竹笋生物炭在制备治疗糖尿病及其并发症药物中的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及竹笋生物炭在制备治疗糖尿病及其并发症药物中的应用


背景技术：

2.糖尿病(diabetes)是以慢性高血糖为特征的一组异质性代谢性疾病，与遗传、自身免疫和环境因素有关。因胰岛素分泌和(或)胰岛素作用缺陷，引起糖类、蛋白质和脂肪等代谢异常。长期病程可引起多系统损害，导致血管、心脏、神经、肾脏、眼等组织器官的慢性并发症，病情严重时可发生糖尿病酮症酸中毒和糖尿病高血糖高渗状态等急性并发症。
3.糖尿病的治疗是一个漫长的过程，其治疗方法很多，包括糖尿病中医治疗，西医治疗，胰岛素治疗等，总的治疗原则是通过改变生活方式，包括饮食控制、体育锻炼、减轻体重，不吸烟及避免二手烟对研发及控制糖尿病也有一定的效果，并配合一定的药物治疗，以达到控制血糖、预防并发症的目的。
4.肠道是人体消化吸收的重要场所，也是最大的排毒器官，在维持人体正常代谢与免疫功能中发挥着极其重要的作用。肠道微生物是人体代谢的重要参与者，为人类代谢过程提供底物、酶和能量；同时，肠道微生物还通过形成“菌膜屏障”而为人体提供保护功能。近年来，糖尿病患者人数不断增加，严重威胁人类身心健康，根据国际糖尿病联合会估计，到2045年预计全球糖尿病患者将达到7亿多人，其中大部分为2型糖尿病患者。2型糖尿病的发生及发展和肠道菌群有密切关系，肠道微生态环境失调可引起全身慢性低水平性炎症，进而导致肥胖和胰岛素抵抗，最终诱发2型糖尿病。
5.生物炭(biochar)是由生物质经热裂解反应过程后而形成的一种产物，因为具有极其丰富的多微孔碳架结构及较大表面积和不同种类的表面官能团、有机小分子、矿物盐等，被广泛应用于农业、环保、能源、医卫等领域，成为近年来科学研究新热点。大量研究表明，在农田土壤中施入不同农作物秸杆生物炭后，可显著提高土壤中微生物的丰度与多样性，改变土壤菌群结构，增加土壤中有益微生物，改善土壤理化性状，提高作物产量与品质；在饲料中添加竹炭，能改变肠道形态和微生物菌群结构，对促进鱼体健康和成长；在临床中，口服以竹等制成的药用生物炭片，联合其他药物，对治疗农药与食物药物中毒、各种原因引起的高磷血症、急慢性肾功能衰竭与高尿酸血症、尿毒症、高脂血症、糖尿病肾病、痛风、腹泻等病症具有较好治疗效果。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供竹笋生物炭在制备治疗糖尿病及其并发症药物中的应用。本发明的竹笋生物炭通过吸附长期高脂饮食后和肠道内有害菌细菌死亡溶解后释放细胞壁中脂多糖lps和其他有毒物质，从而防止肠道内的有害物质如细菌和内毒素穿过肠粘膜进入人体内其他组织、器官和血液循环；抑制脂多糖引发的炎症信号通路表达，进而控制炎症。
7.为达到发明目的，本发明采取如下技术方案：
8.竹笋生物炭在制备治疗糖尿病及其并发症药物中的应用。
9.所述的药物为能够吸附长期高脂饮食后和肠道内有害菌细菌死亡溶解后释放细胞壁中脂多糖lps和其他有毒物质；能促进肠道内双歧杆菌等有益菌的生长，进一步的，能增加肠道短链脂肪酸水平，营养肠道黏膜，使肠腔的粘膜层增厚，减少肠上皮细胞的凋亡，恢复常闭的完整性；从而维护正常的屏障功能，降低肠道通透性；进一步的，通过与肠上皮细胞的受体蛋白结合其超强的黏附能力，对肠上皮细胞进行占位、定植，形成一层保护膜，进而抑制有害菌的定植；进一步的，提高肠上皮紧密连接蛋白claudins、occludin和zo-1的表达，抑制zonulin表达，增加肠上皮细胞间紧密连接；从而维护正常的屏障功能，降低肠道通透性。
10.所述的药物为能显著提高肠道有益菌相对丰度。
11.所述的药物为防止肠道内的有害物质如细菌和内毒素穿过肠粘膜进入人体内其他组织、器官和血液循环。
12.所述的药物为抑制脂多糖引发的炎症信号通路表达。
13.所述的药物为解除炎症因子对胰岛素信号通路磷脂酰肌醇3激酶和c-jun氨基末端激酶抑制。
14.所述的药物为提高胰岛素水平，促进肝、骨骼肌等组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，合成糖原、脂肪、蛋白质，抑制脂肪，最终使代谢恢复正常。
15.所述的药物包括竹笋生物炭和药学上可接受的载体或常规食用辅料。
16.所述药物剂型为口服剂型。
17.本发明的竹笋生物炭的制备方法采用常规的炭化工艺，包括如下步骤
18.s1：取竹笋若干，洗净，分切成1-10cm直径或边长的小块；
19.s2：将竹笋小块放入120-200℃烘干箱中烘干；
20.s3：将烘干后的竹笋小块放入炭化锅在800℃高温下进行炭化炭化；
