芍药苷类化合物作为TDO抑制剂在药物制备中的应用

芍药苷类化合物作为tdo抑制剂在药物制备中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及芍药苷类化合物作为tdo抑制剂在药物制备中的应用。


背景技术：

2.色氨酸-2，3-双加氧酶(tdo)于1930年首次在大鼠肝脏中被发现，由基因tdo2编码，在肝脏中组成性高表达。最初只是认为tdo受糖皮质激素和l-色氨酸水平的调节，负责催化食物来源的色氨酸进行代谢降解生成犬尿氨酸(kyn)。随着研究的深入，发现tdo的表达与许多疾病相关联，如癌症，阿兹海默症、抑郁症、功能性消化不良、肠易激综合征、焦虑症等。
3.tdo自发现以来一直没有受到重视，近些年来陆续有部分tdo抑制剂被报道。如现有技术中研究较早的基于吲哚骨架化合物开发了一系列3-[2-(吡啶基)乙烯基]吲哚类化合物，作为tdo/5-羟色胺再摄取组合抑制剂用于治疗抑郁症(salter m et al.,1995)，代表药物lm10在临床前实验中还显示出明显的抗肿瘤活性(pilottea l et al.,2012)。而后研究出包含萘三唑二酮的核心结构化合物，第一次通过基于结构的虚拟筛选鉴定为新型tdo抑制剂(wu js et al.,2015)；进而在2018年pei等通过高通量筛选确定氨基异噁唑结构是抑制tdo所需的核心结构。此外，还有其他氧化还原活性化合物如儿茶酚、对苯二酚、对苯醌、l-二羟基苯丙氨酸和l-肾上腺素相继被发现作为tdo抑制剂(frieden e et al.,1961)。而这些tdo抑制剂多数仍处于探索和结构修饰阶段，存在溶解度低、生物利用度差等成药性问题，且作用机制尚未明确。目前仍然缺少能够用于由tdo表达上调或者活性增强进而引发的疾病的治疗药物。


技术实现要素：

[0004]
本发明要解决的技术问题是克服上述的缺陷和不足，提供了芍药苷类化合物用于制备tdo酶抑制剂的新用途，为由tdo介导的相关疾病提供新的有效药物。
[0005]
本发明的目的是提供芍药苷类化合物在作为tdo抑制剂中的应用。
[0006]
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0007]
本发明人团队通过前期在建立肝郁证小鼠模型时发现，慢性应激可造成小鼠肝脏tdo表达异常升高，疏肝理脾经典方药柴胡疏肝散可降低tdo表达。因此从柴胡疏肝散中筛选tdo抑制剂，用于治疗以tdo介导病理特征的疾病。
[0008]
本研究利用双荧光素酶报告基因法筛选柴胡疏肝散中单味药及全方的含药血清，确定显效药味；通过分子对接实现tdo酶抑制剂的高通量虚拟筛选；利用分子垂钓法确定与tdo特异性结合的活性成分；对筛选出来的抑制剂候选物，通过tdo过表达稳转细胞株进行验证，利用western blot法、rt-pcr法以及lc/ms/ms法分别从蛋白水平、mrna水平和酶活性水平证明了芍药苷能抑制tdo表达及酶活性；最后经整体动物实验，验证了芍药苷对tdo有显著抑制效果，可明显降低犬尿氨酸含量，升高5-羟色胺水平，从而显著改善肝郁证小鼠行
为学。
[0009]
因此，本发明提供芍药苷类化合物在作为tdo抑制剂中、在制备tdo抑制剂中、在制备由tdo表达上调或者活性增强进而引发的疾病治疗药物中的应用。
[0010]
进一步地，芍药苷类化合物作为tdo抑制剂在制备治疗由tdo表达上调或者活性增强进而引发疾病的药物中的应用。
[0011]
优选地，所述由tdo表达上调或者活性增强进而引发疾病为肿瘤、抑郁症、功能性消化不良、肠易激综合征、焦虑症中的一种或多种。
[0012]
本发明提供芍药苷类化合物在制备肝郁症治疗药物方面的应用。
[0013]
优选地，所述药物通过抑制tdo表达及酶活性来发挥作用。
[0014]
更优选地，所述药物能够调节5-羟色胺和犬尿氨酸的含量。
[0015]
优选地，所述芍药苷类化合物为芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷中的一种或多种。
[0016]
更优选地，所述芍药苷浓度≤100μg/ml，芍药内酯苷浓度≤300μg/ml，苯甲酰芍药苷≤100μg/ml。
[0017]
本发明具有以下有益效果：
[0018]
