一种具有降血压功效的组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种具有降血压功效的组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.高血压是一种以动脉压增高为特征的疾病，如果成人收缩压大于或等于160mmhg(21.3kpa)，舒张压大于或等于95mmhg(12.6kpa)则诊断为高血压。高血压病是世界最常见的心血管疾病，病程长，病因复杂，主要危害有损伤血管内皮细胞，导致血管老化，收缩功能下降，血管心肌增生，心肌肥厚，心室重构，心肌收缩力减弱和充血性心力衰竭等，严重者会危及生命。
3.中国高血压调查最新数据显示，2012-2015年我国18岁及以上居民高血压患病粗率为27.9％(标化率23.2％)，与1958—1959年、1979—1980年、1991年、2002年和2012年进行过的5次全国范围内的高血压抽样调查相比，患病率总体呈增高的趋势。我国人群高血压发病的重要危险因素，包括高钠低钾膳食、超重和肥胖、过量饮酒、长期精神紧张、年龄、遗传以及缺乏体力活动等。
4.我国的高血压存在“三高”(患病率高、病死率高、致残率高)、“三低”(知晓率低、服药率低、控制率低)和“三不”(不规律服药、不难受不吃药、不爱用药)现象，如何防治高血压病一直是我国的难题。高血压无根治措施，临床多采用西药降血压治疗，如卡托普利、苯那普利、氯沙坦、缬沙坦、依那普利和赖诺普利等，这类药物均可引起不同程度的不良反应，影响水、电解质紊乱，影响血脂、血糖的代谢，影响肝肾功能，长期服用药物易产生耐药性，需不断增加剂量和增加降血压药种类，大大降低患者的生活质量。
5.开发天然、安全、无副作用的降压产品，在有效降血压的同时可减轻不良反应，提高患者的生活质量，对于我国的健康领域具有十分重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提出一种具有降血压功效的组合物及其制备方法和应用，所述降血压组合物通过枯草芽孢杆菌纤溶酶与山楂、夏枯草、菊花复配，多种成分通过不同途径进行协同作用，降压效果更显著，通过溶解黏附在血管壁上的血栓，减轻血栓对血管壁的压力，扩张冠脉及舒张血管，减少去甲肾上腺素的释放，使血管舒张，从而达到降血压的作用。
7.本发明的技术方案是这样实现的：
8.本发明提供一种具有降血压功效的组合物，所述组合物中含有枯草芽孢杆菌纤溶酶，所述枯草芽孢杆菌纤溶酶由菌种bacillus subtilis qk02发酵制得，所述菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no:m 203078。
9.作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌纤溶酶的制备方法如下：
10.s1.培养基的制备：将无水葡萄糖，脱脂大豆粉，na2hpo4·
12h2o，nah2po4·
h2o，mgso4·
7h2o，cacl2，原料与水按照一定比例配比后在发酵罐中灭菌；
11.s2.枯草芽孢杆菌纤溶酶的制备：将培养基冷却后加入发酵罐内，接种保藏号为cctcc no：m 203078的枯草芽孢杆菌种子液，于发酵设备中发酵；所述接种bacillus subtilis qk02菌种，发酵后的发酵液经过离心去除菌体，收集上清液，超滤浓缩，浓缩液进行喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌纤溶酶粉末。
12.更优选地，所述枯草芽孢杆菌纤溶酶按如下方法制备：按以下培养基配方配制发酵液无水葡萄糖(20-50g/l)，大豆蛋白胨(10-40g/l)，na2hpo4
·
12h2o(1-10g/l)，nah2po4·
h2o(0.1-2g/l)，mgso4·
7h2o(0.1-1g/l)，cacl2(0.1-1g/l)，在发酵罐中105-110℃灭菌10-40分钟；发酵罐内的发酵液冷却至40-50℃后按照0.5-3％(v/v)的接种量接种枯草芽孢杆菌bacillus subtilis qk02菌种种子液，于发酵设备中发酵15-36h，其中发酵设备温度控制在37-42℃、发酵罐压为0.05-0.08mpa、设定溶氧水平为10-50％；发酵后的发酵液通过管式离心机对发酵液进行离心；离心好的发酵液经过滤膜过滤处理；滤膜过滤后的滤液进行喷雾干燥，原料的进风温度100-140℃、出风温度为63-71℃，喷雾干燥得到的固体粉末即为枯草芽孢杆菌溶纤酶。
