一种含当归、白术、蚕丝的祛斑抗氧化改性组合物及其化妆品方面的应用的制作方法

1.本发明属于美妆领域，具体涉及一种护肤品，特别是一种含当归、蚕丝的祛斑抗氧化改性组合物及其化妆品方面的应用。


背景技术：

2.色斑是黑色素在人的皮肤沉积形成的斑点，包括雀斑、黑斑、黄褐斑、日晒斑、辐射斑和老年斑等，属色素障碍性皮肤病。色斑是各种因素共同作用导致的，长时间日晒，体内激素水平失调，压力过大，使用劣质化妆品造等原因均会导致黑色素母细胞中的酪氨酸酶通路激活，造成黑色素过度合成。
3.当归性甘、辛，温。归肝、心、脾经。有补血活血，调经止痛，润肠通便之功效。《本草纲目》记载，当归治头痛，心腹诸痛，润肠胃筋骨皮肤，治痈疽，排脓止痛，和血补血。当归中含有大量的藁本内酯、阿魏酸以及绿原酸等有机成分，藁本内酯具有松弛平滑肌，抑菌，提高机体免疫调剂功能等；阿魏酸具有抗辐射、抗氧化、抗病毒、抗菌等性能。白术中含有仓术酮、甘露聚糖am-3、石竹烯等活性成分。白术中的活性成分使它具有一定的抗氧化抗衰老、增强机体免疫等功能。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的目的是制备一种化妆品，具有祛斑、抗氧化、活化血管等特点。为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
5.第一方面，本发明提供了一种祛斑抗氧化改性组合物，其包含：当归、白术和蚕丝蛋白。
6.第二方面，本发明提供了一种当归、白术改性丝素蛋白的纳米微球的制备方法，其步骤包括：
7.s1、制备当归提取物：称取当归粉末30-50g，加入甲醇20-30ml，称定重量超声处理20-50min，用甲醇补足重量，摇匀后过滤，取滤液，干燥后获得当归提取物。
8.s2、白术粉的制备：取10-50g白术，分别加入10倍量水，在100℃下提取2次，第1次3h，第2次2h，合并滤液，减压浓缩，真空干燥、粉碎，得到白术粉。
9.s3、脱胶丝的制备：将0.5g的na2co3溶解在1l超纯水中，加入5g的蚕丝，在100℃下不停搅拌，30min后取出蚕丝用60℃超纯水洗涤以去除丝胶蛋白和残留离子，重复上述操作三次，脱胶结束后，将蚕丝团拉松，在45℃-60℃的烘箱中烘干，获得脱胶丝。
10.s4、丝素蛋白：称取脱胶丝放入离心管中，加入溴化锂溶液，剧烈摇晃1min后将溶液放入60℃水浴加热30min，得到透明粘稠状的丝素蛋白溶液，将得到的丝素蛋白溶液在离心机中离心1min，冷冻经过透析冷冻干燥。
11.s5、将1-5ml溶解在乙醇中的当归提取物、白术粉溶液添加到丝素蛋白溶液中，并在一定温度下孵育24-36h，将混合物离心，进一步干燥处理得到当归改性的丝素蛋白纳米
微球。
12.本发明研究团队发现，将白术、当归提取物与丝素蛋白自组装制备成纳米微球，可以使白术和当归提取物的有效成分得以保存，使得药效发挥的更持久。其次纳米微球可以更好的被皮肤吸收，吸收后，纳米微球内的白术和当归得以更好的进入皮肤内部，更好的发挥作用。将白术和当归提取物制备成纳米微球后，抗氧化能力和祛斑能力都得到显著提升，但是白术和当归水提取物的抗氧化性能和祛斑性能远不如纳米微球的效果。
13.本发明研究团队还发现，制备的纳米微球还具有一定的活化毛细血管的作用，使得血管内的瘀阻得到有效的去除。研究团队通过大量的实验证明，将白术和当归与丝素蛋白制成纳米微球后，可能他们的化学成分发生一定的变化，使得其具有了一定的活血化瘀的效果。
14.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
15.1、本发明中的纳米微球无激素，无色素，无合成香料，无防腐剂等有害的化学添加剂。
16.2、本发明中的当归、白术具有抑制络氨酸酶的作用，达到淡化斑痕，祛斑的效果。
17.3、本发明中的改性组合物将当归、白术包裹在丝素蛋白纳米微球内，可达到协同作用，该纳米微球具有的抗氧化、祛斑性能高于单一组分的当归或白术，对皮肤具有良好的修复效果。
