植物来源纳米颗粒在制备防治血管钙化药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及植物来源纳米颗粒在制备防治血管钙化药物中的应用。


背景技术：

2.血管钙化(vascular calcification)是钙、磷等矿物质以羟基磷灰石的形式在血管壁的异常沉积，为动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变、血管损伤、慢性肾病、衰老等疾病或过程中普遍存在的共同病理表现。主要表现为血管壁僵硬性增加，顺应性降低，且易导致心肌缺血、左心室肥大和心力衰竭，引发血栓形成、斑块破裂等症状，是心脑血管疾病高发病率和高死亡率的重要因素之一，也是动脉粥样硬化心血管事件、脑卒中和外周血管病发生的重要标志分子。
3.目前，血管钙化是普遍、难治的疾病之一，临床上针对血管钙化仍然缺乏有效的治疗手段。中国专利申请公开了促生长激素释放激素激动剂在制备抗血管钙化药物中的应用，ghrh-a可以提高平滑肌细胞中camp水平和蛋白激酶a(pka)活性，降低平滑肌细胞napdh氧化酶表达和活性，降低平滑肌细胞中ros的水平，降低平滑肌细胞中runx2表达和活性及细胞碱性磷酸酶(alp)表达和活性，以及降低体内血液中无机磷的含量，从而减少主动脉中钙沉积和磷沉积，减少主动脉中alp活性，达到治疗或预防血管钙化、动脉硬化的目的；但是该药物容易影响机体内正常激素的代谢，存在一定的安全隐患，目前还未实际应用。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服缺少防治血管钙化药物，且安全性存在一定隐患的缺陷和不足，提供一种安全性高的植物来源纳米颗粒在制备防治血管钙化药物中的应用。
5.本发明的目的是提供一种植物来源纳米颗粒的制备方法。
6.本发明另一目的是提供所述制备方法制备得到的植物来源纳米颗粒。
7.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
8.一种植物来源纳米颗粒的制备方法，具体包括以下步骤：
9.葡萄柚榨汁，取果汁进行差速离心，去除果渣所得上清液超高速离心，分离得到的沉淀用缓冲液重悬，利用蔗糖密度梯度离心法进行纯化，得到葡萄柚来源纳米颗粒。
10.进一步地，所述超高速离心为100000～160000g离心1.5～2.5h。优选地，所述超高速离心为100000g离心2h。
11.更进一步地，所述离心在3～5℃条件下进行。
12.进一步地，所述差速离心分为5个阶段，依次为：第一阶段400～600g离心8～12min，第二阶段1800～2200g离心15～25min，第三阶段4500～5500g离心30min，第四阶段8000～12000g离心1～1.5h，第五阶段80000～120000g离心1.5～2.5h。
13.优选地，所述差速离心分为5个阶段，依次为：第一阶段500g离心10min，第二阶段
2000g离心20min，第三阶段5000g离心30min，第四阶段10000g离心1h，第五阶段100000g离心2h。
14.优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(pbs)。
15.更进一步地，所述蔗糖密度梯度离心法为：密度为8％、30％、45％和60％的蔗糖依次加入离心管中形成蔗糖密度梯度，将悬液转移到密度为8％、30％、45％和60％的蔗糖梯度的最上层，140000～160000g离心1.5～2.5h，30％/45％条带即为纯化后的葡萄柚来源纳米颗粒。
16.另外的，本发明还提供了所述制备方法制备得到的植物来源纳米颗粒。
17.进一步地，所述植物来源纳米颗粒的粒径为104.5～122.3nm。
