一种交联纳米治疗剂及其制备方法与应用

1.本发明涉及医用纳米材料领域，尤其涉及一种交联纳米治疗剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.纳米平台是一个集成了各种功能组件的系统，包括纳米载体和负载的功能分子。根据纳米载体的组成成分，纳米平台可分为多种类型，可包括无机载体和有机载体。其中，无机载体包括金银等贵金属纳米粒子、介孔二氧化硅、磁性纳米粒和碳等；有机载体包括有机金属框架、聚合物和脂质体等。但是，无机载体具有难降解，代谢负担大，生物安全性较差等缺点，限制了其在临床中的应用。基于有机材料的纳米平台由于良好的生物安全性和生物可降解性，具有更为广泛的临床应用前景，许多药物输送系统已被批准用于临床治疗，如盐酸阿霉素脂质体(doxil)，并且更多的纳米药物输送系统正处于临床试验阶段。但是，这些纳米载体的载药量有限，生物利用度仍然较低，限制了纳米平台在临床上更加深入的应用。
3.蛋白质作为人体的重要组成部分，由20种不同比例的氨基酸组成，具有不同的特性和功能。基于蛋白质的纳米平台是由天然或人工修饰的蛋白质组装而成，这些蛋白质可以通过相同的蛋白质亚基自组装，也可以通过不同蛋白质的组合和组装而自组装。由于蛋白质具有良好的生物相容性和生物降解性，因此基于蛋白质的纳米载体可以减少由载体本身引起的全身毒性。目前，许多蛋白质已成功应用于纳米药物的递送，主要包括铁蛋白、白蛋白、小热激蛋白和弹性蛋白等。此外，在过去十年中，功能性蛋白质在生物治疗技术中取得了巨大的进展。但是，对功能性蛋白质的靶向性以及活性的选择性控制一直是蛋白质疗法的重要难题。选择性地控制功能性蛋白质活性，使功能性蛋白质在运输过程中活性被抑制，而经过外源性刺激或内源性因素刺激之后恢复其活性，这种技术非常欠缺。因此，亟需设计制备出更有效的关于功能性蛋白质的可控递送策略。
4.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

5.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种交联纳米治疗剂及其制备方法与应用，旨在解决现有功能性蛋白质活性的选择性低、疗效差的问题。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明的第一方面，提供一种交联纳米治疗剂，其中，所述交联纳米治疗剂由包括活性氧(ros)响应型交联剂和功能性蛋白质的原料交联而成。
8.可选地，所述交联纳米治疗剂由ros响应型交联剂和功能性蛋白质交联而成。
9.可选地，所述ros响应型交联剂与功能性蛋白质的质量比为51:1～70:1。
10.可选地，所述ros响应型交联剂的结构式为：
[0011][0012]
可选地，所述功能性蛋白质选自葡萄糖氧化酶(gox)、乳酸氧化酶(lox)、过氧化氢酶(cat)、尿酸氧化酶(uo)、草酸氧化酶(oxo)、蛋白质激酶(pk)、透明质酸酶(haase)、半乳糖苷酶(gal)、白蛋白(alb)、铁蛋白(sf)、乳清蛋白(wpi)、胶原蛋白(col)、丝素蛋白(sf)、脂蛋白(lp)、凝血酶、重组蛋白中的一种或多种。
[0013]
可选地，所述交联纳米治疗剂为纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径为50～100nm。
[0014]
本发明的第二方面，提供一种本发明如上所述的交联纳米治疗剂的制备方法，其中，包括步骤：
[0015]
提供ros响应型交联剂和功能性蛋白质；
[0016]
将所述ros响应型交联剂和功能性蛋白质进行混合并搅拌，得到所述交联纳米治疗剂。