13.作为本发明的进一步改进，由以下原料制备而成：枯草芽孢杆菌纤溶酶，山楂提取物粉，夏枯草提取物粉，菊花提取物粉。
14.更优选地，所述菊花为杭白菊。
15.作为本发明的进一步改进，由以下原料按重量份制备而成：枯草芽孢杆菌纤溶酶32-50份、山楂提取物粉20-40份、夏枯草提取物粉15-32份、菊花提取物粉12-23份。
16.作为本发明的进一步改进，所述山楂提取物粉的制备方法具体包括以下步骤：取山楂饮片，加入8-12倍的蒸馏水，浸泡0.5-2h，煮沸1-3h，过滤，滤渣加入5-10倍的蒸馏水，再次煮沸0.5-2h，过滤，去渣，合并滤液，减压浓缩，喷雾干燥后得到山楂提取物粉。
17.作为本发明的进一步改进，所述夏枯草提取物粉的制备方法具体包括以下步骤：取夏枯草干燥果穗原料，剪碎，加入10-15倍的蒸馏水浸泡1-3h，加热煎煮10-60min，过滤，滤渣加入5-10倍的蒸馏水，加热煎煮10-60min，合并2次滤液，减压浓缩，喷雾干燥后得到夏枯草提取物粉。
18.作为本发明的进一步改进，所述菊花提取物粉的制备方法具体包括以下步骤：取干燥菊花，加入10-15倍的蒸馏水浸泡3-8h，加热煎煮30-60min，过滤，滤渣加入5-10倍的蒸馏水，加热煎煮30-60min，合并两次滤液，减压浓缩，喷雾干燥后得到菊花提取物粉。
19.本发明进一步保护一种上述具有降血压功效的组合物的制备方法，将枯草芽孢杆菌纤溶酶、山楂提取物粉、夏枯草提取物粉、菊花提取物粉按比例混合，即得具有降血压功效的组合物。
20.本发明进一步保护一种上述具有降血压功效的组合物在制备具有降血压功效的食品、保健食品，以及预防和治疗高血压的药品上的应用。
21.本发明进一步保护一种枯草芽孢杆菌bacillus subtilis qk02菌种，所述菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国武汉武汉大学，其保藏编号为cctcc no:m 203078，保藏日期为2003年11月17日。
22.与现有技术相比，本发明的技术特点在于：
23.本发明选用的枯草芽孢杆菌纤溶酶是一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，通过溶解黏附在血管内壁上的血栓，可预防因血栓增多而造成的血管变硬、脆化、甚至破裂的危
险，还可减少血栓对血管壁的压力，从而使血管变得柔软、年轻，从而达到降血压的目的。
24.本发明选用的山楂，为蔷薇科，山楂属，又名山里红，是干燥的成熟果实，为药食同源的植物。国内外大量的药理学研究表明山楂具有改善心肌功能、调节血压、增加冠脉流量，降血脂等作用。山楂的总黄酮有扩张冠脉及舒张血管和持久的降压作用，并能使冠状动脉扩张，有改善心脏活力和兴奋中枢神经系统的作用。
25.本发明选用的夏枯草，为唇形科夏枯草属多年生草本植物，一般是在夏季采取干燥果穗入药。夏枯草清利肝热，平抑肝阳，在中医药治疗高血压中起着非常重要的作用。现代药理研究表明，其水提物可通过降低血清中血管紧张素ⅱ，内皮素，去甲肾上腺素、血栓素b2，增加血清中降钙素基因相关肽含量，抑制血管收缩，改善预后。
26.本发明选用的杭白菊，是卫生部首批批准的药食同源的药材之一。临床上常用于肝阳上亢引起的头痛，相当于高血压早期的头痛及肝肾不足引起的头晕眼花，颇有效验。现代药理研究表明，菊花有显著扩张冠脉动脉，舒张血管，增加冠脉血流量，降低血压，改善心脏活力，强心，抗心律不齐等作用。
27.本发明能带来如下有益效果：
28.1、本发明所提供的降血压组合物枯草芽孢杆菌纤溶酶与山楂、夏枯草、菊花复配，多种成分通过不同途径进行协同作用，降压效果更显著，通过溶解黏附在血管壁上的血栓，减轻血栓对血管壁的压力，扩张冠脉及舒张血管，减少去甲肾上腺素的释放，使血管舒张，从而达到降血压的作用。
29.2、本发明制备过程中山楂、夏枯草和菊花组分经过多次提取和过滤，使得原料中的有效成分充分得到释放，且成分无毒副作用，无抗药性，适于普通人群的保健预防需要和治病康复需要。
具体实施方式