18.本发明通过特定方法制备得到的植物来源纳米颗粒(gnvs)，经过实验研究证实，对于高磷诱导的小鼠血管平滑肌细胞和高维生素d3诱导的小鼠血管钙化模型，本发明提供的葡萄柚来源纳米颗粒，可以有效缓解血管钙化；并且久置后粒径和膜电位并未造成显著的改变，也未对小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)造成损伤，具有较高的稳定性和较好的安全性，有望应用到血管钙化疾病的防治当中，为治疗血管钙化提供了一种新的思路和更好的防治方案。
19.另外的，植物来源纳米颗粒具有类脂质体结构，可以进一步修饰优化其功能。
20.因此，本发明还要求保护所述植物来源纳米颗粒在制备防治血管钙化药物中的应用。
21.进一步地，当应用在小鼠主动脉平滑肌细胞上时，所述植物来源纳米颗粒的浓度为5～15μg/ml。对于其他不同的作用对象，可以根据换算规则对用药剂量进行换算。
22.更进一步地，所述药物的剂型为口服剂、注射剂或吸入剂。
23.本发明具有以下有益效果：
24.本发明通过特定方法制备得到的植物来源纳米颗粒，经过实验研究证实，对于高磷诱导的小鼠血管平滑肌细胞和高维生素d3诱导的小鼠血管钙化模型，本发明提供的葡萄柚来源纳米颗粒，可以有效缓解血管钙化；并且久置后粒径和膜电位并未造成显著的改变，也未对小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)造成损伤，具有较高的稳定性和较好的安全性，有望应用到血管钙化疾病的防治当中，为治疗血管钙化提供了一种新的思路和更好的防治方案。
附图说明
25.图1为本发明实施例2中葡萄柚来源植物纳米颗粒的鉴定相关图片，其中，图1a为葡萄柚来源植物纳米颗粒标志物蛋白质印迹鉴定图，图1b为电子显微镜下葡萄柚来源植物纳米颗粒的形貌特征图，图1c为使用dls测定葡萄柚来源植物纳米颗粒的粒径分布图，图1d为葡萄柚来源植物纳米颗粒的膜表面zeta电位图。
26.图2为本发明实施例3中葡萄柚来源植物纳米颗粒的稳定性测定相关图片，其中图2a、2b为在含50％胎牛血清(fbs)的pbs缓冲液中葡萄柚来源植物纳米颗粒在不同时间点的粒径和zeta电位图，图2c、2d为pbs缓冲液中葡萄柚来源植物纳米颗粒在4℃条件下不同时间点的粒径和zeta电位图。
27.图3为本发明实施例4中cck8测定不同浓度葡萄柚来源植物纳米颗粒对血管平滑
肌细胞活力统计图。
28.图4为本发明实施例5中不同浓度的葡萄柚来源植物纳米颗粒对高磷诱导的小鼠主动脉平滑肌细胞(mvsmcs)的抗钙化作用效果图。
29.图5为本发明实施例6中葡萄柚来源植物纳米颗粒对高维生素d3诱导的c57bl/6小鼠血管钙化模型抗血管钙化作用考察的血管染色图。
30.图6为本发明实施例7中不同浓度的葡萄柚来源植物纳米颗粒体外药物溶血率统计图。
31.图7为本发明实施例8中葡萄柚来源植物纳米颗粒对c57bl/6小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)he染色图。
具体实施方式
32.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
33.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
34.细胞培养：
35.从雄性c57bl/6小鼠主动脉组织的中膜中分离小鼠主动脉平滑肌细胞(mvsmcs)；将mvsmcs在含有10％fbs(bi)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem(4.5glu)培养基中培养，第3至第8代细胞用于实验。
36.雄性c57bl/6小鼠6～8周龄(18～22g)购自广东省医学实验动物中心，所有动物实验均按照中国广州南方医科大学机构动物护理和使用委员会(iacuc)的规定和指南进行。