18.4、本发明操作简单，生产的成本较低，有利于批量生产。
19.5、本发明制备的纳米微球还具有一定的活化毛细血管、化瘀的作用。
附图说明
20.图1为本发明制备的实施例1纳米微球扫描图。
21.图2为本发明制备的实施例3纳米微球扫描图。
22.图3为本发明制备的实施例1-5和对比例1-3纳米微球的dpph清除率柱状图。
23.图4为本发明制备的实施例1-5和对比例1-3纳米微球的abts清除率柱状图。
24.图5为本发明制备的实施例1-5和对比例1-3的细胞存活率柱状图。
25.图6为本发明制备的实施例1-5和对比例1-3的黑色素含量检测柱状图。
具体实施方式
26.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
27.搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备
28.一、材料与方法
29.1.搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备
30.一个具体的实施例1的搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备过程如下：
31.s1、制备当归提取物：称取当归粉末30g，加入甲醇20ml，称定重量超声处理20min，
用甲醇补足重量，摇匀后过滤，取滤液，干燥后获得当归提取物。
32.s2、白术粉的制备：取10g白术，分别加入10倍量水，在100℃下提取2次，第1次3h，第2次2h，合并滤液，减压浓缩，真空干燥、粉碎，得到白术粉。
33.s3、脱胶丝的制备：将5g的na2co3溶解在1l超纯水中，加入7g的蚕丝，在100℃下不停搅拌，30min后取出蚕丝用60℃超纯水洗涤以去除丝胶蛋白和残留离子，重复上述操作三次，脱胶结束后，将蚕丝团拉松，在45℃℃的烘箱中烘干，获得脱胶丝。
34.s4、丝素蛋白：称取脱胶丝放入离心管中，加入9.3mol/l溴化锂溶液，剧烈摇晃1min后将溶液放入60℃水浴加热30min，得到透明粘稠状的丝素蛋白溶液，将得到的丝素蛋白溶液在离心机中离心1min，冷冻经过透析冷冻干燥。
35.s5、乙醇以1∶4的体积比快速注入到3％的丝素蛋白溶液中，采用超声细胞破碎仪在低功率下超声处理2min后，室温下自组装10min，将溶液放置于-20℃下彻底冷冻24h后取出，在室温下使其缓慢融化为乳白色溶液，将乳液在4℃下以9000r/min离心10min后冷冻干燥，备用。将1ml溶解在乙醇中的当归提取物(1mg/ml)、白术粉(1mg/ml)溶液添加到25mg丝素蛋白溶液中，并在30℃、160r/min下孵育24h，将混合物离心，进一步干燥处理得到当归改性的丝素蛋白纳米微球。
36.一个具体的实施例2的搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤s5中当归提取物浓度为3mg/ml、白术粉浓度为1mg/ml。
37.一个具体的实施例3的搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤s5中当归提取物浓度为1mg/ml、白术粉浓度为3mg/ml。
38.一个具体的实施例4的搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤s5中当归提取物浓度为3mg/ml、白术粉浓度为3mg/ml。
39.一个具体的实施例5的搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤s5中当归提取物浓度为5mg/ml、白术粉浓度为5mg/ml。
40.一个具体的对比例1的搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤s5中不加入当归提取物和白术粉。
