一种用于缓解自身免疫性疾病的益生菌粉及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种用于缓解自身免疫性疾病的益生菌粉及其应用，属于微生物技术领域和医药技术领域。


背景技术：

2.自身免疫性疾病是以机体自身反应性t细胞和b细胞过度活化，大量自身抗体产生，并引起多器官多系统广泛损伤为主要特征的慢性炎症性疾病，多发生于中老年人群。
3.20世纪40年代，以肠道菌群-肠关节轴为治疗靶向的治疗方案已得以应用。肠道菌群通过影响局部黏膜免疫的功能对全身免疫系统发挥作用，导致多种免疫性疾病的发病，尤其是因错误的识别并攻击自身组织而导致的自身免疫性疾病。国内外研究证实特定的肠道共生菌可以通过特定的分子模式诱导产生多种炎性细胞及炎性因子，从而调节肠黏膜屏障的完整性，影响黏膜免疫的功能，可以对多种自身免疫性疾病产生广泛影响。
4.针对于人体自身免疫性疾病的不同问题表现，临床上主要的方法是服用药物治疗，如抗风湿药、抗炎药等药物传统治疗，由于目前长期药物的服用，可能会造成抗药性治疗效果差，容易复发或其他病变的发生。


技术实现要素：

5.为了解决人体自身免疫性疾病的多种问题，如类风湿性关节炎、胶原诱导的关节炎(cia)、溃疡性结肠炎、炎症性肠病等表现，依据现有临床及研究者发现结果，提出了一种用于缓解自身免疫性疾病的益生菌粉及其应用，具体如下：
6.本发明提供了一种用于缓解自身免疫性疾病的益生菌粉，由长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041、两歧双歧杆菌bgn4、双重益生元、维生素和矿物质组成；所述长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041和两歧双歧杆菌bgn4为主要调节成分，双重益生元、维生素和矿物质为辅助调节成分，两者相互配合，起到人体自身免疫性疾病症状的缓解作用。其中：所述双重益生元包括低聚果糖和低聚半乳糖，维生素包括维生素a、维生素c和维生素e，矿物质包括钙、铁和锌。
7.在本发明的一种实施方式中，按照每袋2g的添加量计，上述益生菌粉各成分添加量如下所示：
8.长双歧杆菌rapo 50亿cfu/袋(按活菌数计)
9.干酪乳杆菌ibs041 50亿cfu/袋(按活菌数计)
10.两歧双歧杆菌bgn4 50亿cfu/袋(按活菌数计)
11.低聚果糖5.5mg/袋
12.低聚半乳糖3mg/袋
13.维生素a 34μg/袋
14.维生素c 4.5mg/袋
15.维生素e 0.36mg/袋
16.钙20mg/袋
17.铁0.44mg/袋
18.锌0.36mg/袋
19.在本发明的一种实施方式中，上述益生菌的冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤：
20.1)将长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041和两歧双歧杆菌bgn4分别划线于mrs固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落。
21.2)挑取单菌落分别接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养24～48h进行活化，得到一级种子液。
22.3)将一级种子液按接种量为3％(v/v)分别转接至种子培养基中得到二级种子液，培养条件为37℃，培养24～48h。
23.4)将二级种子液分别接入发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为3％(v/v)，培养条件为35～37℃，培养24～48h。
24.5)待发酵液中菌体密度达到108～109cfu/ml，分别收集发酵液；将所述发酵液分别离心收集菌体。
25.6)收集菌体后分别用冻干保护剂重悬，得到重悬液。
26.7)将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041和两歧双歧杆菌bgn4的冻干菌粉。
27.在本发明的一种实施方式中，所述培养基为mrs培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、葡萄糖20g、乙酸钠2g、酵母浸粉5g、柠檬酸氢二铵2g、k2po4·
3h2o 0.4g、mgso4·
7h2o 0.2g、mnso40.05g、吐温80 1ml、琼脂15g，ph调至6.2～6.3。
28.在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂按重量百分比计由以下成分制成：脱脂奶粉15％、海藻糖6％、甘油4％和木糖醇1.5％。