37.细胞茜素红染色：细胞去培养基，pbs洗3次，4％多聚甲醛溶液在室温下固定15min，蒸馏水洗3次，2％茜素红s(ph＝4.2)染色5min，蒸馏水洗去浮色，使用光学显微镜拍照。
38.组织茜素红染色：收集的主动脉组织用4％多聚甲醛溶液在室温下固定48h，0.004％茜素红s染色过夜，2％氢氧化钾洗涤5分钟去浮色，扫描仪扫描拍照。
39.统计分析：所有值均表示为平均值
±
sd；在比较2个独立组时使用具有双尾p值的非配对student-t检验确定统计差异，在比较3个或更多独立组时使用student-newman-keuls(snk)或dunnett事后检验进行单因素方差分析，使用ibm spss 19.0软件；使用kaplan-meier估计(对数秩检验)确定生存分析；在*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001时，认为差异是显著的。
40.实施例1葡萄柚来源植物纳米颗粒的提取、纯化
41.葡萄柚清洗去皮，在室温环境下榨汁，收集果汁后放于4℃冰箱预冷，4℃条件下差速离心(依次为500g离心10min，2000g离心20min，5000g离心30min，10000g离心1h)，去除果渣后，所得上清使用超高速100000g离心2h，分离收集得到的沉淀用pbs缓冲液重悬，悬液用蔗糖密度梯度离心法分离纯化，得到葡萄柚来源植物纳米颗粒(gnvs)，重悬于pbs中为葡萄柚来源植物纳米颗粒悬液备用，使bca测得蛋白浓度为1mg/ml，后续试验中均使用bca所测蛋白浓度对gnvs进行定量。
42.其中，所述蔗糖密度梯度离心法为：将蔗糖溶于20mm tris.hcl(ph 7.2)溶液中，
配制成密度分别为8％(4g蔗糖，加入20mm tris.hcl(ph 7.2)定容至50g)、30％(8g蔗糖，加入20mm tris.hcl(ph 7.2)定容至50g)、45％(22.5g蔗糖，加入20mm tris.hcl(ph 7.2)定容至50g)和60％(30g蔗糖，加入20mm tris.hcl(ph 7.2)定容至50g)蔗糖溶液，依次加入离心管中形成蔗糖密度梯度，将悬液转移到密度为8％、30％、45％和60％的蔗糖梯度的最上层，150000g离心2h，30％/45％条带即为纯化后的葡萄柚来源纳米颗粒。
43.实施例2葡萄柚来源植物纳米颗粒的鉴定
44.使用bca蛋白质定量测定试剂盒测定实施例1所得葡萄柚来源植物纳米颗粒悬液中蛋白含量，并通过蛋白质印迹法验证葡萄柚来源植物纳米颗粒，具体方法为：
45.在4℃、100000g条件下将实施例1所得葡萄柚来源植物纳米颗粒悬液离心1.5h，使用含有1％蛋白酶抑制剂和1％磷酸酶抑制剂(p1006，beyotime biotechnology，china)的ripa裂解缓冲液重悬葡萄柚来源植物纳米颗粒，提取蛋白；使用bca蛋白质定量测定试剂盒测定总蛋白质的浓度，确定上样量为50μg，通过10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，将上述所得蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上(美国密理博)，在室温下用含5％脱脂牛奶的tbst(含0.1％吐温-20的tbs缓冲液)封闭膜2h，然后在4℃下与一抗孵育过夜：兔抗alix抗体(稀释度1:2000)，兔抗tsg101抗体(稀释1:1000)，兔抗cd9(稀释1:1000)和兔抗cd63(稀释1:1000)，兔抗钙连接蛋白(稀释1:1000)，tbst洗涤3次后，用hrp标记的抗兔二抗(稀释度1:10000)室温赋予2h，然后用增强化学发光法检测信号(millipore，usa)，并使用bio-rad chemidoc
tm