21.s4：将炭化后的竹笋小块经立式行星式球磨机磨成300-700纳米颗粒。
22.本发明的有益效果：本发明首次发现竹笋生物炭能显著提高肠道内有益菌相对丰度，对糖尿病及其并发症得到较好治疗，有可能成为未来治疗糖尿病要的有效药物。
附图说明
23.图1为各组小鼠肠道盲部新鲜内容物中otu数量与venn图；
24.图2为各组小鼠肠道盲部新鲜内容物中菌群ace指数及组间差异，其中*表示p《0.05，**表示p《0.0；
25.图3为各组小鼠肠道盲部新鲜内容物中菌群shannon指数及组间差异，其中*表示p《0.05；
26.图4为各组小鼠肠道盲部新鲜内容物中菌群nmds分析图；
27.图5为竹笋生物炭对db/db糖尿病模型小鼠肠道菌群结构门水平影响示意图；
28.图6为竹笋生物炭对db/db糖尿病模型小鼠肠道菌群结构属水平影响示意图。
具体实施方式
29.下面结合实施例对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
30.实施例
31.竹笋生物炭的制备
32.取竹500kg，洗净后，切成2cm小块，然后放入150℃烘干箱中烘干。烘干后笋块再放入炭化锅在800℃高温下进行炭化。炭化的竹炭用立式行星式球磨机(xqm－4)磨成300-700纳米颗粒。
33.db/db糖尿病小鼠
34.8周龄spf级雄性db/db糖尿病小鼠，雄性m/m对照(db的同窝野生对照)小鼠，由江苏常州卡文斯实验动物有限公司提供，许可证号：scxk(苏)2021-0010。小鼠饲养于浙江省中医药研究院实验动物中心25
±
2℃的屏障实验室内，许可证号：syxk(浙)2019-0010。
35.spf级8周龄雄性db/db小鼠(35-40g)，适应性喂养3天，随机测血糖，待血糖稳定且大于16.7mmol/l为模型小鼠，将达到模型标准的db/db小鼠随机分为药物组、模型对照组(水)及同龄m/m小鼠(20-24g)正常对照组，每组8只。模型对照组和正常对照组给予灌胃10.0ml/kg饮用水，药物组给予灌胃1.0g/kg竹笋生物炭，每组灌胃1次/d。
36.检测内容与方法
37.血糖
38.在db/db糖尿病小鼠灌胃竹笋生物炭后的1、2、3、4、5、6周时，各组小鼠禁食6h后从小鼠尾静脉取血，分别用血糖仪测定血糖(glu)。
39.脏器指数
40.在db/db糖尿病小鼠灌胃竹笋生物炭后的6周时，先对各组小鼠进行称重，然后麻醉并从各组小鼠股动脉取血，取完血后立即处死小鼠，并取脾脏、肾脏、肝脏、胸腺及心脏器官，分别称重，计算脏器指数，脏器指数＝脏器质量/(小鼠体质量
×
100)。
41.血清指标
42.从各组小鼠股动脉抽取的血在centrifuge 5810r型离心机(eppendorf公司)3000rpm转速下离心10min，收集血清。由南京建成生物科技有限公司提供糖化血清蛋白(gsp)含量测定试剂盒(批号20210928)、游离脂肪酸(ffa)测定试剂盒(批号20210916)分别测定血清中gsp和ffa含量，由武汉科赛博生物工程公司提供血清中胰岛素(ins)测定elisa试剂盒(批号k04010283)、血清瘦素(lep)测定elisa试剂盒(批号k21010685)、小鼠晚期糖基化终末产物(ages)测定elisa试剂盒(批号k22010686)检测血清中ins、lep、和ages)含量。
43.肾脏中抗氧化指标
44.取部分肾脏组织，按重量(g):体积(ml)＝1:9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，用眼科剪刀剪碎组织块，用t10型自动组织匀浆机(ika公司)匀浆，由南京建成生物科技有限公司提供的丙二醛(mda)测定试剂盒(批号20210928)、超氧化物歧化酶(sod)活力测定试剂盒(批号20210922)测定、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)测定试剂盒(批号20210924)测定、过氧化氢酶(cat)测定试剂盒(批号20210928)，用power wave xs型全波长酶标仪(gene公司)分别测定mda、sod、gsh-px、cat等肾脏中的抗氧化指标。
45.肠道菌群16srdna序列测序
46.样本收集
47.小鼠处死后，收集各组回盲部新鲜内容物于灭菌离心管中，液氮快速冷冻，标记后存于-80℃低温冰箱中。
48.dna抽提和pcr扩增
49.根据soil dna kit试剂盒(omega bio-tek,norcross,ga,u.s.)说明书进行微生物群落总dna抽提，使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna的提取质量，使用nanodrop2000测定dna浓度和纯度；使用338f(5