[0017]
可选地，所述将所述ros响应型交联剂和功能性蛋白质进行混合并搅拌的步骤具体包括：
[0018]
将所述ros响应型交联剂加入到二甲基亚砜中，得到溶液a；
[0019]
将所述功能性蛋白质加入到pbs缓冲液中，得到溶液b；
[0020]
将所述溶液b加入到所述溶液a中进行混合并搅拌。
[0021]
可选地，所述ros响应型交联剂的制备方法包括步骤：
[0022]
将巯基乙酸、丙酮、对甲基苯磺酸混合搅拌，反应后得到第一化合物；
[0023]
将所述第一化合物、硼氢化钠加入到四氢呋喃中，然后加入碘，反应后，加入氢氧化钠进行搅拌，得到第二化合物；
[0024]
将所述第二化合物、n,n'-羰基二咪唑加入到二氯甲烷中反应后，得到所述ros响应型交联剂。
[0025]
本发明的第三方面，提供一种本发明如上所述的交联纳米治疗剂在制备治疗肿瘤制剂中的应用，和/或，提供一种本发明如上所述的制备方法制备得到的交联纳米治疗剂在制备治疗肿瘤制剂中的应用。
[0026]
有益效果：本发明提供的交联纳米治疗剂在运输过程中，功能性蛋白质由于与ros响应型交联剂交联，功能性蛋白质活性被抑制，靶向至肿瘤部位后，由于ros响应型交联剂具有ros响应性，肿瘤微环境中的双氧水可裂解ros响应型交联剂，使得ros响应型交联剂断键，从而使组装的功能性蛋白质纳米粒解散，恢复功能性蛋白质的活性，实现交联纳米治疗剂活性的选择性控制。本发明提供的交联纳米治疗剂显著提高了功能性蛋白质的载药量和生物利用度，可选择性控制其功能性蛋白质活性，从而实现肿瘤靶向性和选择性，加大药物在肿瘤部位的蓄积量，提高疗效，降低毒副作用。
附图说明
[0027]
图1为本发明实施例1中ros响应型交联剂的合成路线。
[0028]
图2为本发明实施例1中制备得到的ros响应型交联剂的高分辨质谱图。
[0029]
图3为本发明实施例1中制备得到的ros响应型交联剂的核磁共振氢谱图。
[0030]
图4为本发明实施例2中制备得到的gox np的tem图。
[0031]
图5为本发明实施例4中双氧水对gox np的降解作用结果图。
[0032]
图6为本发明实施例5中gox np的酶二级结构评价结果图。
[0033]
图7为本发明实施例6中gox与gox np产生双氧水能力的对比图。
[0034]
图8为本发明实施例7中不同药物处理组的细胞存活率图，其中(a)为选用无糖培养基孵育，(b)为选用有糖培养基孵育。
[0035]
图9为本发明实施例8中细胞分别摄取gox与gox np的荧光共聚焦图。
具体实施方式
[0036]
本发明提供一种交联纳米治疗剂及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0037]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
[0038]
本发明实施例提供一种交联纳米治疗剂，其中，所述交联纳米治疗剂由包括ros响应型交联剂和功能性蛋白质的原料交联而成。
[0039]
本实施例中，所述交联纳米治疗剂在运输过程中，功能性蛋白质由于与ros响应型交联剂交联，功能性蛋白质活性被抑制，靶向至肿瘤部位后，由于ros响应型交联剂具有ros响应性，肿瘤微环境中的双氧水可裂解ros响应型交联剂，使得ros响应型交联剂断键，从而使组装的功能性蛋白质纳米粒解散，恢复功能性蛋白质的活性，实现交联纳米治疗剂活性的选择性控制。本实施例提供的交联纳米治疗剂显著提高了功能性蛋白质的载药量和生物利用度，可选择性控制其功能性蛋白质活性，从而实现肿瘤靶向性和选择性，加大药物在肿瘤部位的蓄积量，提高疗效，降低毒副作用。所述交联纳米治疗剂真正实现了高载药量、肿瘤靶向以及肿瘤微环境激活的蛋白质活性，在肿瘤治疗领域将具有良好的应用前景。