29.在本发明的一种实施方式中，上述益生菌粉的制备方法，包括如下步骤：
30.1)分别取长双歧杆菌rapo的冻干粉50亿cfu、干酪乳杆菌ibs041的冻干粉50亿cfu和两歧双歧杆菌bgn4的冻干粉50亿cfu后混合。
31.2)向上述益生菌冻干菌粉混合物中依次加入低聚果糖5.5mg、低聚半乳糖3mg、维生素a 34μg、维生素c 4.5mg、维生素e 0.36mg、钙20mg、铁0.44mg和锌0.36mg，搅拌均匀，充分混合后分装至袋装即得益生菌粉，所述袋装选用密封性好、安全的食品级pe包装材质，规格为2g。
32.在本发明的一种实施方式中，上述益生菌粉的用法用量为：
33.所述益生菌粉对于患有自身免疫性疾病的中老年人均适用。食用建议为：每天两袋，用温度低于37℃的水冲饮或直接食用，饭后半个小时内食用更佳。
34.若服用抗生素期间，建议先用抗生素，间隔2～3小时再用益生菌粉。
35.本发明还提供了一种用于缓解自身免疫性疾病的益生菌粉在在缓解自身免疫性疾病表现上的应用。
36.本发明的有益效果在于：
37.1)本发明提供了一种用于缓解自身免疫性疾病的益生菌粉及其应用，由长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041、两歧双歧杆菌bgn4、双重益生元、维生素和矿物质组成，能够缓解人体自身免疫性疾病症状，具体体现在：这一益生菌粉可改善类风湿性关节炎、减轻胶原
诱导的关节炎(cia)、溃疡性结肠炎、炎症性肠病等问题，补充微量营养素。因此含有长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041和两歧双歧杆菌bgn4的益生菌粉在缓解人体自身免疫性疾病表现上具有很大的应用前景。
38.2)本发明中的长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041是从健康的人体肠道和粪便中分离出来的，两歧双歧杆菌bgn4是从健康的母乳喂养婴儿的粪便中分离出来的。本发明中的双重益生元、维生素和矿物质的搭配加入，符合国家gb/t 29602-2013及gb 14880-2012允许添加量。因此，本发明的益生菌粉对人体而言，健康且无毒副作用。
具体实施方式
39.本发明提供了一种用于缓解自身免疫性疾病的益生菌粉，由长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041、两歧双歧杆菌bgn4、双重益生元、维生素和矿物质组成；所述长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041和两歧双歧杆菌bgn4为主要调节成分，双重益生元、维生素和矿物质为辅助调节成分；其中：所述双重益生元包括低聚果糖和低聚半乳糖，维生素包括维生素a、维生素c和维生素e，矿物质包括钙、铁和锌。
40.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
41.下述实施例中涉及的培养基如下：
42.mrs培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、葡萄糖20g、乙酸钠2g、酵母浸粉5g、柠檬酸氢二铵2g、k2po4·
3h2o 0.4g、mgso4·
7h2o 0.2g、mnso40.05g、吐温80 1ml、琼脂15g，ph调至6.2～6.3。
43.实施例1长双歧杆菌rapo冻干菌粉的制备
44.1)长双歧杆菌rapo划线于mrs固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落。
45.2)挑取单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养24～48h进行活化，得到一级种子液。
46.3)将一级种子液按接种量为3％(v/v)分别转接至种子培养基中得到二级种子液，培养条件为37℃，培养24～48h。
47.4)将二级种子液分别接入发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为3％(v/v)，培养条件为35～37℃，培养24～48h。
48.5)待发酵液中菌体密度达到108～109cfu/ml，分别收集发酵液；将所述发酵液分别离心收集菌体。
49.6)收集菌体后用冻干保护剂重悬(冻干保护剂按重量百分比计由以下成分制成：脱脂奶粉15％、海藻糖6％、甘油4％和木糖醇1.5％)，得到重悬液。
50.7)将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到长双歧杆菌rapo冻干菌粉。
51.实施例2干酪乳杆菌ibs041冻干菌粉的制备