41.一个具体的对比例2的搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤s5中只加入当归，不加入白术粉。
42.一个具体的对比例3的搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备过程大致与实施例1相同，不同之处仅在于其步骤s5中只加入白术粉，不加入当归。
43.一个具体的实施例6的搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备过程如下：
44.s1、制备当归提取物：称取当归粉末50g，加入甲醇20ml，称定重量超声处理20min，用甲醇补足重量，摇匀后过滤，取滤液，干燥后获得当归提取物。
45.s2、白术粉的制备：取30g白术，分别加入10倍量水，在100℃下提取2次，第1次3h，第2次2h，合并滤液，减压浓缩，真空干燥、粉碎，得到白术粉。
46.s3、脱胶丝的制备：将3g的na2co3溶解在1l超纯水中，加入6g的蚕丝，在100℃下不停搅拌，30min后取出蚕丝用60℃超纯水洗涤以去除丝胶蛋白和残留离子，重复上述操作三次，脱胶结束后，将蚕丝团拉松，在45℃℃的烘箱中烘干，获得脱胶丝。
47.s4、丝素蛋白：称取脱胶丝放入离心管中，加入9.3mol/l溴化锂溶液，剧烈摇晃1min后将溶液放入60℃水浴加热30min，得到透明粘稠状的丝素蛋白溶液，将得到的丝素蛋
白溶液在离心机中离心1min，冷冻经过透析冷冻干燥。
48.s5、乙醇以1∶4的体积比快速注入到3％的丝素蛋白溶液中，采用超声细胞破碎仪在低功率下超声处理2min后，室温下自组装10min，将溶液放置于-20℃下彻底冷冻24h后取出，在室温下使其缓慢融化为乳白色溶液，将乳液在4℃下以9000r/min离心10min后冷冻干燥，备用。将1ml溶解在乙醇中的当归提取物(1mg/ml)、白术粉(1mg/ml)溶液添加到25mg丝素蛋白溶液中，并在30℃、160r/min下孵育24h，将混合物离心，进一步干燥处理得到当归改性的丝素蛋白纳米微球。
49.一个具体的对比例4的搭载当归、白术丝素蛋白纳米微球的制备过程大致与实施例6相同，不同之处仅在于：s1、制备当归提取物：在30g当归粉中加入50ml水进行提取，首次提取2h，第二次提取1h，将混合液提取、过滤、浓缩，将其进行干燥脱水的到当归提取物。
50.2.抗氧化性能测定
51.(1)dpph自由基清除能力测定
52.通过对dpph自由基清除性能与提取液浓度之间绘制的剂量效应曲线进行线性回归分析，结果以ic50表示。ic50是指dpph自由基浓度减少50％所需要的提取物的质量浓度值(mg/ml)，ic50值越低，自由基清除活性越高。
53.将6ml的dpph甲醇溶液吸光度(1
±
0.02)与实验例1-5、对比例1-3样品进行混合。将反应混合物在室温下摇匀，避光静置20min，在517nm波长处测定吸光度值的变化。以甲醇代替提取物样品溶液作为空白对照样品对dpph自由基的清除性能按公式计算:
54.dpph自由基的清除能力/％＝(a
对照组-a
样品组
)/a
对照组
×
100
55.(2)abts自由基清除能力测定
56.将abts溶解于20mmol/l、ph4.5的醋酸缓冲溶液中得到7mmol/l的abts阳离子自由基贮液，与过硫酸钾溶液(混合体系中终浓度为2.45mmol/l)混合，在室温下避光反应16h,使溶液达到稳定的氧化态。测定前用20mmol/l、ph4.5的醋酸缓冲溶液按照适当的比例(体积比1:75)稀释abts自由基贮液，使溶液在734nm波长下的吸光值达到(0.7
±
0.02)，以此得到abts阳离子自由基工作液。测定时反应系包括3ml的abts阳离子自由基工作液和实验例1-5和对比例1-3样品混合。室温避光静置10min后在734nm波长下测吸光值，以甲醇代替提取物样品溶液作为空白对照，样品对abts阳离子自由基的清除性能按公式计算:
57.abts自由基的清除能力％＝(a
对照组-a
