一种RVG15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体及其制备方法和应用

本发明属于医药，具体涉及一种rvg肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体的制备方法和应用。

背景技术：

1、脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，预后差且易复发，严重威胁人类生命安全。目前临床上治疗脑胶质瘤主要采用手术的方式切除癌变组织，同时辅以化疗、放疗进行术后维持治疗，杀死残存的肿瘤细胞，以延长患者的生存时间。然而由于血脑屏障的存在，化疗药物普遍面临因透过血脑屏障效率低而发挥药效不理想的状况，并伴有全身毒副作用大等问题。因此，通过巧妙的设计脑靶向性药物载体以提高化疗药物透过血脑屏障效率，改变化疗药物在体内的分布，减少系统性毒性，对脑胶质瘤的治疗具有重要意义。

2、金属有机框架材料(mofs)是一类新型多孔性纳米材料，近年来在药物装载和输送方面领域的运用备受关注。与传统的纳米材料相比，mofs材料具有多孔性，较大的比表面积，对化疗药物可实现较高的载药量。同时mofs材料由金属离子与有机配体通过配位键构成，具有优秀的化学稳定性和物理稳定性，可避免药物在血液循环过程中早泄或突释。沸石咪唑骨架-8(zeolitic imidazolate frameworks-8,zif-8)是最具有代表性的一种mofs材料，其骨架结构是由二甲基咪唑中的n原子与金属zn离子通过配位键相连构成的四面体结构。除了具备mofs的固有优势外，zif-8具有灵敏的ph敏感性，其结构在中性生理条件下可以高度稳定，而进入肿瘤细胞的内涵体/溶酶体环境中可以发生分解，可以实现负载药物在肿瘤部位的可控、精准释放，满足新型纳米载药体系在载药量、稳定性及药物释放等多方面的要求。因此，选择金属有机框架材料zif-8作为化疗药物的载体材料构建纳米载药体系，实现其减毒增效治疗。

3、一种高效的脑靶向性药物载体一般应该具备几个典型特征:脑部转运的血脑屏障(blood brain barrier，bbb)通透性高、脑靶向性好、生物安全性高等特点。狂犬病毒衣壳糖蛋白(rabies virus glycoprotein，rvg)是唯一暴露在狂犬病毒膜外的一种结构蛋白，在狂犬病毒的透过血脑屏障和侵袭脑组织过程中发挥重要作用。rvg可以作为一种关键配体，其介导狂犬病毒与内源性受体结合，继而通过受体介导的转胞吞(receptor-mediatedtranscytosis，rmt)机制透过血脑屏障侵入脑组织。研究表明，rvg不仅可以使狂犬病毒侵入神经细胞，还能够携带其他病毒经突触逆行转移进入中枢神经系统(central nervoussystem，cns)。基于病毒能够进入神经系统的仿生原理，可将rvg用于协助治疗性药物分子透过血脑屏障快速进入脑内。rvg-29是狂犬病毒衣壳糖蛋白衍生的一种含有29个氨基酸序列的多肽，具有狂犬病毒衣壳糖蛋白相似的血脑屏障透过特征。rvg-29通过与血脑屏障上的乙酰胆碱受体进行特异性结合，协助治疗性化疗药物跨过血脑屏障进入脑部疾病病灶，因而被认为是一种高效的脑靶向材料。然而rvg-29具有结构过长、分子量高等特点，对所修饰的纳米粒的粒径具有不利影响，因而使其运用场景受限。本课题组前期对狂犬病毒衣壳糖蛋白衍生肽的氨基酸序列及对应的靶向功能进行考察，筛选出一种由15个氨基酸构成的短肽rvg-15。与rvg-29相比，rvg-15(序列ytiwcdiftnsrgkrc)的氨基酸序列较短，分子量更小，而且同时保持高效的脑靶向效率，并有利于缩小所制备的纳米粒粒径。本课题组前期构建了以rvg-15为靶头修饰的脑靶向载体递送核酸入脑，用以治疗脑胶质瘤，体外实验与体内实验均得到较好效果(黄伟.一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其应用：中国，201710277357.8[p].2017-4-25.)。本发明将该rvg-15修饰至羧基化的聚乙二醇中，构建rvg15-peg-cooh脑靶向偶联物，然后将rvg-peg通过正负电荷相互作用修饰在金属有机框架材料zif-8表面，制得脑靶向性金属有机框架药物载体。可包载递送传统化药入脑，对那些体外有效但体内难以跨越bbb的药物入脑治疗脑部疾病提供了一个种新方法。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是克服现有化疗药物难以透过血脑屏障的缺陷，提供一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽15(rvg15)修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体的制备方法和应用。

2、具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：

3、本发明的第一方面，首次提供了一种具有脑靶向功能的狂犬病毒衍生肽-羧基化聚乙二醇偶联物(rvg15-peg-cooh)，其中狂犬病毒衍生肽(rvg15)可通过n型乙酰胆碱受体介导跨血脑屏障，脑靶向效率与已报道的rvg-29相当，而分子量更小，有利于缩小所制备的纳米粒粒径。本课题组前期已经对rvg-15的氨基酸序列进行公开报道(黄伟.一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其应用：中国，201710277357.8[p].2017-4-25.)。狂犬病毒衍生肽-羧基化聚乙二醇偶联物(rvg15-peg-cooh)的结构如图(ⅱ)所示。其中rvg15的氨基酸序列可为d型或l型，优选l型。聚乙二醇的聚合度n为5～450，优选8～230，进一步优选18～115，更优选25～55，进一步更优选30～50，最优选40～45，进一步最优选45。r为羧酸基。