30.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.山楂饮片、夏枯草、杭白菊均购于湖北同济堂药房有售。
32.枯草芽孢杆菌bacillus subtilis qk02菌种，所述菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国武汉武汉大学，其保藏编号为cctcc no:m 203078，保藏日期为2003年11月17日。
33.实施例1
34.本实施例的一种具有降血压功效的组合物，包括如下质量份数的原料：枯草芽孢杆菌纤溶酶42份，山楂提取物粉30份，夏枯草提取物粉25份，菊花提取物粉20份。所述的菊花提取物由杭白菊制备。
35.上述组合物的制备方法，包括如下步骤：
36.(1)按以下培养基配方配制发酵液无水葡萄糖(30g/l)，大豆蛋白胨(20g/l)，na2hpo4·
12h2o(5g/l)，nah2po4·
h2o(1g/l)，mgso4·
7h2o(0.5g/l)，cacl2(0.2g/l)，在发酵罐中110℃灭菌20分钟；发酵罐内的发酵液冷却至40℃后按照1％(v/v)的接种量接种保藏
号为cctcc no：m203078的枯草芽孢杆菌种子液，于发酵设备中发酵24h，其中发酵设备温度控制在40℃、发酵罐压为0.07mpa、设定溶氧水平为30％；发酵后的发酵液通过管式离心机对发酵液进行离心；离心后发酵液经过0.45um滤膜过滤处理；滤膜过滤后的滤液进行喷雾干燥，原料的进风温度140℃、出风温度为70℃，喷雾干燥得到的固体粉末即为枯草芽孢杆菌溶纤酶。
37.(2)取山楂饮片，加入10倍重量的水，浸泡1h，煮沸2h，过滤，滤渣加入6倍的蒸馏水，再次煮沸1h，过滤，去渣，合并滤液，减压浓缩，喷雾干燥后得到山楂提取物粉。
38.(3)取夏枯草干燥果穗原料，剪碎，加入12倍的蒸馏水浸泡2h，加热煎煮40min，过滤，滤渣加入8倍的蒸馏水，加热煎煮50min，合并2次滤液，减压浓缩，喷雾干燥后得到夏枯草提取物粉。
39.(4)取干燥菊花，加入12倍的蒸馏水浸泡4h，加热煎煮50min，过滤，滤渣加入8倍的蒸馏水，加热煎煮50min，合并两次滤液，减压浓缩，喷雾干燥后得到菊花提取物粉。
40.(5)将得到的枯草芽孢杆菌纤溶酶粉和各个提取物粉分别过80目筛。
41.(6)称量过筛后的原料，按质量份数枯草芽孢杆菌纤溶酶42份，山楂提取物30份，夏枯草提取物25份，菊花提取物20份配料。
42.(7)将配好的组合物于三维混合机中混合25min，至色泽均匀一致，无色差，即得到具有降血压功效的组合物。
43.实施例2
44.本实施例的一种具有降血压功效的组合物，包括如下质量份数的原料：枯草芽孢杆菌纤溶酶50份，山楂提取物粉25份，夏枯草提取物粉32份，菊花提取物粉12份。所述的菊花提取物由杭白菊制备。
45.组合物的制备过程同实施例1，不同之处在于组合物的质量份数枯草芽孢杆菌纤溶酶50份，山楂提取物粉25份，夏枯草提取物粉32份，菊花提取物粉12份。
46.实施例3
47.本实施例的一种具有降血压功效的组合物，包括如下质量份数的原料：枯草芽孢杆菌纤溶酶32份，山楂提取物粉40份，夏枯草提取物粉15份，菊花提取物粉23份。所述的菊花提取物由杭白菊制备。
48.组合物的制备过程同实施例1，不同之处在于组合物的质量份数枯草芽孢杆菌纤溶酶32份，山楂提取物粉40份，夏枯草提取物粉15份，菊花提取物粉23份。
49.对比例1
50.本实施例的一种具有降血压功效的组合物，包括如下质量份数的原料：枯草芽孢杆菌纤溶酶55份，山楂提取物粉45份，夏枯草提取物粉35份，菊花提取物粉25份。所述的菊花提取物由杭白菊制备。
51.组合物的制备过程同实施例1，不同之处在于组合物的质量份数枯草芽孢杆菌纤溶酶55份，山楂提取物粉45份，夏枯草提取物粉35份，菊花提取物粉25份。
52.对比例2
53.本实施例的一种具有降血压功效的组合物，包括如下质量份数的原料：枯草芽孢杆菌纤溶酶30份，山楂提取物粉15份，夏枯草提取物粉10份，菊花提取物粉10份。所述的菊花提取物由杭白菊制备。
54.组合物的制备过程同实施例1，不同之处在于组合物的质量份数枯草芽孢杆菌纤溶酶30份，山楂提取物粉15份，夏枯草提取物粉10份，菊花提取物粉10份。
55.对比例3