样品组
)/a
对照组
×
100
58.通过对abts阳离子自由基清除性能与提取液浓度之间绘制的剂量效应曲线进行线性回归分析,结果以ic50表示。
59.3.酪氨酸酶抑制活性检测
60.在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶多用于多巴，形成多巴醌，多巴醌经过一系列自发反应后形成黑色素。
61.按表1所示，配制反应液，精密移取测试样分别加入96孔板中，混合均匀，37℃孵育10min后，迅速加入100μl-多巴溶液，混合均匀。以磷酸盐缓冲盐溶液pbs为对照，连续30min检测溶液在475nm处od值，得到ac1、ac2、at1和at2，平行测定3次。按以公式计算样品抑制酪氨酸酶的活性：
62.酪氨酸酶活性抑制率＝[1-(a
t1-a
t2
)/(a
c1-a
c2
)]
×
100％
[0063]
表1
[0064][0065]
二、结果
[0066]
表2
[0067][0068][0069]
从表2可知实施例1-5的dpph自由基清除率、abts自由基清除率、酪氨酸酶抑制率等均明显低于对比例1-3，说明实施例1-5的抗氧化性能要高于对比例。此外随着当归和白术含量的增加，样品的dpph自由基抑制率、abts自由基清除率、酪氨酸酶抑制率均呈现下降的趋势，说明随着白术和当归含量的增加，样品的抗氧化性能有所提高。并且同时加入白术和当归的实施例要高于之加入单一含量的对比例，说明白术和当归的共同加入具有协同作用，使抗氧化性能明显提高。
[0070]
图1、图2为本发明实施例1和实施例3制备的纳米微球的扫描图，从图中可以看出，纳米微球的直径在300-500nm之间，纳米微球的大小基本一致，且能保持较高的稳定性。
[0071]
图3、图4发明制备的纳米微球的dpph清除率柱状图、abts清除率柱状图。从图中可以明显看出实施例1-5有优异的抗氧化性能。
[0072]
表3
[0073] 阿魏酸提取率(％)藁本内酯提取率(％)实施例6547.8
±
5.6250.9
±
7.2对比例4427.5
±
4.8247.7
±
6.3
[0074]
当归中的有效成分挥发性较强，主要是丁烯基苯酞、藁本内酯等苯酞类化合物，提取过程会导致：(1)提取物的药物浓度无法维持恒定。(2)阿魏酸在溶液中的稳定性极差，且在中性溶剂下见光时分解速度会更快。(3)由于阿魏酸在水中的溶解度较小，稳定性较差，在高温环境下会对其造成严重的破坏。从表3可知，使用甲醇渗滤法提取的当归提取物中的阿魏酸及藁本内酯含量明显高于普通水提法中的含量。说明本技术中用到的提取方法要好于传统的水提法。
[0075]
细胞实验
[0076]
一、材料与方法
[0077]
1.材料
[0078]
b16-f10细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)；南dmem培养基(美国gibco公司)；0.25％胰蛋白酶－edta(美国gibco公司)；二甲基亚砜(dmso，美国sigma公司)；pbs缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)；噻唑蓝试剂盒(mtt，江苏凯基公司)。
[0079]
2.黑色素抑制实验
[0080]
采用naoh裂解法测定细胞内的黑色素含量。将处于对数生长期的b16细胞消化，接种于6孔板中，浓度为2
×
105个/孔，并置于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。待细胞完全贴壁后用药，并继续培养72h。弃去上清液，pbs洗涤2次，使用细胞刮收集细胞后每孔加入细胞裂解液200μl。于4℃充分裂解40min后，12000rpm离心20min。转移上清至ep管测定蛋白浓度。沉淀物中加入190μl 1mol/l的naoh(含10％dmso)裂解液，并于80℃水浴1h充分溶解后，在405nm处测定吸光值，最终的黑色素含量使用相对蛋白浓度归一化处理。计算公式为：