mp成像系统(bio-rad，usa)成像。
46.结果参见图1a，由图可见，实施例1所得葡萄柚来源植物纳米颗粒可表达外泌体相关蛋白alix、cd9、cd63，与细胞对比不表达calnexin。
47.使用电子显微镜通过常规程序评估葡萄柚来源植物纳米颗粒的形貌特征，结果参见图1b。由图可见，实施例1所得葡萄柚来源植物纳米颗粒大小相对均一，具有双层膜的类圆形结构。
48.使用dls测量葡萄柚来源植物纳米颗粒粒径、zeta电位，结果参见图1c、图1d。由图可见，葡萄柚来源植物纳米颗粒粒径为104.5～122.3nm，zeta电位为-6.4～-4.6mv。
49.实施例3葡萄柚来源植物纳米颗粒的稳定性测定
50.将实施例1所得葡萄柚来源植物纳米颗粒置于含50％胎牛血清(fbs)的pbs缓冲液中，并在37℃下孵育；在选定的时间点(0～168h，每隔24h)，使用dls测量葡萄柚来源植物纳米颗粒粒径、zeta电位。
51.将实施例1所得葡萄柚来源植物纳米颗粒悬液4℃放置；在选定的时间点(0～30d，每隔5d)，使用dls测量葡萄柚来源植物纳米颗粒粒径、zeta电位。
52.结果参见图2，由图可见，葡萄柚来源植物纳米颗粒在50％胎牛血清的pbs缓冲液中，168小时内并未观测到葡萄柚来源植物纳米颗粒粒径分布及膜电位显著改变；同样的，将葡萄柚来源植物纳米颗粒置于pbs中，30天内并未观测到葡萄柚来源植物纳米颗粒粒径分布及膜电位显著改变。
53.实施例4细胞活力测定
54.使用cck8测定评估葡萄柚来源植物纳米颗粒的细胞毒性：将mvsmcs细胞(每孔100μl培养基中4
×
103个细胞)接种在96孔板中(n＝5)，并在37℃下培养24h；然后将每孔的培养基更换为200μl dmem培养基或200μl含有不同葡萄柚来源植物纳米颗粒浓度(0、1、5、10、
15、20、30、40μg/ml)的dmem培养基，用dmem培养基培养的细胞作为对照组；培养48h后，将培养基更换为200μl含有10％cck8的dmem培养基，再培养0.5h、1h、2h；使用酶标仪(synergy2，bio-tek，usa)在450nm处测量吸光度值。每组中的细胞活力表示为(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)的百分比。实验一式三份进行，结果显示了三个独立实验的代表。
55.结果参见图3，由图可见，葡萄柚来源植物纳米颗粒在0～15μg/ml浓度并未对细胞活性造成影响；当葡萄柚来源植物纳米颗粒浓度高于或等于20μg/ml，细胞活性随葡萄柚来源植物纳米颗粒浓度升高而降低。
56.实施例5葡萄柚来源植物纳米颗粒对小鼠主动脉平滑肌细胞(mvsmcs)的抗钙化作用
57.将mvsmcs细胞接种于六孔板中(每孔1ml培养基中有1
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106个细胞)，培养24h使细胞贴壁；更换新鲜dmem培养基，培养至细胞密度约为60～70％时，钙化组及治疗组加入磷终浓度为3mmol/l的高磷钙化液，记为第0天；隔天换液，造模至第6天更换新鲜dmem培养基，钙化组继续加入3mmol/l高磷钙化液，治疗组加入磷终浓度为3mmol/l的高磷钙化液的同时加入葡萄柚来源植物纳米颗粒，使终浓度分别为5、10、20μg/ml；向正常小鼠血管平滑肌细胞中加入终浓度为10μg/ml葡萄柚来源植物纳米颗粒作为10μg/ml gnvs组，另外在正常小鼠血管平滑肌细胞中加入等量pbs作为对照的正常组；干预小鼠血管平滑肌细胞48h后，通过茜素红染色，使用光学显微镜拍照，评估小鼠血管平滑肌细胞钙化程度。
