h时左右所有小鼠死亡；阳性药物和挥发油低剂量组14h左右死亡率分别为20％和10％，但之后未见小鼠死亡；而挥发油高剂量组小鼠均未发生小鼠死亡；这一结果进一步证实，异叶茴芹根挥发油对lps/d-glan诱导的小鼠肝衰竭具有显著拮抗作用，极具开发应用潜力。