本发明提供芍药苷类化合物作为tdo抑制剂在药物制备中的应用，本发明从18种白芍、枳壳的活性成分中得到与htdo受体能进行自发结合，且具有较好的结合性的芍药苷类化合物：芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷；且在芍药苷浓度在≤100μg/ml，芍药内酯苷浓度≤300μg/ml，苯甲酰芍药苷≤100μg/ml范围时，对细胞增长无影响，细胞存活率在90％以上。本发明研究表明芍药苷能显著降低tdo蛋白的表达，同时，芍药苷对tdo有显著抑制效果，并且能降低犬尿氨酸含量，升高5-羟色胺水平，明显改善肝郁小鼠行为学。
[0019]
本发明研究显示芍药苷用于治疗由于tdo表达上调或者活性增强进而引发疾病效果与现有技术中开发的tdo抑制剂药物lm10有着同样的药效作用，在动物造模后给药，从肝里的表达情况来看，芍药苷具有比阳性药更好的效果。因此，基于首次报道芍药苷类化合物对tdo具有抑制效果，可以用于结构类似化合物的合成和药物的研究，也可以用于治疗以tdo介导病理特征的疾病，具有很好的药用开发和应用以及良好的治疗前景。
附图说明
[0020]
图1为柴胡疏肝散含药血清的双荧光素酶gluc/seap结果(附图标记说明：各组数据均符合正态分布、方差齐，进行两独立样本t检验。与gl-s组相比####p《0.0001；与vt组相比*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001)；
[0021]
图2为受体结构图；
[0022]
图3为tdo酶-磁珠固定相载体构建流程图；
[0023]
图4为傅里叶变换红外光谱仪表征图；
[0024]
图5为lm10的uplc色谱图(附图标记说明：s0为lm10原液；s1为lm10孵育后的上清液；w1为洗涤3次后合并的上清液；w2为加入50％乙腈解离后的上清液)；
[0025]
图6为白芍配体垂钓图(附图标记说明：数据1为白芍水提液；数据2为孵育后的上清液；数据3为洗涤3次后合并的上清液；数据4为加入50％乙腈解离后的上清液；数据5为芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷混合标准品溶液；数据6为芍药苷标准品)；
[0026]
图7为荧光显微镜下观察稳转细胞株egfp表达结果(附图标记说明：左为hepg2细胞荧光视野(
×
200)；右为hepg2细胞明场视野(
×
200))；
[0027]
图8为hepg2细胞tdo蛋白印记迹结果；
[0028]
图9为cck-8法确定不同浓度药物溶液的细胞毒性；
[0029]
图10为各组细胞tdo蛋白表达情况(附图标记说明：1-正常组；2-tdo过表达组；3-芍药内酯苷组；4-苯甲酰芍药苷组；5-芍药苷组；6-lm10)；
[0030]
图11为肝郁证小鼠体型、毛发状态；
[0031]
图12为各组小鼠体重变化趋势图；
[0032]
图13为各组小鼠肝组织中tdo蛋白印记迹结果(附图标记说明：1-正常组；2-模型组；3-芍药苷组；4-lm10)组。
具体实施方式
[0033]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0034]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0035]
以下实施例中采用的重组慢病毒质粒ex-c0452-lv201-tdo2、慢病毒表达载体lv201、tdo启动子双荧光素酶载体(gl-s-tdo)均购自易锦生物技术有限公司；磁珠(mag cooh beads)购自苏州海狸生物医学工程有限公司；tdo酶购自北京义翘神州科技股份有限公司；芍药苷、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)均购自上海笛柏生物科技有限公司；芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷购自成都普菲德生物技术有限公司；lm10购自江苏艾康生物医药研发有限公司；n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)购自上海贤鼎生物科技有限公司；吗啉乙磺酸(mes)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；上述试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂，培养基均为市售产品，均按使用说明使用。