52.1)干酪乳杆菌ibs041划线于mrs固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落。
53.2)挑取单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养24～48h进行活化，得到一级种子液。
54.3)将一级种子液按接种量为3％(v/v)分别转接至种子培养基中得到二级种子液，
培养条件为37℃，培养24～48h。
55.4)将二级种子液分别接入发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为3％(v/v)，培养条件为35～37℃，培养24～48h。
56.5)待发酵液中菌体密度达到108～109cfu/ml，分别收集发酵液；将所述发酵液分别离心收集菌体。
57.6)收集菌体后用冻干保护剂重悬(冻干保护剂按重量百分比计由以下成分制成：脱脂奶粉15％、海藻糖6％、甘油4％和木糖醇1.5％)，得到重悬液。
58.7)将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到干酪乳杆菌ibs041冻干菌粉。
59.实施例3：两歧双歧杆菌bgn4冻干菌粉的制备
60.1)两歧双歧杆菌bgn4划线于mrs固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落。
61.2)挑取单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养24～48h进行活化，得到一级种子液。
62.3)将一级种子液按接种量为3％(v/v)分别转接至种子培养基中得到二级种子液，培养条件为37℃，培养24～48h。
63.4)将二级种子液分别接入发酵培养基中进行高密度发酵，接种量为3％(v/v)，培养条件为35～37℃，培养24～48h。
64.5)待发酵液中菌体密度达到108～109cfu/ml，分别收集发酵液；将所述发酵液分别离心收集菌体。
65.6)收集菌体后用冻干保护剂重悬(冻干保护剂按重量百分比计由以下成分制成：脱脂奶粉15％、海藻糖6％、甘油4％和木糖醇1.5％)，得到重悬液。
66.7)将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到两歧双歧杆菌bgn4冻干菌粉。
67.实施例4益生菌粉的制备
68.按照每袋2g的添加量计，益生菌粉各成分添加量如下所示：
69.长双歧杆菌rapo 50亿cfu/袋(按活菌数计)
70.干酪乳杆菌ibs041 50亿cfu/袋(按活菌数计)
71.两歧双歧杆菌bgn4 50亿cfu/袋(按活菌数计)
72.低聚果糖5.5mg/袋
73.低聚半乳糖3mg/袋
74.维生素a 34μg/袋
75.维生素c 4.5mg/袋
76.维生素e 0.36mg/袋
77.钙20mg/袋
78.铁0.44mg/袋
79.锌0.36mg/袋
80.上述益生菌粉的制备方法，包括如下步骤：
81.1)分别取长双歧杆菌rapo的冻干粉50亿cfu、干酪乳杆菌ibs041的冻干粉50亿cfu和两歧双歧杆菌bgn4的冻干粉50亿cfu后混合。
82.2)向上述益生菌冻干菌粉混合物中依次加入低聚果糖5.5mg、低聚半乳糖3mg、维生素a 34μg、维生素c 4.5mg、维生素e 0.36mg、钙20mg、铁0.44mg和锌0.36mg，搅拌均匀，充
分混合后分装至袋装即得益生菌粉，所述袋装选用密封性好、安全的食品级pe包装材质，规格为2g。
83.实施例5安全性试验
84.1.通过评估血细胞的溶血，粘蛋白降解，氨的产生，生物胺的产生，抗菌药的敏感性分析，抗生素耐药性的可转移性，抗生素抗性基因的pcr数据，基因组稳定性以及是否具有毒力因子/致病基因等多方面试验，对长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041及两歧双歧杆菌bgn4的安全性进行评估。
85.2.试验结果
86.1)三株菌均不显示溶血活性也不显示粘蛋白降解活性，没有发现生产氨的现象。
87.2)三株菌不生产5-戊二胺、组胺、酪胺，产生少量的腐胺，其含量与其他食物(例如菠菜，番茄酱，青豆，酸菜和香肠)相似或更低。
88.3)三株菌对庆大霉素及四环素的耐药性(敏感性)高于欧洲食品安全局(efsa)的临界值。
89.4)在pcr分析研究中，未发现菌株的抗性基因。
90.5)三株菌对抗生素的耐药性均未通过与基因片段结合而转移。
91.6)三株菌株的整个基因组序列已在genbank中公开。
92.7)三株菌均不含有已知的产毒素基因和致病基因。
93.实施例6益生菌粉的安全性检测
94.1.检测依据及方法