4、

5、本发明还提供了上述狂犬病毒衍生肽-羧基化聚乙二醇偶联物(rvg15-peg-cooh)的制备方法，其制备方法为：在peg-cooh末端引入马来酰亚胺基团(mal)，rvg15末端引入半胱氨酸(cys)，二者可通过迈克尔加成反应得到rvg15-peg-cooh，反应如图(iii)示。

6、

7、优选的制备方法如下：

8、(1)取摩尔比略大于1：1的rvg15-cys和mal-peg2000-cooh溶于ph为8的hepes，氮气保护下搅拌下常温反应18h。

9、(2)选用截留分子量为200-25000的透析袋进行透析，优选截留分子量为3000的透析袋。去离子水中透析，透析时间为12h。

10、(3)液体冷冻干燥后得到冻干粉备用，即得具有脑靶向功能的狂犬病毒衍生肽-羧基化聚乙二醇偶联物(rvg15-peg-cooh)。

11、本发明第二方面，首次提供了一种rvg15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体。其中脑靶向功能材料rvg15-peg-cooh。金属有机框架材料可为zif-8、uio-66-cooh或uio-66-nh2，优选zif-8。活性药物可为雷公藤甲素、阿霉素、丝裂霉素c、丝裂霉素c前药、丝裂霉素c衍生物、多西紫杉醇或羟基喜树碱，优选多西紫杉醇。

12、本发明还提供一种上述rvg15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体的制备方法，其制备方法为：将含金属盐的二甲基亚砜溶液与含配体的水溶液，混合反应，通过离心纯化即得金属有机框架材料；将金属有机框架材料分散至rvg15-peg-cooh脑靶向偶联物溶液中混合均匀，搅拌反应过夜后，离心纯化获得的固体即为rvg15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体。

13、当金属有机框架材料为zif-8时，优选的制备方法如下：

14、将80mg六水合硝酸锌溶于3ml二甲基亚砜中，加入含有800mg的二甲基咪唑水溶液7ml，室温反应30min，在15000rpm/min的转速下离心15min。然后用甲醇洗涤三次，即得金属有机框架材料zif-8。将10mg zif-8分散至浓度为0.4mg/ml的rvg15-peg-cooh偶联物5ml水溶液中，搅拌反应12h后，离心纯化获得的固体即为rvg15-peg@zif-8。

15、本发明还提供了rvg15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体包载活性药物的制备方法，载体可以通过简单一步包载法实现对化疗药物的包载，在形成金属有机框架材料过程中活性药物被荷载进入金属有机框架材料的孔隙中。其制备方法为：将抗肿瘤药物溶液加入金属盐的二甲基亚砜溶液中获得混合液，反应一段时间后，在搅拌条件下滴加含有配体的水溶液中形成混悬液，离心分离，洗涤，干燥得到固体。将固体分散至rvg15-peg-cooh偶联物水溶液中混合均匀，反应结束后离心分离，洗涤，干燥。rvg15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体对活性药物的载药量为5％-30％。

16、当金属有机框架材料为zif-8，抗肿瘤药物为多烯紫杉醇(dtx)时，其优选的制备方法为：

17、将5mg多烯紫杉醇、80mg六水合硝酸锌溶于3ml二甲基亚砜中，搅拌30min后。在室温条件下，向其中加入含有800mg的二甲基咪唑水溶液，反应30min后。通过15000rpm/min的转速离心15min。用甲醇洗涤三次，即得dtx@zif-8。将10mg dtx@zif-8分散至浓度为0.4mg/ml rvg15-peg-cooh偶联物5ml水溶液中，室温搅拌反应12h后，离心纯化获得的固体即为rvg15-peg@dtx@zif-8。

18、本发明还提供了rvg15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体在体外药物递送中的应用。其方法和步骤如下：

19、将载药脑靶向性有机金属骨架用培养液稀释成预定浓度的溶液。每个浓度设6个复孔，并设对照组和调零组。将适量对数生长期的大鼠神经胶质瘤c6细胞接种于96孔板中，继续培养24h后，介质以含有有机金属骨架溶液的新鲜培养液替换，分别继续培养24h或48h。每孔加入浓度为10％的cck-8试剂200μl。继续孵育2h，于450nm处测定吸收值，并以650nm为参考波长。计算细胞活力，公式如下：

20、细胞活力(％)＝[(od实验-od调零)/(od对照-od调零)]×100

21、本发明还提供了rvg15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体在体内治疗脑胶质瘤的运用。其方法和步骤如下：

22、取荷c6脑胶质瘤小鼠随机分为4组，每组5只，静脉注射载药脑靶向性有机金属骨架0.2ml，同时设置生理盐水、游离活性药物及无rvg15肽修饰的载药有机金属骨架作为对照组。每三天给药一次，给药5次后将小鼠用异氟烷麻醉，用小动物核磁成像仪观察脑部瘤的大小。

23、本发明的有益效果如下：

24、1、本发明制备的狂犬病毒衍生肽-羧基化聚乙二醇偶联物(rvg15-peg-cooh)，具有狂犬病毒衣壳糖蛋白相似的血脑屏障透过特征，而且分子量小，更有利于形成小粒径的纳米粒，便于实现脑靶向递送，同时具有合成工艺简单、生产成本低的优势。

25、2、本发明制备的rvg15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体，具有良好的血脑屏障穿透能力，生物相容性和血液长循环的功能，可解决荷载的活性药物难以入脑的瓶颈问题，为脑胶质瘤治疗提供了一种全新的方案。

26、3、本发明制备的rvg15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体，可用于包载多种无法跨血脑屏障的活性药物，对开发那些体外药理活性好，但体内无法跨bbb入脑发挥作用的传统药物提供了一个新途径。

27、4、本发明制备的rvg15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体，制备工艺简单、快速，稳定性和可重复性高。