[0040]
在一种实施方式中，所述交联纳米治疗剂由ros响应型交联剂和功能性蛋白质交联而成。
[0041]
在一种实施方式中，所述ros响应型交联剂与功能性蛋白质的质量比为51:1～70:1。该比例可以更好地实现交联纳米治疗剂活性的选择性控制，使其在运输过程中功能性蛋白质活性被抑制，靶向至肿瘤部位后，功能性蛋白质被释放，功能性蛋白质的活性被恢复。
[0042]
在一种实施方式中，所述ros响应型交联剂的结构式为：
[0043][0044]
本实施方式中，交联纳米治疗剂由所述结构的ros响应型交联剂和功能性蛋白质交联而成。功能性蛋白质的氨基分别与所述结构的ros响应型交联剂两端的羰基咪唑反应，通过形成酯键，将任意功能性蛋白质连接在两端，形成交联纳米粒。所述结构的ros响应型交联剂含有具有ros响应的缩硫酮(tk)键，当交联纳米治疗剂靶向至肿瘤时，肿瘤微环境中的双氧水(作为一种ros)可使tk键断裂成巯基和丙酮。然后巯基端发生分子内环化，形成含
硫的环状物从酯键上脱落，从而释放出功能性蛋白质，恢复了功能性蛋白质的活性，实现交联纳米治疗剂活性的选择性控制。
[0045]
在一种实施方式中，所述功能性蛋白质选自gox、lox、cat、uo、oxo、pk、haase、gal、alb、sf、wpi、col、sf、lp、凝血酶、重组蛋白中的一种或多种，但不限于此。
[0046]
每种功能性蛋白的作用不同，以gox为例，gox具有葡萄糖特异性催化性质，可通过氧化葡萄糖产生葡萄糖酸和双氧水，从而消耗肿瘤的营养物质，达到饿死肿瘤的目的，因而可用于癌症的饥饿治疗。当所述交联纳米治疗剂由ros响应型交联剂和gox交联而成时，所述交联纳米治疗剂是一种用于癌症饥饿治疗的药物，其中，gox活性被抑制的交联纳米治疗剂靶向至肿瘤部位后，肿瘤微环境中的双氧水可使ros响应型交联剂断键(例如，tk键)，从而使gox纳米粒解散，恢复gox的活性。gox通过氧化肿瘤部位葡萄糖消耗肿瘤环境中的营养物质，达到饿死肿瘤的效果，可以实现癌症的饥饿治疗。
[0047]
在一种实施方式中，所述交联纳米治疗剂为纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径为50～100nm。在此粒径范围内，能够使交联纳米治疗剂更好地实现肿瘤的靶向蓄积以及肿瘤的饥饿治疗。进一步地，所述交联纳米治疗剂为球形纳米颗粒。
[0048]
本发明实施例还提供一种本发明实施例如上所述的交联纳米治疗剂的制备方法，其中，包括步骤：
[0049]
s1、提供ros响应型交联剂和功能性蛋白质；
[0050]
s2、将所述ros响应型交联剂和功能性蛋白质进行混合并搅拌，得到所述交联纳米治疗剂。
[0051]
本发明实施例提供的制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。所制备得到的交联纳米治疗剂显著提高了功能性蛋白质的载药量和生物利用度，可选择性控制其功能性蛋白质活性，从而实现肿瘤靶向性和选择性，加大药物在肿瘤部位的蓄积量，提高疗效，降低毒副作用。所述交联纳米治疗剂真正了实现高载药量、肿瘤靶向以及肿瘤微环境激活的蛋白质活性，在肿瘤治疗领域将具有良好的应用前景。
[0052]
步骤s1中，在一种实施方式中，如图1所示，所述ros响应型交联剂的制备方法包括步骤：
[0053]
s11、将巯基乙酸、丙酮、对甲基苯磺酸(tsoh)混合搅拌，反应后得到第一化合物；
[0054]
s12、将所述第一化合物、硼氢化钠加入到四氢呋喃中，然后加入碘，反应后，加入氢氧化钠进行搅拌，得到第二化合物；
[0055]