56.本实施例的一种具有降血压功效的组合物，包括如下质量份数的原料：枯草芽孢杆菌纤溶酶42份，山楂提取物粉30份，夏枯草提取物粉25份。
57.组合物的制备过程同实施例1，不同之处在于组合物的质量份数枯草芽孢杆菌纤溶酶42份，山楂提取物粉30份，夏枯草提取物粉25份。
58.对比例4
59.本实施例的一种具有降血压功效的组合物，包括如下质量份数的原料：枯草芽孢杆菌纤溶酶42份，山楂提取物粉30份，菊花提取物粉20份。所述的菊花提取物由杭白菊制备。
60.组合物的制备过程同实施例1，不同之处在于组合物的质量份数枯草芽孢杆菌纤溶酶42份，山楂提取物粉30份，菊花提取物粉20份。
61.对比例5
62.本实施例的一种具有降血压功效的组合物，包括如下质量份数的原料：枯草芽孢杆菌纤溶酶42份，夏枯草提取物25份，菊花提取物20份。所述的菊花提取物由杭白菊制备。
63.组合物的制备过程同实施例1，不同之处在于组合物的质量份数枯草芽孢杆菌纤溶酶42份，夏枯草提取物粉25份，菊花提取物粉20份。
64.对比例6
65.本实施例的一种具有降血压功效的组合物，包括如下质量份数的原料：枯草芽孢杆菌纤溶酶42份。
66.枯草芽孢杆菌纤溶酶的制备过程同实施例1，不同之处在于该组合物只有一种成分枯草芽孢杆菌纤溶酶，质量份数42份。
67.实验例1
68.试验对象：自发性高血压大鼠(shr)，雄性，清洁级，周龄10-12，体重200-250g；spf级雄性wistar大鼠，体重200-250g，血压124.10
±
10.63mmhg。
69.实验方法：
70.试验开始前1周，大鼠先进行无创血压测定1周，使其适应测量环境。分组如下：自发性高血压大鼠70只，分成7组，每组10只，为模型对照组和实验组1-5，实验组1-3为实施例1-3的组合物，实验组4-5为对比例1-2的组合物，实验组6为对比例6。wistar大鼠10只，为普通对照组。
71.按中剂量0.5g/kg.d给药，以纯化水为溶剂配制所需浓度，每只大鼠按1.0ml/100g.bw灌胃，模型对照组灌胃纯化水，普通对照组按实施例1高剂量1g/kg.d给药，以纯化水为溶剂配至所需浓度，每只大鼠按1.0ml/100g.bw灌胃，连续给药30天。
72.采用智能无创血压计，测量大鼠动脉收缩压。在大鼠安静清醒状态下，将其固定在专用固定器上，在40℃下恒温预热10min左右，促进尾动脉有效扩张，血流通畅；然后将大鼠加压感应器套入鼠尾根部。试验期间、用药前及用药后每周测量血压、心率和体重各1次。
73.使用spss统计软件进行数据处理，t检验进行各组间显著性差异分析，p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著。所有检测指标的数据均以均数
±
标准差表示，测试结果
见表1。
74.表1：实验组1-6、模型对照组及普通动物组对试验大鼠体重影响
75.组别给药前体重/g给药第30天体重/g普通动物组229.81
±
10.40366.99
±
9.85模型对照组227.20
±
11.98371.42
±
12.72实验组1228.99
±
15.09368.85
±
10.19实验组2222.59
±
13.51369.68
±
11.60实验组3223.70
±
14.95369.83
±
14.10实验组4224.28
±
12.19370.04
±
11.40实验组5227.53
±
14.59366.15
±
12.34实验组6223.91
±
11.98367.86
±
12.74
76.表2：实验组1-6、模型对照组及普通动物组对试验大鼠血压影响
[0077][0078]
注释：
[0079]
※※
：表示给药后30天血压与模型对照组相比有极显著下降，p＜0.01；
※
：表示给药后30天血压与模型对照组相比有显著下降，p＜0.05。
[0080]
表3：实验组1-6、模型对照组及普通动物组对试验大鼠心率影响
[0081]
组别给药前心率(次/分)给药后心率(次/分)普通动物组391.78
±
5.32391.41
±
4.96模型对照组390.07
±
5.37388.60
±
5.51实验组1388.31
±
6.68386.80
±
4.91实验组2390.92
±
7.43388.32
±
6.76实验组3391.49
±
5.65393.01