[0036]
人肝癌细胞hepg2、人胚肾上皮细胞hek-293t由广州中医药大学新药研发中心馈赠。
[0037]
实施例1抑制tdo转录的显效药味筛选
[0038]
本发明研究前期在建立肝郁证小鼠模型时发现，慢性应激可造成小鼠肝脏tdo表达异常升高，而疏肝理脾经典方药柴胡疏肝散可降低tdo表达。基于此，再结合中医药理论基础，遵循“从肝论治”原则，本发明从柴胡疏肝散中筛选tdo抑制剂，分别准备柴胡疏肝散单味药：柴胡、白芍、陈皮、枳壳、川芎、香附和甘草，以及柴胡疏肝散的全药味组方。
[0039]
1、柴胡疏肝散单味药及全方的含药血清制备
[0040]
健康雄性km小鼠54只(广东省实验动物中心购买，动物合格证：scxk(粤)2018-0002)，适应性喂养7d后，随机分为9组：正常组、柴胡组(bup)、白芍组(pae)、陈皮组(cit)、枳壳组(aur)、川芎组(lig)、香附组(rhi)、甘草组(gly)、全方组(csgs)，灌胃给药，给药标准均为2ml/100g，每日1次，连续3d，空白组给予生理盐水灌胃，给药组按人与小鼠体表面积换算等效剂量法，给药浓度分别为7.8g/kg、5.85g/kg、7.8g/kg、5.85g/kg、5.85g/kg、5.85g/kg、1.95g/kg、41g/kg，末次给药后2h摘眼球取血，室温下静置4h，3000r/min离心15min，分离血清，同组血清混合，56℃水浴30min灭活补体，再用0.22μm微孔滤膜过滤细菌，
置于-80℃冰箱，备用。
[0041]
2、双荧光素酶报告基因测定法
[0042]
采用瞬时转染法，将tdo启动子的双荧光素酶质粒载体(gl-s-tdo)转染至hek-293t细胞，在转录水平筛选抑制tdo转录的显效药味。操作如下：将生长状态良好的hek-293t细胞接种于96孔板，设置阴性对照组和实验组。当细胞汇合度达60％时，将高质量的gl-s-tdo质粒(260nm/280nm＝1.8～2.0)按照endofectin
tm max转染试剂说明书进行转染。12h后，除去上清液，加入用培养液稀释的1％含药血清。继续培养36h后，取上清，按照secrete-pair
tm dual luminescence assay kit双荧光素酶检测试剂盒制备工作液，在多功能酶标仪中分别检测gluc和seap的荧光值，计算gluc/seap的发光强度的比率。
[0043]
测量结果如图1所示，gl-s-tdo组与空载质粒(gl-s组)相比具有显著性，证明tdo2启动子在hek-293t细胞中有很强的转录活性；白芍(pae)、陈皮(cit)、枳壳(aur)、川芎(lig)及全方(csgs)的含药血清与空白血清(vt)相比有显著性，其中白芍和枳壳含药血清对tdo2启动子转录活性的抑制效果最强。
[0044]
3、计算机辅助分子对接法筛选tdo抑制剂
[0045]
借助计算机分子对接进行虚拟筛选，从tcmsp数据平台查询白芍、枳壳的活性成分，以类药性(dl≥0.18)原则和口服生物利用度(ob≥30％)作为筛选条件，筛出18种成分(表1)。
[0046]
表1活性成分信息表
[0047]
[0048][0049]
再从pubchem数据库下载2d结构，保存为“sdf”格式，作为小分子配体；利用chem 3d软件生成3d结构并以最小自由能进行优化；从pdb数据库下载核心靶点对应蛋白的3d结构(图2)，保存为“pdb”格式，作为蛋白受体。利用pymol 2.4软件对蛋白受体进行去除水分子、小分子配体等预处理。然后采用autodocktools软件对蛋白受体进行加氢，保存为“pdbqt”格式，将小分子配体也保存为“pdbqt”格式。确定蛋白的活性口袋位置，并采用autodock vina软件进行分子对接，利用pymol 2.4软件进行可视化分析，自由能最低的结合则越稳定。
[0050]
实验结果由表2所示，与受体关联度最高的前三化合物分别是芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷，说明芍药苷类活性成分与htdo受体能进行自发结合，且具有较好的结合性能。