’‑
actcctacgggaggcagcag-3’)和806r(5
’‑
ggactachvgggtwtctaat-3’)对16s rrna基因v3-v4可变区进行pcr扩增，扩增程序如下：95℃预变性3min，27个循环(95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸30s)，然后72℃稳定延伸10min，最后在4℃进行保存(pcr仪：abi9700型)。pcr反应体系为：5
×
transstartfastpfu缓冲液4μl，2.5mm dntps2μl，上游引物(5um)0.8μl，下游引物(5um)0.8μl,transstartfastpfudna聚合酶0.4μl，模板dna 10ng，ddh2o补足至20μl。每个样本3个重复。
50.illumina miseq测序
51.将同一样本的pcr产物混合后使用2％琼脂糖凝胶回收pcr产物，利用axyprep dna gel extraction kit(axygenbiosciences,union city,ca,usa)进行回收产物纯化，2％琼脂糖凝胶电泳检测，并用quantus
tm fluorometer(promega,usa)对回收产物进行检测定量。使用nextflex
tm rapid dna-seq kit(bioo scientific，美国)进行建库:(1)接头链接；(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用pcr扩增进行文库模板的富集；(4)磁珠回收pcr产物得到最终的文库。利用illumina公司的miseq pe300/novaseq pe250平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。原始数据上传至ncbi sra数据库(序列号：srp***)。
52.数据处理
53.使用fastp软件对原始测序序列进行质控，使用flash软件进行拼接：(1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含n碱基的reads；(2)根据pe reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；(3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；(4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
54.使用upars软件，根据97％的相似度对序列进行otu聚类并剔除嵌合体。利用rdp classifier对每条序列进行物种分类注释，比对silva 16s rrna数据库(version138)，设置比对阈值为70％。
55.统计学处理
56.采用spss18 for windows方差分析法软件对数据进行统计分析，所有数据以均数
±
标准差(s)表示，各组间样本均数采用t检验，p＜0.05表示差异有统计学意义。
57.结果与分析
58.对db/db糖尿病模型小鼠血糖的影响
59.在db/db糖尿病小鼠灌胃竹笋生物炭后的1、2、3、4、5、6周时，各组小鼠禁食6h后小
鼠尾静脉测定的血糖结果如表1。
60.表1.竹笋生物炭对db/db糖尿病模型小鼠血糖的影响
[0061][0062]
注：
△△△
表示与正常组比较p《0.001。
[0063]
从表1可见，db/db糖尿病模型小鼠血糖明显高于m/m正常对照组，与m/m正常组比较有显著性差异(p《0.001)。与模型组相比，竹笋生物炭灌胃6周后db/db糖尿病小鼠的血糖总体有下降，但无显著性差异(p＞0.05)。
[0064]
对db/db糖尿病模型小鼠血清指标(gsp、ffa、ins、lep、ages)的影响
[0065]
竹笋生物炭灌胃db/db糖尿病模型小鼠后6周，各组小鼠股动脉中gsp、ffa、ins、lep、ages含量测定结果见表2。
[0066]
表2.竹笋生物炭对db/db糖尿病模型小鼠gsp、ffa、ins、lep、ages的影响
[0067][0068]
注：*、***表示与模型组比较p《0.05、0.001。
△△
、
△△△
表示与正常组比较p《0.01、0.001。
[0069]
从表2可见，与正常对照相比，db/db糖尿病模型小鼠血清中gsp、ffa、lep、ages都有不同程度显著提高，而ins则显著降低，其中ffa达p《0.01显著性差异，gsp、ins、lep、ages达p《0.001显著性差异；与模型组相比，db/db糖尿病模型小鼠灌胃竹笋生物炭后6周后，血清中gsp、ffa、lep、ages都有不同程度降低，其中ages达p《0.01显著性差异。而ins则显著提高，达到p《0.05显著差异。