±
5.14实验组4390.27
±
6.36389.72
±
6.18实验组5388.35
±
6.20386.33
±
4.06实验组6389.13
±
6.82390.87
±
6.11
[0082]
试验过程中各动物生长良好，活动正常。由表1和表3可知，各组动物经过30天的给
药治疗后，与普通对照组相比，模型对照组和实验组体重无显著差异，心率也无显著差异，说明各组合物对大鼠健康无副作用。
[0083]
由表2可知，实验组1-3、6血压值与模型对照组相比，具有极显著差异(
※※
p＜0.01)，血压下降明显，但是实验组6血压下降率低于实验组1-3；实验组4、5血压值与模型对照组相比，具有显著差异(
※※
p＜0.05)，血压有下降趋势，但是血压下降率低于实验组1-3、6。
[0084]
通过本实验结果，说明本发明实施例1-3的组合物相较于对比例1-2的组合物，在调整各成分用量后，对大鼠降血压的作用明显增强，本发明一种具有降血压功效的组合物质量配比合理。
[0085]
实验例2
[0086]
试验对象：自发性高血压大鼠(shr)，雄性，清洁级，周龄10-12，体重200-250g。
[0087]
试剂：ace试剂盒
[0088]
根据实验例1的实验结果，实验样品选取实施例1中的组合物，实验设低、中、高三个剂量组，高剂量1g/kg.d，中剂量0.5g/kg.d，低剂量0.25g/kg.d，同实验1用大鼠实验进行评价，对比例3、4、5的组合物按高剂量组灌入。
[0089]
实验方法与实验例1相同，试验组shr大鼠随机平均分7组，分别为模型组和实验组1-6，实验组1-3为实施例1低、中、高三个剂量组，实验组4-6为对比例3-5中的组合物配比，以纯化水为溶剂配至所需溶度，每只大鼠按1.0ml/100g.bw灌胃，模型对照组灌胃纯化水，试验期间、用药前及用药后每周测量血压、心率和体重各1次，检测方法同实验1。
[0090]
同时加测指标血清ace活力，检测方法：实验期满动物撤食20h后经股动脉放血处死，取空腹血，离心取上层液，得血清，按照ace试剂盒说明检测血清中的ace。
[0091]
使用spss统计软件进行数据处理，t检验进行各组间显著性差异分析，p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著。所有检测指标的数据均以均数
±
标准差表示，测试结果见表1。
[0092]
各组实验指标如表4-6所示：
[0093]
表4：实验组1-6、模型对照组及普通动物组对试验大鼠体重影响
[0094][0095][0096]
表5：实验组1-6、模型对照组及普通动物组对试验大鼠血压及血清ace活力影响
[0097][0098]
注释：
[0099]
※※
：表示给药后30天血压与模型对照组相比有极显著下降，p＜0.01；
[0100]
※
：表示给药后30天血压与模型对照组相比有显著下降，p＜0.05。
[0101]
表6：实验组1-6、模型对照组及普通动物组对试验大鼠血压影响
[0102][0103][0104]
试验过程中各动物生长良好，活动正常。由表4和表6可知，各组动物经过30天的给药治疗后，与模型对照组相比，体重、心率也无显著差异。
[0105]
由表5可知，实验组1血压值与模型对照组相比，具有显著差异(
※
p＜0.05)，实验组2、3血压值与模型对照组相比，具有极显著差异(
※※
p＜0.01)，血压下降明显，且血压下降率与组合物剂量成正相关的趋势，实验组4、5、6与模型组对比无显著差异。
[0106]
实验组1、2、3血清ace活力与模型对照组相比，具有极显著差异(
※※
p＜0.01)，表明本发明组合物对血清ace活力有抑制作用，且抑制ace活力的效果与组合物剂量成正相关的趋势。通过实验中血压值与ace活力检测值可知，组合物降血压的离体试验和体内试验效果一致。
[0107]
以上数据表明，本发明提供的具有降血压功效组合物中枯草芽孢杆菌纤溶酶、山楂提取物、夏枯草提取物、菊花提取物产生协同增效作用，可以使黏附在血管壁上的血栓溶解，减轻血管压力、舒张血管，抑制血管收缩，改善心脏活力和兴奋中枢神经系统的作用，从
而达到降血压的功效。
[0108]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。