[0051]
表2配体分子与htdo蛋白分子对接结果
[0052][0053][0054]
4、分子垂钓法
[0055]
(1)构建tdo酶-磁珠(htdo-mbs)固定相载体：选择商业化的羧基磁珠为载体固定tdo酶，构建得到的tdo酶-磁珠(htdo-mbs)固定相载体的流程如图3所示，使用1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)对羧基磁珠进行活化，即用磁力分离器将磁珠从上清液中分离出来，用200μl吗啉乙磺酸缓冲溶液(mest：100mm,ph 5.0,0.05％tween 20)进行磁性分离洗涤3次，移除上清液。向装有磁珠的离心管中依次加
入100μl edc溶液(10mg/ml)和100μl nhs溶液(10mg/ml)，涡旋混匀后于垂直混合仪上25℃活化30min；取下离心管，磁性分离后移除上清液，加入500μl htdo蛋白溶液，轻柔混匀后于垂直混合仪上常温偶联2h后放4℃冰箱静置过夜；次日，磁分离后移除上清液，加入200μl pbst溶液，涡旋混匀，于垂直混合仪上25℃封闭60min，磁分离后移除上清液，用200μl pbs溶液(ph 7.2)洗涤磁珠，重复3次，使磁珠重新悬浮于1ml pbs缓冲液中，4℃保存备用。
[0056]
(2)tdo酶-磁珠的活性检测：利用傅里叶变换红外光谱仪进行表征，使用空白磁珠(mag cooh beads)作对照，将不含保存液的空白磁珠试样用kbr晶片压片制样，采用傅里叶变换红外光谱仪扫描，测试范围为4000-400cm-1，分辨率4cm-1，扫描次数为32，纵坐标为透过率％t。实验组制片同上，压片后滴加1滴tdo酶-mag cooh磁珠结合物进行测样。
[0057]
检测结果如图4所示，表明tdo酶-磁珠构建成功。
[0058]
(3)tdo酶-磁珠配体垂钓验证：利用tdo酶的阳性抑制剂lm10对固定相载体的配体垂钓能力进行验证。用5％dmso制备5mm lm10标准品(s0)；取上述制备好的htdo-mbs置于磁分离架上，移除上清液，加入50μl lm10溶液，混合均匀后于垂直混合仪上25℃孵育3h，磁分离移除上清液保存(s1)；用pbs缓冲液(ph 7.2)对htdo-mbs连续清洗3次，每次200μl，收集合并每次的上清液(w1)；用含有50％(v/v)乙腈的pbs缓冲液对htdo-mbs连续解离3次，每次200μl，收集合并每次的上清液(e1)；将各批次上清液过滤后进样超高效液相色谱系统(岛津lc-30ad)进行分析。
[0059]
uplc色谱条件如下：色谱柱：shim-pack scepter c18-120(2.1
×
150mm，3μm，shimadzu)；检测波长：254nm；流动相：a为0.1％甲酸水，b为乙腈；流速：0.3ml/min；进样量：2μl；梯度洗脱条件：0-10min(5％-95％b)，10-13min(95％-95％b)；13-18min(95％-5％b)。
[0060]
结果如图5所示，表明固定相载体的配体垂钓能力良好，能成功垂钓出lm10。
[0061]
同理，选择白芍水煎液进行亲和配体垂钓，结果如图6所示，最终确定与tdo特异性结合的活性成分为芍药苷。
[0062]
实施例2tdo过表达细胞模型的建立及鉴定
[0063]
将重组慢病毒载体(ex-c0452-lv201-tdo2)、辅助包装质(ph1、ph2)粒按照慢病毒包装试剂盒说明书配制转染混合液，加入提前培养好的hek 293t细胞培养皿中，分别收集48h和72h离心后的细胞培养上清。用上述病毒液感染正常hepg2细胞，48h时后置荧光显微镜下观察egfp表达，检验病毒活力。
[0064]
检测结果如图7所示，荧光显微镜下可见满视野有80％以上细胞发出绿色荧光，表明此时tdo2过表达hepg2细胞株构建成功。
[0065]
同时采用rt-qpcr检测过表达细胞中tdo2 mrna表达水平；western blot检测过表达细胞中tdo2蛋白表达水平；lc-ms/ms检测过表达细胞中5-ht、kyn的含量。
[0066]