[0070]
对db/db糖尿病模型小鼠脏器指数的影响
[0071]
脏器指数是药物毒理实验中常用的指标。db/db糖尿病模型小鼠被灌胃竹笋生物炭6周后，先对各组小鼠进行称重，然后处死小鼠并取脾脏、肾脏、肝脏、胸腺及心脏器官，分别称重，计算出的脏器指数结果见表3。
[0072]
表3竹笋生物炭对db/db糖尿病模型小鼠心、肝、肾、胸腺及脾脏脏器指数的影响
[0073][0074]
注：
△△
、
△△△
表示与正常组比较p《0.01、0.001。
[0075]
从表2可见，db/db糖尿病模型小鼠心、肝、肾及脾脏脏器指数与m/m正常对照组有明显差异(p《0.01～0.001)。竹笋生物炭灌胃6周后，对db/db糖尿病模型小鼠心、肝、肾、胸腺及脾脏的脏器指数均无明显影响，与模型组比较无显著性差异(p＞0.05)，说明竹笋生物炭对小鼠没有毒性作用。
[0076]
对db/db糖尿病模型小鼠肾脏抗氧化指标(mda、sod、gsh-px及cat)的影响
[0077]
氧化应激在糖尿病的发展过程中起着重要的作用，各组小鼠股肾脏中mda、sod、gsh-px及cat氧化应激相关指标含量测定结果见表4。
[0078]
表4竹笋生物炭对db/db糖尿病模型小鼠肾脏mda、sod、gsh-px及cat的影响
[0079][0080]
注：*表示与模型组比较p《0.05，
△
表示与正常组比较p《0.05。
[0081]
从表4可见，与m/m正常对照组相比，db/db糖尿病模型血清小鼠肾脏中sod、gsh-px、cat等抗氧化活性都有不同程度降低，而mda却提高，其中cat有明显差异(p《0.05)；与模型组相比，db/db糖尿病模型小鼠灌胃纳米笋炭6周后，肾脏中sod、gsh-px、cat等抗氧化活性都有不同程度提高，而mda却降低，其中sod含量达p《0.05显著性差异。
[0082]
对db/db糖尿病模型小鼠肠道菌群影响
[0083]
otu分布与venn图分析
[0084]
操作分类单元(operational taxonomic unit，otu)是通过一定的距离度量方法获得不同序列两两间的距离(或者相似性)度量，然后在特定的分类单元阈值下对获得距离矩阵进行聚类操作，形成不同的聚类单元。不同的操作分类单元(otu)表示微生物所属种类。在16s rdna高通量分析中引入otu，对相似性高于97％序列归类为一个otu进行聚类，每个otu对应于一个不同的微生物种。venn图可用于统计多个样品中所共有和独有的otu数目，可以比较直观的表现环境样品的otu数目组成相似性及重叠情况。试验各组out数量及venn见图1。从图1所示，正常组、模型组及竹笋生物炭组的otu总数分别为472、514、520个。
三组共有的otu为406个，其中正常组与模型组共有的otu为22个，正常组与竹笋生物炭组组共有的otu为15个，而模型组与竹笋生物炭组组共有的otu高达60个，相比之下模型组与竹笋生物炭组的相似性及重叠性更高。此外，从图1可见，竹笋生物炭组独有的otu为39个，而正常组与模型组独有的otu分别为29与26个。由此表明，db/db糖尿病模型小鼠灌胃竹笋生物炭6周后，小鼠肠道菌群结构发生显著变化。
[0085]
α多样性分析
[0086]
在肠道菌群分析中，α多样性是用来衡量群落内的物种多样性，ace和shannon指数是α多样性分析肠道菌群丰度和多样性重要指标。ace用来估计肠道菌群中含有otu数目的指数，ace指数值越大，肠道菌群生物物种数量越多，即群落丰富度(community richness)越高。试验各组小鼠肠道盲部新鲜内容物中菌群ace指数见图2。从图2可见，与正常组相比，模型组小鼠的ace指数升高，群落丰富度提高，达p《0.01显著性差异。而db/db糖尿病模型小鼠灌胃竹笋生物炭6周后，ace指数接近正常组，与模型组相比，达p《0.05显著性差异。由此表明，灌胃竹笋生物炭6周后，可使db/db糖尿病模型小鼠肠道微生物群丰富度接近于m/m小鼠正常状态。
[0087]
shannon表示肠道菌群多样性(community diversity)、均匀度(evennes)指数，shannon值越大，群落的多样性越高。各组小鼠肠道盲部新鲜内容物中菌群shannon指数见图3。从图3可见，与正常组相比，模型组小鼠的shannon指数升高，群落多样性提高，但没有显著性差异。而db/db糖尿病模型小鼠灌胃竹笋生物炭6周后，shannon指数低于正常组，肠道微生物群多样性降低，与模型组相比，p《0.05显著性差异。