s13、将所述第二化合物、n,n'-羰基二咪唑加入到二氯甲烷中反应后，得到所述ros响应型交联剂。
[0056]
步骤s12中，在一种实施方式中，将所述第一化合物、硼氢化钠加入到四氢呋喃中，冰浴搅拌后加入碘，然后在氮气保护条件下进行回流反应，然后冷却至室温，加入甲醇继续搅拌，旋干后加入氢氧化钠搅拌，通过乙酸乙酯萃取和无水硫酸钠干燥，得到第二化合物。
[0057]
步骤s13中，在一种实施方式中，将所述第二化合物、n,n'-羰基二咪唑加入到二氯甲烷中，反应后，旋干和柱层析纯化，得到所述ros响应型交联剂。
[0058]
步骤s2中，在一种实施方式中，所述将所述ros响应型交联剂和功能性蛋白质进行混合并搅拌的步骤具体包括：
[0059]
s21、将所述ros响应型交联剂加入到二甲基亚砜中，得到溶液a；
[0060]
s22、将所述功能性蛋白质加入到pbs缓冲液中，得到溶液b；
[0061]
s23、将所述溶液b加入到所述溶液a中进行混合并搅拌。
[0062]
本发明实施例还提供一种本发明实施例如上所述的交联纳米治疗剂在制备治疗肿瘤制剂中的应用。本发明实施例还提供一种本发明实施例如上所述的制备方法制备得到的交联纳米治疗剂在制备治疗肿瘤制剂中的应用。具体地，所述治疗可为饥饿治疗。本实施例所述交联纳米治疗剂可实现高载药量、肿瘤靶向以及肿瘤微环境响应性的蛋白质活性，从而达到饥饿治疗效果，在肿瘤治疗领域将具有良好的应用前景。
[0063]
下面通过具体的实施例进行详细说明。
[0064]
实施例1
[0065]
ros响应型交联剂的制备(其合成路线如图1所示)：
[0066]
将5.52g巯基乙酸加入到50ml圆底烧瓶中，加入8.8ml无水丙酮溶解，然后加入10mg tsoh，在室温条件下搅拌6h进行反应。反应完毕后，在冰浴条件下继续搅拌，将析出的白色晶体进行抽滤，并用冰浴过的正己烷洗涤晶体，得到第一化合物。
[0067]
在三颈瓶中，加入50ml四氢呋喃、2.24g第一化合物和2.27g硼氢化钠，并在冰浴条件下搅拌溶解，得到混合液。将10.15g碘溶于50ml四氢呋喃中，并逐滴滴加到上述混合液中，滴加完毕后在氮气保护条件下回流反应24h。待冷却至室温后，加入25ml甲醇直至溶液变澄清后继续搅拌45min。旋干上述反应液，加入100ml质量含量为25％的氢氧化钠水溶液继续搅拌5h。然后用乙酸乙酯萃取5次，收集有机相，并用无水硫酸钠干燥和旋干，最后进行柱层析纯化，得到第二化合物。
[0068]
将0.196g第二化合物、0.389mg n,n'-羰基二咪唑溶于15ml二氯甲烷中，在室温条件下搅拌8h，然后进行旋干，经柱层析纯化，得到所述ros响应型交联剂。
[0069]
所述ros响应型交联剂的高分辨质谱结果如图2所示，结果表明所述ros响应型交联剂的分子量为381.11。所述ros响应型交联剂的核磁共振氢谱结果如图3所示，结果证实了所述ros响应型交联剂的分子结构。
[0070]
实施例2
[0071]
交联纳米治疗剂的制备：
[0072]
将768mg实施例1中制备得到的ros响应型交联剂溶于1ml二甲基亚砜中，得到溶液a；
[0073]
将15mg gox溶于100ml pbs(ph为7.4)，得到溶液b；
[0074]
取10ul溶液a加入到1ml的溶液b中，在室温条件下搅拌10min，最后将所得的纳米颗粒通过超滤管进行富集和洗涤，得到所述交联纳米治疗剂，记作gox np。
[0075]
gox np的tem图如图4所示。从图4可知，gox与ros响应型交联剂可组装成球形纳米可粒，其粒径大小为50～100nm。
[0076]
实施例3
[0077]
交联纳米治疗剂的制备：
[0078]