(1)tdo mrna表达的鉴定：从培养箱中收集细胞，先trizol法提取总rna，接着反转录为cdna，qrt-pcr反应体系如表3，反应程序：37℃加热15min，再升温至85℃加热5s，后降温至4℃，完成逆转录。目的基因的引物序列如表4，以gapdh作为内参基因，采用2-δδct
法计算tdo mrna的相对表达。
[0067]
表3逆转录反应所需混合体系(10μl)
[0068][0069]
表4目的基因的引物序列
[0070][0071][0072]
鉴定结果如表5所示，与空白对照及阴性对照(nc)组相比，tdo2稳转过表达hepg2细胞(tdo oe)的tdo2 mrna表达显著上升(p＜0.001)。
[0073]
表5 hepg2细胞tdo2 mrna表达情况(n＝3)
[0074][0075]
注：与control组相比，**p《0.01；与nc组相比，##p《0.01
[0076]
(2)tdo蛋白表达的鉴定：加入细胞裂解液提取细胞中的总蛋白，采用bca法测定蛋白浓度。蛋白按4：1加入5
×
蛋白上样缓冲液，沸水浴变性10min。冷却后，将样品加入电泳孔中，浓缩胶电压80v，分离胶电压110v进行sds-page电泳。采用湿转法转膜。将转好的膜于室温下脱色，加入5％脱脂奶粉的封闭液(配制液为1
×
tbst：含0.1％聚山梨酯-20的1
×
tbs)，摇床振摇封闭2h。加入一抗，4℃孵育过夜，次日清晨用1
×
tbst缓冲液洗膜10min，重复3次，采用的抗体信息如表6所示。加入二抗室温孵育60min，二抗弃去后用1
×
tbst缓冲液洗膜10min，重复3次。ecl显影后将胶片进行扫描存档，所得图片采用imagej软件对蛋白条带进行灰度分析。以目的条带与gapdh条带的灰度比值作为目的蛋白的相对表达水平。
[0077]
表6抗体信息
[0078][0079]
hepg2细胞tdo酶蛋白表达情况如表7和图8所示，与空白对照及阴性对照组相比，tdo oe组的tdo酶蛋白表达显著上升，差异具有统计学意义(p＜0.001)。
[0080]
表7hepg2细胞tdo酶蛋白表达情况(n＝3)
[0081][0082]
注：与正常组相比，**p《0.01；与阴性对照组相比，#p《0.05。
[0083]
(3)tdo催化产生代谢产物的鉴定：分别设置空白对照组、阴性对照组和tdo2过表达组，以相同的密度接种于6孔板；次日每孔加入含100μm l-色氨酸底物的新鲜培养基培养24h；300μl pbs刮取细胞后，超声粉碎2min；等体积预冷乙腈沉淀蛋白，高速离心取上清，加入5μl内标茶碱(9μg/ml)。标曲样品制备同以上操作，另加入10μl系列标准溶液(表8)。涡旋离心干燥，lc/ms/ms法检测前用0.1％甲酸-水复溶。
[0084]
表8系列标准溶液浓度
[0085][0086]
lc/ms/ms色谱条件：色谱柱：waters xselect hsst3 column(2.1
×
100mm，2.5μm)；色谱柱温度：30℃；流动相：a为0.1％甲酸-水溶液，b为0.1％甲酸-乙腈溶液；流速：0.2ml/min；梯度洗脱条件：0.0-0.5min(5％b)，0.5-5min(5％
→
15％b)，5-7min(15％
→
50％b)，7-10min(50％
→
90％b)，10-11min(90％b)，11-12min(90％
→
5％b)，12-17min(5％b)。
[0087]
质谱条件：电喷雾(esi)离子源；离子源温度300℃；质量扫描范围m/z100-1000；锥孔气和去溶剂气均为氮气，流速分别为5l/min和11l/min，其中去溶剂气温度为300℃。正离子模式下毛细管电压为3500v，喷嘴电压为500v。每种分析物的母离子和产物离子质谱参数的m/z值如表9所示。
[0088]
表9真实分析物、替代分析物和内标(is)的质谱条件
[0089][0090]
hepg2细胞中5-ht和kyn的表达情况如下表10和11所示，空白对照及阴性对照组比较，tdo2稳转过表达hepg2细胞的色氨酸代谢产物5-ht明显下降(p《0.001)，kyn则显著升高(p《0.001)。
[0091]
表10 hepg2细胞中5-ht表达情况(n＝3)
[0092][0093]
注：与正常组相比，*p《0.05；与阴性对照组相比，#p《0.05。
[0094]
表11 hepg2细胞中kyn表达情况(n＝3)
[0095][0096]
[0097]