[0088]
β多样性分析
[0089]
在肠道菌群分析中，β多样性是衡量群落间微生物组成相似性的一个指标。β多样性分析通常由计算环境样本间的距离矩阵开始，对群落数据结构进行自然分解，并通过对样本进行排序(ordination)，从而观测样本之间的差异。bray curtis距离基于物种的丰度信息计算，是生态学上反应群落之间差异性常用的指标之一。基于bray curtis距离常用的nmds多样性分析结果如图4，不同颜色形状的点代表试验不同组的样本，如样本的物种组成越相似，它们在nmds图中的距离越接近。如图4所示，模型组菌群和正常组间有一定距离，存在明显差异。db/db糖尿病模型小鼠灌胃竹笋生物炭6周后，多数样本与模型组和正常组的菌群间距离都较远，存在显著性差异。由此表明，灌胃竹笋生物炭6周后，可使db/db糖尿病模型小鼠肠道菌群发生显著改变。此外，stress是反映nmds分析结果优劣的指标，通常认为stress《0.2时，其图形有一定的解释意义；当stress《0.1时，可认为是一个好的排序；当stress《0.05时，则具有很好的代表性。本试验stress为0.111，nmds分析结果还是比较良好的。
[0090]
对菌群结构影响
[0091]
phylum水平物种相对丰度
[0092]
从表5和图5可知，在phylum水平物种相对丰度上，m/m小鼠和db/db糖尿病模型小鼠盲肠内容物中主要优势菌门有拟杆菌门bacteroidota、厚壁菌门firmicutes、脱硫菌门desulfobacterota、放线菌门actinobacterota、髌骨细菌门patescibacteria、变形菌门proteobacteria及弯曲杆菌门campilobacterota，试验各组上述优势菌门相对丰度总和均在99.9％以上。与正常m/m小鼠相比，db/db糖尿病模型小鼠肠道菌群中firmicutes、
patescibacteria、proteobacteria相对丰度有显著提高，bacteroidota、desulfobacterota、actinobacterota相对丰度有显著降低。此外，从表5可见，灌胃竹笋生物炭6周后，db/db糖尿病模型小鼠肠道菌群结构中产生有益菌的firmicutes、actinobacterota相对丰度显著提高，并且高于正常组，与模型组相比达p《0.05显著性差异；而产生有害菌的proteobacteria、campilobacterota的相对丰度则显著降低，与模型组相比分别达p《0.05和p《0.01显著性差异。
[0093]
表5竹笋生物炭对db/db糖尿病模型小鼠肠道菌群结构门水平影响
[0094]
注：*、**表示与模型组比较p《0.05、0.01；
△
、
△△
表示与正常组比较p《0.05、0.01。
[0095][0096]
genus水平物种相对丰度影响
[0097]
如表6和图6所示，在属(genus)水平上，m/m小鼠和db/db糖尿病模型小鼠盲肠内容物中相对丰度达1％以上的主要优势菌属有未确定的鼠杆菌科norank_f_muribaculaceae、乳杆菌属lactobacillus、脱硫弧菌属desulfovibrio、竹螺菌属lachnospiraceae_nk4a136_group、unclassified_f_lachnospiraceae、norank_f_lachnospiraceae、另枝菌属alistipes、拟杆菌属bacteroides、肠杆菌属enterorhabdus、臭味菌属odoribacter、坎迪塔斯萨科瑞莫纳斯candidatus saccharimonas、双歧杆菌属bifidobacterium、罗姆布茨菌属romboutsia、苏黎世杆菌属turicibacter等多个菌属。与正常m/m小鼠相比，db/db糖尿病模型小鼠盲肠内容物中除turicibacter有益菌属增加外外，lactobacillus、odoribacter、bifidobacterium等有益菌属显著降低。灌胃竹笋生物炭6周后，db/db糖尿病模型小鼠肠道菌群中lactobacillus、desulfovibrio、lachnospiraceae_nk4a136_group、odoribacter、bifidobacteriu、turicibacter等有益菌属相对丰度总和为50.486％，与模型组26.431％、正常组29.867相比，有显著增加，其中bifidobacteriu、turicibacter与模型组相比达到p《0.01显著性差异。
[0098]
表6竹笋生物炭对db/db糖尿病模型小鼠肠道菌群结构属水平影响
[0099][0100]
注：
△
.