将768mg实施例1中制备得到的ros响应型交联剂溶于1ml二甲基亚砜中，得到溶液a；
[0079]
将15mg gox溶于100ml pbs(ph为7.4)，得到溶液b；
[0080]
取13.4μl溶液a加入到1ml的溶液b中，在室温条件下搅拌10min，最后将所得的纳
米颗粒通过超滤管进行富集和洗涤，得到所述交联纳米治疗剂，记作gox np。
[0081]
实施例4
[0082]
双氧水对gox np的降解作用评价
[0083]
利用tem，评价双氧水对gox np结构的影响。将实施例2中的gox np和双氧水混合共孵育，不同时间后对混合液进行tem成像。结果如图5所示，gox np与双氧水混合孵育2h后，其球形结构基本完全解散，说明所述交联纳米治疗剂具有双氧水响应降解的性质。
[0084]
实施例3中的gox np和双氧水混合共孵育后的结果与实施例2中的gox np和双氧水混合共孵育后的结果相似，此处不再赘述。
[0085]
实施例5
[0086]
gox与gox np的酶二级结构评价
[0087]
利用圆二色谱仪，评价gox np的gox二级结构。分别测定gox与实施例2中的gox np的蛋白质二级结构，结果如图6所示，与gox相比，gox np基本测不到相对应的gox的二级结构，说明gox np中gox的二级结构发生改变，gox的活性被抑制。而gox np与双氧水混合孵育后，可检测到gox的蛋白质二级结构，gox的活性可被恢复。
[0088]
实施例3中的gox np的酶二级结构评价结果与实施例2中的gox np的酶二级结构评价结果相一致，此处不再赘述。
[0089]
实施例6
[0090]
gox与gox np产生双氧水能力的评价
[0091]
将实施例2中的gox np与10mm双氧水共孵育，不同时间后通过超滤洗涤获得纯纳米粒。gox、实施例2中的gox np与上述不同时间点收集的纳米粒分别与相同浓度的葡萄糖反应相同时间后，通过双氧水试剂盒分别检测混合液中的双氧水含量，评价gox、gox np和上述不同时间点收集的纳米粒的酶活性。
[0092]
如图7所示，相较于gox组，gox np与葡萄糖孵育后产生的双氧水低于10μm，而随着gox np提前与双氧水孵育时间的延长，其产生的双氧水越来越高，说明随着gox np与双氧水孵育时间的延长，gox np逐渐解散，其酶活性逐渐被恢复。
[0093]
实施例3中的gox np与葡萄糖孵育后产生的双氧水的能力与实施例2中的gox np与葡萄糖孵育后产生的双氧水的能力相当，此处不再赘述。
[0094]
实施例7
[0095]
不同药物处理对细胞的毒性评价
[0096]
采用标准的mtt法，评价饥饿治疗对4t1细胞的杀伤效果。
[0097]
在37℃、5％co2条件下，将4t1细胞以每孔5
×
103密度接种到96孔板中，并继续培育24h。然后，吸出96孔板中的旧培养基，分别加入含有0，10，20，40，60和80ng/ml gox的无糖dmem培养基，以及含有0，2.5，5，10，20和40ng/ml gox的含葡萄糖dmem培养基，其中葡萄糖浓度为2mm；继续培养24小时后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μl含5mg/ml mtt的培养基溶液，继续培养4个小时。然后用150μl二甲基亚砜替换掉旧培养基，利用bio-tel el酶标仪检测每孔的od值(检测波长为490nm)，记作gox组。
[0098]
在37℃、5％co2条件下，将4t1细胞以每孔5
×
103密度接种到96孔板中，并继续培育24h。然后，吸出96孔板中的旧培养基，分别加入含有0，10，20，40，60和80ng/ml实施例2中的gox np的无糖dmem培养基，以及含有0，2.5，5，10，20和40ng/ml实施例2中的gox np的含葡