注：与正常组相比，*p《0.05；与阴性对照组相比，#p《0.05。
[0098]
(4)tdo酶活性的鉴定：分别设置空白对照组、阴性对照组和tdo2过表达组，以相同的密度接种于10cm平皿中，次日细胞超声裂解，加入一定量的色氨酸底物至终浓度为30μm，一定量终浓度为2μm的血红素，涡旋混匀；混合液分为等量两份，一份直接加入终浓度为0.99μm的三氯乙酸作为对照组；另一份作为孵育样品：37℃水浴60min后加入终浓度为0.99μm的三氯乙酸，再于65℃水浴加热15min。测定kyn浓度的标曲样品同对照组操作，另加入10μl kyn-d4的系列标准溶液(浓度为0.625，1.25，2.5，5，10，20，40，60μg/ml)。以上样品均涡旋离心，取上清真空干燥，lc/ms/ms法检测前用流动相0.1％甲酸-水复溶。lc/ms/ms测定条件同上。
[0099]
实验结果如表12所示，与正常组组和nc组相比，tdo慢病毒载体转染hepg2细胞后，tdo酶活性明显增强(p《0.001)。
[0100]
表12 hepg2细胞中tdo的酶活性水平(n＝3)
[0101][0102]
注：与正常组相比，*p《0.05；与阴性对照组相比，#p《0.05。
[0103]
以上rt-pcr、western blot、lc/ms/ms及酶活性实验结果均证明己成功建立tdo过表达细胞模型。
[0104]
实施例3细胞水平上验证候选化合物的tdo抑制活性
[0105]
采用cck-8法确定不同浓度药物溶液的hepg2细胞毒性，结果如表13和图9所示，当芍药苷浓度在≤100μg/ml，芍药内酯苷浓度≤300μg/ml，苯甲酰芍药苷≤100μg/ml范围时，细胞存活率在90％以上，说明在这些浓度范围内的药物对细胞增长无影响。
[0106]
表13细胞细胞存活率(mean
±
sd，n＝6)
[0107][0108][0109]
采用tdo2过表达hepg2细胞，经芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷和阳性药lm10干预后，再进行western blot检测细胞中tdo蛋白表达情况，检测步骤同实施例2所示，结果如表14和图10所示，发现芍药苷、芍药内酯苷和lm10均能降低tdo蛋白表达，以芍药苷降低
效果最为显著。
[0110]
表14各组细胞tdo蛋白表达情况(n＝3)
[0111][0112]
注：与正常组相比，*p《0.05；与tdo oe组相比，#p《0.05。
[0113]
实施例4芍药苷对肝郁证小鼠体态及行为学的影响
[0114]
1、肝郁证实验动物造模与给药
[0115]
实验前先对小鼠进行完全随机化分组，按照三联一复合应激法(具体方法参考文献：龚彦溶,梁晓霞,王术玲.肝胃不和型功能性消化不良小鼠模型的建立[j].中药药理与临床,2020,36(01):218-222.doi:10.13412/j.cnki.zyyl.2020.01.036.)复制肝郁证小鼠模型(mdd)，于造模第31天起，在给予刺激的同时，连续灌胃给药7天。给药剂量分别为芍药苷组160mg/kg/d(生理盐水溶解)，lm10组160mg/kg/d(0.5％cmc-na溶解)，正常组和mdd组则给予等量0.9％生理盐水。
[0116]
2、芍药苷对肝郁证小鼠体态及行为学的影响
[0117]
与正常组相比，肝郁证小鼠造模30d后体型瘦小、食欲减退、精神倦怠不爱活动，毛发黄、干枯无光泽，如图11所示。经芍药苷或lm10给药后，小鼠体重增长、毛发光亮，强迫游泳和悬尾不动时间延长，抑郁样状态明显改善，各组小鼠体重变化趋势如图12所示。
[0118]
(1)小鼠悬尾实验：具体方法参照文献：han x,wu h,yin p,et al.electroacupuncture restores hippocampal synaptic plasticity via modulation of 5-ht receptors in a rat model of depression[j].brain research bulletin,2018,139:256-262，用胶布固定小鼠尾部，头部向下悬挂，使小鼠可以挣扎但无法逃脱，拍摄记录小鼠6min内活动，记录后5min静止不动的时间。
[0119]