△△
.
△△△
.分别表示与正常组比较p《0.05、0.01、001；*、**表示与模型组比较p《0.05、0.01。
[0101]
讨论与结论
[0102]
2型糖尿病(t2dm)是以胰岛素抵抗和慢性低水平炎症为特征的代谢性疾病，肠道菌群失调可能是t2dm的危险因素。人体从胃到大肠的消化道的各个区段，由于各段特征及功能的差异不一样，菌群构成也不尽相同。盲-升结肠区段，由于具有弱酸性、运动力低、多糖发酵剧烈等特点，致使细菌繁殖迅速，菌群丰富度与多样性最高。db/db小鼠是leptin受体基因缺陷导致的先天性2型糖尿病小鼠，早期4周龄即出现高血糖、高血脂、ir等糖尿病症状显著特征，其发病过程与人的2型糖尿病非常相似。从大量发表的研究结果来看，与正常m/m小鼠相比，db/db糖尿病模型小鼠肠道菌群发生显著变化。但是，不同周龄db/db糖尿病模型小鼠及采用db/db糖尿病模型肠道内不同材料所测定的菌群结构也不尽一样。本试验将8周龄spf级雄性db/db糖尿病小鼠(35-40g)适应性喂养3天，待血糖稳定且大于16.7mmol/l为模型小鼠，将达到模型标准的db/db小鼠随机分为药物组和模型对照组，同时以同窝同龄野生雄性m/m小鼠(20-24g)为正常组。模型对照组和正常对照组给予灌胃10.0ml/kg饮用水，药物组给予灌胃1.0g/kg竹笋生物炭，每组灌胃1次/d。在db/db糖尿病小鼠灌胃竹笋生物炭后的6周时，先处死小鼠，然后收集各组回盲部新鲜内容物进行肠道菌群分析。结果表明，14周龄多的正常组m/m小鼠盲部内容物中门水平丰度较高菌群主要为bacteroidota、firmicutes、desulfobacterota、actinobacterota、patescibacteria、proteobacteria campilobacterota、cyanobacteria、deferribacterota及unclassified_k__norank_d__bacteria。db/db糖尿病模型小鼠与药物组bacteroidota减少firmicutes增加。bacteroidota和firmicutes变化趋势与王子宜和何文娇等分别对16周龄和30龄的正常组m/m小鼠、模型组与药物组db/db糖尿病模型小鼠粪便中测定结果一致，但与张立雯对17周龄测定结果则相反。除bacteroidota、firmicutes之外，本试验检测到的其他门类，在正
常组m/m小鼠、模型组与药物组db/db糖尿病模型小鼠粪便中都没有检测到；在属水平，本试验在小鼠盲肠内容物中检测到的主要优势菌属主要有norank_f_muribaculaceae、lactobacillus、desulfovibrio、lachnospiraceae_nk4a136_group、unclassified_f_lachnospiraceae、norank_f_lachnospiraceae、alistipes、bacteroides、enterorhabdus、odoribacter、candidatus saccharimonas、bifidobacterium、romboutsia、turicibacter等菌属，与王子宜、何文娇、张立雯等在粪便中检测到的uncultured_bacterium_f_muribaculaceae、lactobacillus、akkermansia、uncultured_bacterium_f_lachnospiraceae、alistipes、bacteroides、lachnospiraceae_nk4a136_group、rikenellaceae_rc9_gut_group、helicobacter、ruminococcaceae_ucg_014、alloprevotella、prevotellaceae_ucg-001等优势菌群菌属相比，盲肠内容物中具有较高丰度的bifidobacterium、odoribacter、turicibacter等有益菌。由此表明，m/m、db/db糖尿病模型小鼠肠道中，盲部和粪便中不仅在门水平还是在属水平上，肠道菌群结构存在着较大差异。