萄糖dmem培养基，其中葡萄糖浓度为2mm；继续培养24小时后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μl含5mg/ml mtt的培养基溶液，继续培养4个小时。然后用150μl二甲基亚砜替换掉旧培养基，利用bio-tel el酶标仪检测每孔的od值(检测波长为490nm)，记作gox np组。
[0099]
在37℃、5％co2条件下，将4t1细胞以每孔5
×
103密度接种到96孔板中，并继续培育24h。然后，吸出96孔板中的旧培养基，分别加入含有0，10，20，40，60和80ng/ml实施例2中的gox np的无糖dmem培养基，以及含有0，2.5，5，10，20和40ng/ml实施例2中的gox np的含葡萄糖dmem培养基，其中葡萄糖浓度为2mm，所有培养基含10μm双氧水。继续培养24小时后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μl含5mg/ml mtt的培养基溶液，继续培养4个小时。然后用150μl二甲基亚砜替换掉旧培养基，利用bio-tel el酶标仪检测每孔的od值(检测波长为490nm)，记作gox np+双氧水组。
[0100]
用如下公式计算以上三组的细胞存活率。细胞存活率(％)＝(样品的od490值/空白od490值)
×
100％，实验结果见图8。
[0101]
如图8中(a)所示，选用无糖培养基孵育的不同处理组的细胞存活明显高于图(b)中相对应的有糖培养基组。在图(b)中，gox np对细胞的杀伤作用低于gox和加双氧水组，且加入双氧水后具有最强的肿瘤细胞抑制效果。
[0102]
利用实施例3中的gox np处理进行细胞毒性评价，其结果与利用实施例2中的gox np相似，此处不再赘述。
[0103]
实施例8
[0104]
细胞对gox np的摄取能力评价
[0105]
在gox和实施例2中的gox np上通过共价连接修饰荧光染料ir680，然后通过透析去除未连接的多余染料。在37℃、5％co2培养条件下，将4t1细胞以每孔1
×
105密度接种到96孔板中。24h后吸出96孔板中的旧培养基，加入相同浓度的ir680标记的gox和gox np。培养4h后，通过使用荧光共聚焦显微镜检测的荧光变化。
[0106]
结果如图9，gox np组的荧光强度明显高于gox组。这表明相较于gox，细胞对gox np具有更强的摄取作用。证明相较于纯蛋白质，细胞对本发明提供的交联纳米治疗剂具有更强的摄取作用。
[0107]
细胞对实施例3中的gox np的摄取能力与对实施例2中的gox np的摄取能力基本相同，此处不再赘述。
[0108]
综上所述，本发明提供了一种交联纳米治疗剂及其制备方法与应用，所述交联纳米治疗剂在运输过程中，功能性蛋白质由于与ros响应型交联剂交联，功能性蛋白质活性被抑制，靶向至肿瘤部位后，由于ros响应型交联剂具有ros响应性，肿瘤微环境中的双氧水可裂解ros响应型交联剂，使得ros响应型交联剂断键，从而使组装的功能性蛋白质纳米粒解散，恢复功能性蛋白质的活性，实现交联纳米治疗剂活性的选择性控制。本发明提供的交联纳米治疗剂显著提高了功能性蛋白质的载药量和生物利用度，可选择性控制其功能性蛋白质活性，从而实现肿瘤靶向性和选择性，加大药物在肿瘤部位的蓄积量，提高疗效，降低毒副作用。
[0109]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保
护范围。