结果由下表15所示，造模结束后，与正常组相比，mdd组悬尾不动时间明显延长(p《0.01)，给药芍药苷和lm10治疗后悬尾不动时间减少(p《0.05)。
[0120]
表15悬尾实验(n＝6)
[0121][0122]
注：与正常组相比，**p《0.01；与mdd组相比，#p《0.05。
[0123]
(2)小鼠强迫游泳实验：将小鼠放入装水的圆形烧杯中，小鼠无法触碰烧杯底部，拍摄小鼠在烧杯中6min游泳时间，记录后5min静止不动时间(具体方法参照文献：han x,wu h,yin p,et al.electroacupuncture restores hippocampal synaptic plasticity via modulation of 5-ht receptors in a rat model of depression[j].brain research bulletin,2018,139:256-262.)。
[0124]
结果如表16所示，与正常组相比，mdd组游泳不动时间明显延长(p《0.01)。与mdd组相比，给药芍药苷和lm10治疗后游泳不动时间均明显缩短(p《0.05)。
[0125]
表16强迫游泳实验(n＝6)
[0126][0127]
注：与正常组相比，**p《0.01；与mdd组相比，#p《0.05。
[0128]
实施例5芍药苷对实验动物肝组织tdo表达的影响
[0129]
将mdd小鼠分别经芍药苷和lm10给药干预后，取材，进行样品前处理。剪取约50mg肝脏组织，以trizol法通过研磨、离心、抽提出提取总rna。吹干，残渣加40μl depc水复溶，55℃水浴3min使其完全溶解。具体检测方法同实施例2。
[0130]
肝脏中tdo mrna表达情况如下表17所示，与空白组相比，mdd组tdo mrna表达显著升高(p《0.001)，与mdd组相比，芍药苷和lm10均可显著降低tdo mrna表达(p《0.01，p《0.001)。
[0131]
表17肝组织中tdo的基因表达情况(
±
s，n＝6)
[0132][0133]
注：与正常组相比，**p《0.01；与mdd组相比，#p《0.05，##p《0.01。
[0134]
再进行western blot检测tdo酶蛋白表达实验，具体方法同实施例2。结果如表18和图13所示，与正常组比较，mdd组小鼠肝脏中的tdo酶表达显著升高(p《0.01)，给药芍药苷和lm10后均能明显下调tdo酶蛋白表达(p《0.01)。
[0135]
表18肝组织中tdo蛋白表达情况(n＝6)
[0136][0137]
注：与正常组相比，**p《0.01；与mdd组相比，#p《0.05，##p《0.01。
[0138]
实施例6芍药苷对实验动物肝组织中色氨酸代谢产物的影响
[0139]
检测实验动物肝组织中色氨酸代谢产物方法同实施例2，根据统计学分析结果表19和表20显示：在小鼠肝脏中，mdd组较正常组5-ht/trp比值明显降低(p＜0.05)，kyn/trp则显著升高(p＜0.001)；与mdd组相比，给芍药苷和lm10均能上调肝脏中5-ht/trp的比值，且lm10组上调5-ht/trp比值更显著(p＜0.05)。
[0140]
表19肝组织中5-ht/trp表达情况(n＝6)
[0141][0142]
注：与正常组相比，**p《0.01；与mdd组相比，#p《0.05，##p《0.01。
[0143]
表20肝组织中kyn/trp表达情况(n＝6)
[0144][0145]
注：与正常组相比，***p《0.001；与mdd组相比，#p《0.05。
[0146]
综合上述实验结果可知，芍药苷具有显著抑制tdo表达及酶活性的作用，在肝郁证小鼠模型上表现出与lm10具有同样的药效作用，如表21所示，在动物造模后给药，从肝里的表达情况来看，芍药苷具有比阳性药更好的效果。因此，显示芍药苷类化合物对tdo具有抑制效果，可以用于结构类似化合物的合成和药物的研究，也可以用于治疗以tdo介导病理特征的疾病，如抑郁症、功能性消化不良、肠易激综合征、肿瘤、焦虑症等，具有良好的治疗前景。
[0147]
表21芍药苷和lm10对肝郁证小鼠检测指标显效性分析
[0148][0149][0150]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。