[0103]
2型糖尿病患者普遍出现肠道微生物菌群失调的情况，即肠道内的益生菌比例降低，而致病菌含量明显提高。肠道菌群中有害菌比例增加，作为其细胞壁成分之一的脂多糖(lps)也随之增多。异常增多的脂多糖穿过肠黏膜上皮后进入血液循环，先后分别脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，lbp)、膜表面的蛋白质cd14结合、toll样受体4(toll-like receptor，tlr4)、髓样分化蛋白2(myeloid differentiation protein-2，md2)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，myd88)、白细胞介素-1受体相关激酶(il-1receptor associated kinase，irak)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tnfr-associated factor 6，traf6)相结合，进一步与nf-κb的抑制蛋白iκb磷酸化和泛素化，从而激活nf-κb通路，释放白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子-α(tnf-a)等炎症因子，炎症因子通过抑制胰岛素信号通路磷脂酰肌醇3激酶(pi3k)和c-jun氨基末端激酶(c-jun n-terminal kinase，jnk)发生胰岛素抵抗。乳杆菌、双歧杆菌是人体肠道菌群中最重要的益生菌，通过发酵多种糖类产生有机酸(乳酸和醋酸等)，不仅可以使肠道ph值下降，抑制致病菌的生长或定植，减少lps，而且能产生抗生素，抑制促炎因子的释放，减轻炎症反应，对维护人体的健康具有重要意义。据本试验研究表明，db/db糖尿病模型小鼠灌胃竹笋生物炭后的6周后，与模型组相比，肠道中lactobacillus、bifidobacterium等有益菌属相对丰度显著提高，并且高于正常组小鼠。此外，db/db糖尿病模型小鼠灌胃竹笋生物炭后的6周后，血清中胰岛素含量也大幅度提高，与模型组相比达到p《0.05显著性差异。生物炭具有极其丰富的大孔隙及较大表面积，对毒素有较强的吸附能力。临床研究表明，口服以竹等制成的药用生物炭片对治疗农药与食物药物中毒具有显著治疗效果。因此，db/db糖尿病模型小鼠灌胃竹笋生物炭后，是否能吸附致病菌分泌的内毒素脂多糖及进入肠道食物中相关有毒成分，创造有利于有益菌的生长环境，从而调控胰岛素抵抗的信号通路，其生理代谢分子机制有待进一步研究。
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大量的研究已表明，胰岛素抵抗状态下氧化应激水平增加，机体抗氧化能力下降。氧化应激不仅参与了2型糖尿病胰岛素抵抗的发病过程，也是糖尿病肾脏疾病(diabetic kidneydisease，dkd)等糖尿病晚期并发症的发病机制。在糖尿病临床研究中发现，清除体内过多的自由基，提高机体的抗氧化能力可有效改善糖尿病症状。此外，过量的糖和蛋白质
结合形成晚期糖基化终末产物(advanced glycation endproducts，ages)，在糖尿病肾病的发展进程中发挥着重要的作用。本试验验结果表明：db/db糖尿病模型小鼠灌胃竹笋生物炭后，肾脏中sod、gsh-px、cat等抗氧化活性都有不同程度提高，其中sod含量达p《0.05显著性差异。血清中ages显著降低，与模型组相比达p《0.01显著性差异。竹笋生物炭显著提高机体抗氧化应激活性，有利于阻抑糖尿病晚期并发症的形成。
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综上所述，db/db糖尿病模型小鼠灌胃竹笋生物炭后，益生菌比例大幅度提高，致病菌比例则明显减少，肠道微生物菌群结构发生了显著改变，同时，血清中胰岛素得到显著增加、ages显著降低，肾脏中sod、gsh-px等抗氧化活性指标也都有不同程度提高，对改善db/db糖尿病小鼠症状呈现出显著效果。