95.根据食品安全国家标准食品中污染物限量gb 2762-2017、食品微生物学检验(菌落总数测定gb 4789.2-2016、大肠杆菌计数gb 4789.3-2016、沙门氏菌检验gb 4789.4-2016、霉菌gb 4789.15-2016)等标准方法对益生菌粉进行安全性检测。
96.2.检测结果
97.采用冷冻干燥微囊三层包埋技术制得的一种用于缓解自身免疫性疾病的益生菌粉，其色泽为米黄色粉末，无正常视力可见的外来异物、无结块、无异味、无臭。且污染物铅、锡检测结果不活跃，菌落总数、大肠杆菌、沙门氏菌、霉菌检测结果均通过。
98.实施例7具体病例
99.病例1：患者男，48岁，主诉：类风湿性关节炎病史5年，多处关节肿痛，双膝关节肿胀疼痛明显，一直坚持服用抗风湿药缓解症状。食用本发明制备的益生菌粉，一次2袋，食用方法为将益生菌溶解在37℃左右温开水中，搅拌至完全溶解，饭后半小时内早晚各食用一次，外出时直接食用。连续食用6个月，随访1年内，关节疼痛情况有所缓解，频率减少。
100.病例2：患者女，42岁，主诉：胶原诱导的关节炎(cia)病史3年，双腕双手指关节肿胀疼痛、双髋关节疼痛，活动受限，停止服药后反反复复发生关节疼痛症状。食用本发明制备的益生菌粉，一次2袋，食用方法为将益生菌溶解在37℃左右温开水中，搅拌至完全溶解，饭后半小时内早晚各食用一次，外出时直接食用。连续食用3个月，随访6个月内，天气变换时，关节肿胀疼痛的程度有所改善。
101.病例3：患者男，36岁，主诉：反复发作腹泻腹痛，粪便性状个体差异极大，软便，稀糊状，纯粘液便不一，偶有便质粘液脓血便，经检查为“溃疡性结肠炎”。食用本发明制备的益生菌粉，一次2袋，食用方法为将益生菌溶解在37℃左右温开水中，搅拌至完全溶解，饭后
半小时内早晚各食用一次，外出时直接食用。连续食用6个月，随访1年内，粪便性状正常，无血便出现。
102.病例4：患者女，37岁，主诉：排便困难、排便不畅，腹块、恶心，时常伴有发生呕吐现象，经检查初步判定为“炎症性肠病”。食用本发明制备的益生菌粉，一次2袋，食用方法为将益生菌溶解在37℃左右温开水中，搅拌至完全溶解，饭后半小时内早晚各食用一次，外出时直接食用。连续食用3个月，排便正常，腹部无明显的堆积腹块。结果均通过。
103.实施例8临床试验
104.1.研究对象
105.选择30～50岁患有炎症性肠病问题的20名女性患者。10名患者被分配到治疗组，其余10名患者被分配到安慰剂组。
106.2.治疗方法
107.治疗组为食用本发明制备的益生菌粉2袋，安慰剂组为不含益生菌的等量益生元组合(安慰剂包，低聚半乳糖+低聚果糖)，在视觉上与益生菌包无区别。每位患者需在饭后30分钟内食用，每天两次，共持续3个月。记录治疗期间的排便情况(频率、形状、排便量)、腹部疼痛频次的变化。
108.3.效果评判标准
109.以治疗期间前后排便情况(频率、形状、排便量)、腹部疼痛频次变化的情况来评判效果。有效：痊愈或2种问题有所改善好转；无效：治疗前后2个问题情况持续发生，无明显好转趋势及变化。
110.4.统计学方法
111.进行配对t检验以评估两组患有炎症性肠病问题的定量变化：研究期间前后排便情况(频率、形状、排便量)、腹部疼痛频次。当p值《0.05时，结果被认为具有统计学意义。
112.5.试验结果
113.2组效果评价，结果见表1.
114.表1 2组效果评价
[0115][0116]
从表1中可以看出，采用本发明的益生菌粉在改善炎症性肠病问题方面具有显著效果，对排便情况与腹痛问题有显著改善效果。
[0117]
本发明提供了一种用于缓解自身免疫性疾病的益生菌粉及其应用，所述益生菌粉由长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041、两歧双歧杆菌bgn4、双重益生元、维生素和矿物质组成；能够缓解人体自身免疫性疾病症状，具体体现在：这一益生菌粉可改善类风湿性关节炎、减轻胶原诱导的关节炎(cia)、溃疡性结肠炎、炎症性肠病等问题，补充微量营养素。其中，长双歧杆菌rapo在类风湿性关节炎和抗炎效果方面得以验证；两歧双歧杆菌bgn4在改善溃疡性结肠炎问题上得到了临床数据验证；干酪乳杆菌ibs041和两歧双歧杆菌bgn4的联合使用在炎症性肠病等问题上得以应用。因此含有长双歧杆菌rapo、干酪乳杆菌ibs041和两歧双歧杆菌bgn4的益生菌粉在缓解人体自身免疫性疾病表现上具有很大的应用前景。
[0118]
以上所述，只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人
了解本发明内容并加以实施，本技术的保护范围并不受这些具体实施例的限制。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的技术思想和原理之内所作的任何修饰修改、等效变化、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。