58.结果参图4，通过目视观察茜素红染色组织与镜下观茜素红染色程度评估小鼠血管平滑肌细胞钙化程度，茜素红染色面积越多即钙化程度越重。由图可见，10μg/ml葡萄柚来源植物纳米颗粒干预正常小鼠血管平滑肌细胞细胞48h，并未观察到细胞形态改变或细胞数量减少；5μg/ml葡萄柚来源植物纳米颗粒有缓解小鼠血管平滑肌细胞钙化的作用；其中，10μg/ml葡萄柚来源植物纳米颗粒对钙化缓解作用更加显著；20μg/ml葡萄柚来源植物纳米颗粒缓解血管钙化作用大体与10μg/ml相似，但通过镜下观察发现该浓度可使血管平滑肌细胞出现细胞形态变化及细胞数量减少，与前述细胞活性结果相一致。可见，10μg/ml葡萄柚来源植物纳米颗粒为干预血管钙化的较优浓度。
59.实施例6葡萄柚来源植物纳米颗粒对高维生素d3诱导的c57bl/6小鼠血管钙化模型抗血管钙化作用
60.雄性c57bl/6小鼠6～8周龄(18～22g)皮下注射维生素d3(剂量：0.2mg/g)造模，并在处死后取小鼠主动脉进行茜素红染色证实造模成功。
61.将c57bl/6小鼠随机分为三个不同组，体重没有任何偏差(n＝6)，记为：正常组、钙化组、治疗组，按上述方法造模，记为第0天，同时治疗组分别用pbs、葡萄柚来源植物纳米颗粒治疗小鼠(6.5mg/kg)，隔天通过腹腔注射给药一次；第7日处死小鼠，收集主动脉，用4％多聚甲醛溶液在室温下固定48小时，0.004％茜素红s染色过夜，2％氢氧化钾洗涤5分钟去浮色，扫描仪扫描拍照。
62.结果参见图5，由图可见，与钙化组相比，治疗组小鼠主动脉血管钙化程度明显减轻，证实葡萄柚来源植物纳米颗粒可减轻维生素d3诱导的c57b/l6小鼠血管钙化。
63.实施例7葡萄柚来源植物纳米颗粒体外药物溶血实验
64.雄性6～8周龄c57bl/6小鼠眼球取血1ml置于edta k3采血管中，颠倒混匀后取500
μl于装有5ml pbs的15ml离心管中，3000r/min离心5min，弃上清，加入10ml pbs混匀，3000r/min离心5min，弃上清，重复3～4次至上清澄清；加入10ml pbs重悬红细胞，制成5％红细胞悬液，取200μl红细胞悬液，加入不同浓度(1、5、10、25、50μg/ml)葡萄柚来源植物纳米颗粒800μl，阳性对照组中加入800μl蒸馏水，阴性对照组中加入800μl pbs；置于37℃温箱中温育2h，3000r/min离心5min，取上清200μl置于96孔板中，使用酶标仪在576nm处测量吸光度值，计算溶血率。计算公式为：溶血率＝(待测样本吸光度-阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)的百分比。实验一式五份进行，结果显示了五个独立实验的代表。
65.结果参见图6，由图可见，葡萄柚来源植物纳米颗粒在50μg/ml浓度下，不会对机体造成溶血，该浓度高于在动物体内的用药浓度，安全性较好。
66.实施例8葡萄柚来源植物纳米颗粒器官安全性实验
67.雄性c57bl/6小鼠6～8周龄(18～22g)通过皮下注射维生素d3(剂量：0.2mg/g)造模，造模后分别用pbs、葡萄柚来源植物纳米颗粒治疗小鼠(6.5mg/kg)，隔天通过腹腔注射给药一次；每天测量每组6只小鼠的体重变化，直至处死小鼠在造模后第8天，处死小鼠，取主动脉和主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)。将不同治疗组收集的器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)采用he染色法进行染色，在光学显微镜(nikon，japan)下观察所有组织切片。
68.结果如图7所示，可见使用葡萄柚来源植物纳米颗粒治疗血管钙化，并未对小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)造成损伤，安全性高。
69.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。