[0081]
黑色素相对含量＝(od
405样品
/蛋白浓度)/(od
405空白
/蛋白浓度)
×
100％
[0082]
每个样品重复3次进行测定。
[0083]
3.细胞毒性检测
[0084]
收集对数生长期细胞，铺板使待测细胞密度至5000个/孔，于37℃、5％co2下培养，细胞生长至105个/ml的细胞悬液，换液加入含有0.1mg/ml供试品溶液的dmem完全培养基，以加入相同体积的dmem完全培养基为对照组。继续培养24h，每孔加入20μl 0.5％mtt溶液(5g/l)，培养4h后弃去培养液，用pbs冲洗2-3遍后，每孔加入150μl二甲基亚飒，于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。于490nm处测量各孔的吸光度。
[0085]
细胞存活率＝(测定孔吸光度－空白对照组吸光度)/(对照组吸光度－空白对照组吸光度)
×
100％。
[0086]
4.活血化瘀效果检测
[0087]
(1)急性血瘀大鼠模型建立
[0088]
除空白组外，其余实验组在大鼠皮下注射盐酸肾上腺素注射液0.8mg
·
kg-1
，共次，每次间隔4h，造成大鼠急性血瘀模型。
[0089]
(2)分组、给药、取样
[0090]
将大鼠分为空白组、模型组、阳性对照组、实验组，空白组与模型组给予0.9％nacl20ml
·
kg-1
，阳性对照组给予复方丹参滴丸73mg
·
kg-1
·
d-1
，各中药给药组给予实施例
1和对比例1-4样品10.8g
·
kg-1
·
d-1
，均灌胃给药，每天1次，连续给药9d。第7天灌胃后，制备急性血瘀证模型。造模后，第8天正常灌胃；第9天给药30min后，腹主动脉采血2ml，加入有柠檬酸二钠的抗凝管中，用于测定凝血4项等指标。
[0091]
二、结果
[0092]
表4
[0093][0094]
表中pt为凝血酶原时间；aptt为活化部分凝血活酶时间；fib为纤维蛋白原。
[0095]
从表4中可以看出，实施例1大鼠的pt、aptt和fib，与空白组相比显著降低，说明实施例1有一定的活血化瘀的作用。从实施例1和对比例1-3的比较可以看出，单一组分的当归或白术活血化瘀的作用效果甚微，而实施例1的效果显著，说明白术的加入使得当归的活血化瘀的作用显著加强，原因可能是，白术的加入，使当归的部分活性组分和白术的活性组分相结合，产生了活血化瘀效果显著的成分。
[0096]
图5为实施例1-5、对比例1-3以及空白对照的细胞内黑色素含量图。由图可知，实施例1-5中细胞的黑色素含量低于对比例1-3，说明实施例1-5样品对黑色素的生成具有一定的抑制作用。随着当归和白术含量的增加，细胞内黑色素的含量液逐步减少，但当归和白术的组合物的效果要好于单一组分。
[0097]
从表4和图5中可以看出，单一组分的活血化瘀效果和对黑色素的抑制率都没有纳米微球的效果显著，这说明在纳米微球内发生了预期不到的变化，可能是白术中的活性成分在纳米微球内与当归以及丝素蛋白发生了反应，使得其对黑色素的抑制率大大提升，此外还产生了一种成分，使得纳米微球产生了活血化瘀的效果。
[0098]
图6为体外细胞实验实施例1-5和对比例1-3、空白对照的细胞存活率图。从图中可以看出，实施例1-5中的细胞存活率要高于空白对照组、对比例1-3，这说明实施例中的样品对细胞来说是无毒的。
[0099]
综上，本发明制备的祛斑、抗氧化组合物以当归提取物和白术提取物作为原料，包裹在丝素蛋白制备的纳米微球内，使得当归提取物和白术提取物更好的被人体吸收。当归和白术的加入可以起到保护使用者预防辐射，抗氧化，祛斑等效果，同时两者的混合使得阿魏酸发挥更大的作用，起到活血化瘀、舒缓血管的作用。该方法为祛斑、抗氧化化妆品提供了新的思路，也为祛斑抗氧化组合物的制备提供了一种新的方法。
[0100]
最后应说明的是：以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。